专利名称：：不含有病毒编码序列的高效逆病毒载体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及改良的用于基因治疗的逆病毒载体。特别是，本发明涉及安全的和有效的逆病毒表达载体，其中，所有的逆病毒基因，即，gag，env和pol，被完全缺失；其中一种异源性内含子，剪切受体，和/或非编码序列被插入外源基因克隆位点的上游位置；其中一种异源性内部启动子或一种内部核糖体进入位点(下文称作“IRES”)被插入在该克隆位点的下游位置；并且其中5’LTR(长末端重复)的全长U3序列或者一种强的异源性启动子控制外源基因的表达。背景逆病毒载体与其它任何一种载体相比更经常被用于基因治疗，被用于世界范围内已批准的50％以上的临床方案中(Wiley-基因医学网络位点杂志；http//www.wiley.co.uk/genetherapy)。虽然主要使用基于鼠白血病病毒(下文称作“MLV”)的载体，但在临床应用中逆病毒载体仍存在许多问题。最严重的问题是它们的安全性；逆病毒载体是一种病毒载体，因而可在细胞中转化成可复制的逆病毒(下文称作“RCR”)。总之，通过同源重组导致的RCR产生是一个最令人们关心的问题。所有的可使用的逆病毒载体含有相当长的病毒编码序列。由于这些序列也存在于包装载体被释放的包装细胞的基因组中，人们设想在包装基因组和载体的相同的核苷酸序列之间可能发生同源重组，导致RCR的产生。参见Miller等，人类基因治疗，15，1990。两种类型的基于MLV的逆病毒载体，LN系列载体和MFG载体，经常被用于基因治疗(Miller和Roseman，生物技术，7980-990，1989；Dranoff等，美国科学院院刊903539-3543，1993)。在LN系列载体中外源基因的表达是由外源性内部启动子或由LTR控制的，而MFG载体中的转录水平是在LTR的控制下的，并且外源基因是以基因组RNA或剪切的亚基因组RNA的形式表达的。LN系列载体通常被认为是第一代的逆病毒载体，它含有420bp的gag编码序列。虽然该区域被认为在病毒包装中起着重要的作用，已有报道显示gag区域可被缺失而没有显著影响病毒的包装和在某些条件下的滴度(Kim等，病毒学杂志，71994-1004，1998)。与LN系列载体相比，已知MFG载体以更为稳定的方式和较高的水平驱动基因的表达，并且在大多数来源于人类或小鼠的细胞中产生较高的病毒滴度(Byun等，基因治疗，3780-788，1996)。但是，MFG载体含有更多的病毒表达的序列，420bp的gag，377bp的pol，和99bp的env，与LN系列的载体相比提高了产生RCR的可能性。为克服这些与常规的逆病毒载体相关的缺点，本发明的发明人构建了一种逆病毒载体(韩国专利申请97-48095)，它具有如下几个特点●被克隆的基因的转录物被有效地剪切，产生较高的基因表达水平，●gag和env序列被完全缺失而没有影响病毒滴度，●IRES被用于在载体中同时表达两个或多个基因，●在载体中插入多克隆位点，以便于外源基因的表达由于gag和env序列从逆病毒载体中缺失，相对于其它载体来说该载体的安全性提高。但是，这一载体仍含有包含剪切受体序列的377bppol编码序列以及含有284bp的env的引导(转录但不转译)序列的它的下游序列，因为，pol序列的缺失导致不正常的和不充分的剪切。由于377bp的pol序列也存在与包装系的基因组中，在载体中仍存在导致RCR产生的同源重组的可能性。为了开发新型的具有较高的基因表达效率和较高的安全性的逆病毒载体，我们曾经构建了不含有任何病毒编码序列的逆病毒载体。本发明是通过构建逆病毒载体进行的，其中MLV衍生的pol基因被完全缺失，排除了在包装细胞系中通过同源重组产生RCR的可能性；其中异源性内含子，剪切受体，和/或非编码序列被插入在外源基因克隆位点的上游；使基因表达的效率最大化；其中使用5’LTR或人类巨细胞病毒(下文称作“HCMV”)主要立即早期启动子(MEIPiel基因的启动子)作为外源基因表达的调节的顺式元件；并且其中异源性内部启动子或者IRES被插入在克隆位点的下游位置，以允许同时表达两个或多个外源基因。发明详细描述本发明的一个目的是提供一种安全的逆病毒，其中，外源基因被高水平地表达并因而可被用于基因治疗。按照本发明，上述目的可容易地达到。本发明提供了基于MLV的逆病毒载体，其中，MLV-编码的gag，env和pol序列被完全缺失。在一个方面，本发明的基于MLV的逆病毒载体可含有异源性内含子和/或异源性剪切受体，它们被插入在外源基因的克隆位点的上游。在另一方面，本发明的基于MLV的逆病毒载体可含有一种被插入在外源基因克隆位点的上游位置的异源性非编码序列。在另一方面，MLV5’LTR的全长U3序列(-419至-1bp)可用本发明的基于MLV的逆病毒载体的异源性启动子替换。在又一方面，本发明的基于MLV的逆病毒载体可在外源基因的克隆位点的下游含有一种异源性启动子。本发明也提供了用本发明的基于MLV的逆病毒载体转化的大肠杆菌菌株。本发明的其它一些特点见于下文。附图简要说明图1表示从MON载体切除pol编码区域构建ΔSA载体，然后将CAT基因插入ΔSA载体产生ΔSA-CAT载体的过程，图2表示含有HCMViel(UL123)基因的内含子和/或外显子的逆病毒载体的结构，图3a表示其中SV40最小启动子-neo盒被IRES-neo盒替换得到MSN载体，然后通过将含有SV40最小启动子和MLV3’LTR插入pUC18构建SN-3LTR载体的过程，图3b表示其中含有HCMV主要立即早期启动子的嵌合LTR被插入SN-3LTR载体的过程，图4a表示其中含有HCMViel(UL123)基因的外显子1，内含子A和部分外显子2的DNA片段插入pCM载体构建DON1.2载体，然后将细菌CAT基因插入DON1.2产生DON1.2-CAT的过程，图4b表示其中含有HCMViel(UL123)基因的部分内含子A和部分外显子2的DNA片段插入pCM载体构建DON2载体，然后将细菌CAT基因插入DON2产生DON2-CAT的过程，图4c表示其中含有鼠免疫球蛋白基因的剪切受体和HCMViel(UL123)基因的外显子1插入pCM载体构建DONSA1载体，然后将细菌CAT基因插入DONSA1产生DONSA1-CAT的过程，图5表示含有人类基因的内含子和外显子的逆病毒载体的结构，图6表示其中含有MLV5’和3’LTR的DNA片段的制备并被插入pUC18产生p53LTR载体，然后通过将从pCBIN分离出的IRES-neo盒插入p53LTR构建MIN载体的过程，图7a表示MIN-AI的构建过程，其中，制备含有人类β-肌动蛋白基因的基因组PCR产物，然后将含有人类β-肌动蛋白的部分内含子1，剪切受体和部分外显子2插入MIN载体。图7b表示MIN-EI的构建过程，其中，制备含有人类EF1α基因的基因组PCR产物，然后将含有人类EF1α的部分内含子1，剪切受体和部分外显子2插入MIN载体。图7c表示MIN-GI的构建过程，其中，通过基因组PCR制备含有人类GAPDH基因的部分内含子1，剪切受体和部分外显子2的DNA片段，然后插入MIN载体。图7d表示MIN-2的构建过程，其中，将含有HCMViel(UL123)基因的部分内含子A，剪切受体和部分外显子2的DNA片段插入MIN载体。优选实施方案详细描述本发明提供了衍生于基于MLV的载体，特别是MON或MIN的安全和高效的逆病毒载体。在本发明的载体中，逆病毒基因(gag，env和pol编码序列)被完全缺失；一种异源性内含子，剪切受体，和/或非编码序列被插入在外源基因克隆位点的上游位置；一种强的异源性启动子被包含在5’LTR中；并且，一种异源性启动子或一种IRES位于克隆位点的下游位置。特别是，在本发明的载体中，由于含有一种剪切受体的pol编码序列被完全缺失，可以排除同源重组的可能性，而同源重组是常规的逆病毒载体的一个缺点。切除pol序列导致基因表达水平的降低。为了恢复降低了的表达效率和病毒滴度，本发明提供了各种不同的逆病毒载体，如下所示●本发明提供了逆病毒载体，其中，一种异源性内含子和/或剪切受体被插入在外源基因克隆位点的上游位置，以弥补缺失的与pol编码序列的3’部分交迭的剪切受体。所有的已知的病毒或细胞基因的内含子和/或剪切受体均可用于这一目的，优选HCMViel(UL123)基因、延长因子1α(下文称作“EF1α”)基因、甘油醛3-磷酸脱氢酶(下文称作“GAPDH”)基因、β-肌动蛋白基因等的内含子或/或剪切受体。●本发明也提供了逆病毒载体，其中一种异源性非编码序列被插入在克隆位点的上游位置。该非编码序列被用于提高转录效率，并被定义为一种不翻译成蛋白质的转录DNA序列，包括内含子和不翻译的外显子。优选该非编码序列选自HCMViel(UL123)基因、EF1α基因、GAPDH基因、和β-肌动蛋白基因的非编码序列。异源性非编码序列的插入使得外源基因转录物可有效剪切，并且亚基因组RNA可有效转译。●此外，本发明提供了逆病毒载体，其中，一种异源性内部启动子或IRES被包含在克隆位点的下游位置。●最后，本发明提供了逆病毒载体，其中，含有一种5’LTR的全长U3序列或者一种强的异源性启动子。下文将详细描述本发明。1.Pol编码序列的切除ΔSA构建为了开发具有改良的安全性的逆病毒载体，即不具有同源重组活性的逆病毒载体，从MON载体(韩国专利申请97-48095)切除包括剪切受体的pol编码序列，构建一种缺失突变载体，ΔSA。此外，通过插入细菌CAT(；氯霉素乙酰转移酶)作为报道基因构建ΔSA-CAT载体(见图1)。然后，制备用ΔSA-CAT转染或转导的细胞系并进行CAT检测。CAT检测显示缺失突变体的病毒滴度与父本载体MON-CAT的病毒滴度相当，但基因表达降低(见表1)。这些结果提示含有剪切受体的pol基因参与了载体中外源基因表达的调节。从这一结果可以预期，如果异源剪切受体和/或内含子被插入在外源基因的克隆位点的上游，从而与pol基因共同缺失的剪切位点互补，则外源基因的表达水平将被提高。但是，如果剪切发生太多，亚基因组RNA与亚基因组DNA的比率将被提高，导致病毒滴度的降低，即使具有高的基因表达水平。为了构建理想的逆病毒载体，载体的设计应使转录，剪切和转移率在转染或转导细胞系中平衡。也就是说，优选的载体中外源基因被大量转录，并且基因组RNA的量与亚基因组RNA的量平衡，从而产生足够量的基因组RNA被包装进病毒颗粒，并且被大量翻译成由外源基因编码的蛋白质。本发明提供了逆病毒载体，其中各种来源于病毒或细胞基因的非编码序列被插入缺失突变载体中，然后检测这一插入是否对病毒滴度和基因表达水平具有效果。2.异源DNA序列的插入增强剪切和翻译效率DON1.2，DON2和DONSA1构建体。为了使剪切率和基因表达率保持平衡以及提高病毒RNA的总产率，构建了逆病毒载体，其中，MLV5’LTR的U3区域被一种强启动子，HCMV立即早期启动子，替换，并且其中插入了异源性非编码序列。在一个优选的实施方案中，HCMViel(UL123)基因的非翻译性外显子和/或内含子被用作异源性非编码序列，它被插入在载体的克隆位点的上游位置(见图2)。已知HCMViel(UL123)基因的外显子和/或内含子序列当被插入在表达载体中时提高翻译效率。特别是，pCM载体的制备如下将所有的逆病毒编码序列切除；将全长的5’LTR的U3序列用HCMV主要立即早期启动子替换，保留MLV来源的3’LTR；并将SV40启动子-neo盒用作异源性内部启动子。然后，通过将HCMViel(UL123)基因的外显子1，内含子A，和/或外显子2插入pCM载体(见图3a，图3b，和图4a至4b)制备DON1.2，DON2和DONSA1载体。然后通过CAT报道基因的插入制备DON1.2-CAT，DON2-CAT，DON2-CAT，和DONSA1-CAT载体。将用这些载体转染或转导的细胞系进行CAT检测。CAT检测的结果证实了所有三个载体比对照载体L-CAT-SN显示出较高的剪切和基因表达效率(见表2)。2.可启动剪切和基因表达的细胞DNA序列的插入MIN-AI，MIN-EI，和MIN-GI构建体在另一个优选的实施方案中，对逆病毒载体进行进一步设计，使剪切率和基因表达率的平衡导致病毒滴度和基因表达的效率提高。在这些载体中，将人类基因的外显子和/或内含子序列插入逆病毒载体中外源基因克隆位点的上游位置(见图5)。为构建这些载体，制备出MIN载体，其中，所有的逆病毒编码区域被切除；保留MLV来源的5’和3’LTR；并将EMCVIRES-neo盒用作异源性内部启动子。具体地说，MIN载体是通过以下步骤制备的扩增含有MLV5’和3’LTR的DNA片段，将该片段插入pUC18载体，将IRES-neo盒插入该重组载体(见图6)。将一个含有人类β-肌动蛋白的部分内含子和部分外显子2，EF1α，或GAPDH基因插入MIN载体的克隆位点的上游位置，分别构建MIN-AI，MIN-EI，或MIN-GI载体(见图7a至7c)。为了比较使用细胞基因作为剪切受体的载体(如MIN-AI等)与使用病毒基因的载体(如DON1.2等)进行比较，构建了另一个基于MLV的载体MIN-2。具体地说，将含有HCMViel(UL123)基因的部分内含子A和部分外显子2的DNA序列插入MIN载体(见图7d)。这一插入与DON2载体的相同。然后，通过在相应的载体中插入CAT报道基因制备MIN-CAT，MIN-AICAT，MIN-EICAT，MIN-GICAT和MIN-2CAT载体。将用这些载体转染或转导的细胞系进行CAT检测。CAT检测的结果显示本发明的所有载体的病毒滴度与对照载体LXSN和MFG的相似，而用MIN-2和MIN-EI转染或转导的细胞系的基因表达水平比含有对照载体的细胞细高(见表3)。实施例下文实施例说明了本发明的优选的实施方案。但是，应当理解，本领域的普通技术人员在本文公开的基础上可对本发明进行修正，而不脱离本发明精神和范围。实施例1从MON载体中切除pol基因(1-1)ΔSA构建为了制备缺乏pol编码序列的5’LTR下游序列，进行PCR反应，其中MON载体(韩国专利申请97-48095)被用作模板，两个被描述于SEQIDNO1(HHIR引物)和NO2(R523Bam引物)的单链合成寡核苷酸被用作引物。被扩增的DNA片段相应于从MLV5’LTR至+523bp的核苷酸序列(见图1)。在这种情况下，+1表示MLV基因组的转录起始位点，从+212至+523bp的序列是包装基因组RNA所需要的非编码序列。将该PCR产物亚克隆进pCRII(Invitrogen，CA，USA)，然后从得到的载体中制备HindIII-BamHI片段。将MON载体的部分HindIII-BamHI片段用PCR产物的HindIII-BamHI片段替换，构建ΔSA载体。将该ΔSA载体用作逆病毒载体的基本骨架，它含有MLV5’和3’LTR，和含有剪切受体的5’非编码序列，IRES-neo盒和聚嘌呤片段，其中全部的逆病毒编码序列被缺失(见图1)。(1-2)ΔSA-CAT构建体为了研究上述基因操作对外源基因表达和逆病毒基因组RNA包装的影响，将一种细菌CAT基因用作报道基因。通过PCR得到CAT基因，其中，pCAT3-基础载体(Promega，WI，USA)被用作模板，两个被描述于SEQIDNO3(CATATGN引物)和NO4(CATSTOP引物)的合成寡核苷酸被用作引物。将PCR产物插入pCRII(Invitrogen，CA，USA)，并将得到的载体的BamHI片段，含有CAT基因，导入pC3.1(Invitrogen，CA，USA)制备pC3.1-CAT。通过将CAT基因(Klenow处理的pC3.1-CAT的XbaI-HindIII片段)插入ΔSA载体的HpaI位点构建ΔSA-CAT载体(见图1).(1-3)CAT检测用ΔSA-CAT和对照载体(MON-CAT)，与Gag-Pol和Env包装载体一起转染293T细胞(DuBridge等，分子细胞生物学，7379-387，1987)。在将转染细胞培养48小时后，抽提胞浆蛋白质，测定CAT活性，这是一种外源基因表达水平的标志。同时，通过用0.45μm滤膜过滤培养基得到的无细胞病毒上清液被用于转导NIH3T3细胞(ATCCCRL1658)。使用转导48小时后的蛋白质提取物确定CAT活性的水平。CAT检测使胺以下步骤进行的首先，收获细胞，并用1ml的PBS(磷酸缓冲液)洗涤，然后悬浮在0.25M的Tris缓冲液(pH7.5)中。通过重复冷冻(在干冰中)-解冻(在37℃水浴中)循环6次裂解细胞。在将得到的细胞提取物在60℃加热7分钟使脱酰基酶失活后，在12000rpm离心10分钟，吸取上清液。按照Bradford‘s方法对提取物中的蛋白质水平进行定量。将归一化的提取物与1μl的14C-氯霉素(60mCi/mmole，0.1mCi/ml)，2μl的乙酰辅酶A(40mM)，和适当体积的0.25MTris(pH7.5)混合。将该反应混合物在37℃温浴适当的时间。在反应之后，用乙酸乙酯抽提氯霉素，并在减压下浓缩。将小团重新悬浮在15μl的乙酸乙酯中并加样到薄层层析(TLC)板上。在使用TLC显影溶剂(95％氯仿，5％甲醇)进行TLC后，将TLC板干燥，然后用X-射线胶板上曝光，或用磷图像分析仪(phosphoimageanalyzer)处理，从而使氯霉素的乙酰化水平可以被测定。样品中CAT活性可从乙酰化的氯霉素的放射活性与总的氯霉素的放射活性的比率来计算。表1显示用缺乏pol基因的ΔSA-CAT转染的293T细胞系中的CAT活性低于用MON-CAT转染的对照细胞系中的活性。这表明pol编码序列参与了基因表达的调节。此外，在转导细胞系中的CAT活性显示出与转染细胞系中的相同的类型，暗示包装效率与基因表达效率相关。表1，pol缺失对基因表达水平的影响实施例2HCMViel(UL123)基因的启动子和外显子和/或内含子的插入为了保持剪切率和翻译率的平衡，以及提高病毒RNA的总产量，构建了含有以下三个载体的来源于MON逆病毒的载体●DON1.2载体，其中MLV5’LTR的全长U3序列被HCMV主要立即早期启动子替换；并且，MLV剪切受体被含有HCMViel(UL123)基因的外显子1，内含子A和部分外显子2(刚好终止于起始密码子的前面)的DNA片段替换，●DON2载体，其中，MLV5‘LTR的全长U3序列被HCMV主要立即早期启动子替换；并且MLV剪切受体被含有HCMViel(UL123)基因的部分内含子A和部分外显子2的DNA片段替换，和●DONSA1载体，其中，MLV5‘LTR的全长U3序列被HCMV主要立即早期启动子替换；并且MLV剪切受体被含有小鼠的免疫球蛋白基因的剪切受体和HCMViel(UL123)基因的外显子1的DNA片段替换构建这些载体的详细方法描述于下(见图3a，图3b，和图4a至4c)。(2-1)SN-3LTR构建在三个突变载体中，SV40启动子-neo盒被插入在外源基因克隆位点的下游位置(见图2)。为构建这些突变载体，以下述方式制备含有SV40启动子-neo盒的载体(见图3a盒3b)。为制备其中neo基因是在SV40启动子控制下表达的载体，通过PCR制备SV40启动子-neo盒。在PCR中，pC3.1(Invitrogen，CA，USA)被用作模板，两个被描述于SEQIDNO5(SV40-5引物)和NO6(Neo-3引物)的合成寡核苷酸被用作PCR引物。在SV40启动子-neo盒被亚克隆进pCRII(Invitrogen，CA，USA)后，将得到的载体的BamHI-XhoI片段插入MON的BamHI/XhoI位点。将得到的载体MSN用BamHI和EcoRI限制酶消化并将含有SV40启动子-neo盒和3’LTR的BamHI-EcoRI片段与pUC18的BamHI-EcoRI片段连接，从而构建SN-3LTR载体(见图3a)。(2-2)pCM构建为制备其中5’LTR被一种强的异源启动子替换的逆病毒载体，进行PCR。被用作PCR模板的是含有嵌合LTR的逆病毒载体MCC-CAT(韩国专利申请NO97-48095)，其中，MLV5’LTR的全长U3序列(-419至-1bp)被全长HCMV主要立即早期启动子替换。PCR引物是两个合成的寡核苷酸，描述于SEQIDNO1(HHIR引物)和NO2(r523Bam引物)。PCR产物含有从嵌合5’LTR至+523bp的DNA序列并被亚克隆进pCRII(Invitrogen，CA，USA)。将亚克隆序列的HindIII-BamHI片段插入SN-3LTR载体(在实施例2-1中得到的)的HindIII-BamHI位点，制备pCM载体(见图3b)。在pCM中，所有的逆病毒编码序列被切除，如实施例1-1中的ΔSA载体，而ΔSA载体的5’LTR和IRES-neo盒分别被嵌合LTR和SV40启动子-neo盒替换。PCM载体被用作DON1.2，DON2和DONSA1载体的起始材料，如实施例2-3至2-5所示。(2-3)DON1.2和DON1.2-CAT构建体为了得到含有HCMViel(UL123)基因的外显子1，内含子A和外显子2(至起始密码子)，进行PCR。PCR中的模板是含有从HCMV主要立即早期启动子到外显子5的pEQ276载体(Biegalke等，病毒学，183381-385，1991)。两个PCR引物分别描述于SEQIDNO7(RI5引物，与外显子1杂交)和SEQIDNO8(CMV外显子2.3引物，与外显子2杂交)。PCR扩增了1-kb的DNA片段，并含有HCMViel(UL123)基因的外显子1，内含子A和部分外显子2(至起始密码子)。将该PCR产物插入pZero平头载体(Invitrogen，CA，USA)，制备pZero1.2载体。然后，将pZero1.2的EcoRI片段用Klenow酶处理，使其成为平端。将实施例2-2得到的pCM载体用BamHI酶消化，并用Klenow酶处理。将两个平端DNA片段与构建的DON1.2载体连接。此外，通过将CAT基因插入Klenow处理的DON1.2的HindIII片段构建DON1.2-CAT载体。(2-4)DON2和DON2-CAT的构建制备实施例2-3的pZero1.2的HpaI-EcoRI片段，它含有内含子A的112-bp3’区域和外显子2的5’区域(从+837至+964，刚好在起始密码子的前面)。然后，将该DNA片段用Klenow酶处理得到平端。另一方面，将实施例2-2得到的pCM载体用BamHI酶消化，并用Klenow酶处理。将上述两个具有平端的DNA片段连接构建DON2载体。此外，DON2-CAT载体的构建是通过将CAT基因插入Klenow处理的DON2的HindIII片段进行的(见图4b)。(2-5)DONSA1和DONSA1-CAT的构建为了制备小鼠免疫球蛋白基因的剪切受体，合成一种单链寡核苷酸，分别描述于SEQIDNO9(SA顶寡聚物)和NO10(SA底寡聚物)。两个寡聚物的退火反应产生具有粘性末端的剪切受体片段。PGEM4-SA载体是通过将该片段插入pGEM4载体的BamHI位点制备的(Promega，WI，USA)(见图4c)。为了扩增HCMViel(UL123)基因的外显子1，进行PCR反应，其中，使用实施例2-3的pEQ276载体作为模板，两个描述于SEQIDNO7(RI5引物)和SEQIDNO11(外显子13引物)作为引物。将扩增的外显子1片段亚克隆进pZero-平端载体(Invitrogen，CA，USA)的EcoRI位点，产生pZero-外显子1载体。然后，将pZero-外显子1的EcoRI片段亚克隆进pGEM4-SA的EcoRI位点制备pGEM-SA-外显子1载体。将pGEM4-SA-外显子1的XbaI-BamHI片段用Klenow处理得到平端，然后与Klenow处理的pCM(实施例2-2中制备)的BamHI片段连接，构建DONSA1载体。此外，通过将CAT基因插入DONSA1的HpaI位点构建DONSA1-CAT载体(见图4c)。(2-6)CAT检测将DON1.2-CAT，DON2-CAT，DONSA1-CAT，和L-CAT-SN载体转染包装细胞系FlyA13(Cosset等，病毒学杂志，697430-7436，1995)。在将转染的细胞系培养48小时后，制备无细胞病毒上清液，转导NIH3T3细胞系。将转导的细胞系培养48小时。按照实施例1-3中的方法检测转染的或转导的细胞系中的CAT活性，从而分析相对的基因表达水平。如表2所示，在用DON1.2-CAT或DON2-CAT转染的FlyA13细胞系中观察到了比对照细胞系(用L-CAT-SN转染)显著高的CAT活性水平。此外，稳定地被DON1.2-CAT或DON2-CAT载体转导的NIH3T3细胞比对照细胞显示出5-至10-倍高的CAT活性。在用DONSA1-CAT转染或转导的细胞系的情况下，观察到比对照稍微高一点的CAT活性。这些结果提示，如果参与剪切的异源性非编码序列被插入到表达载体中外源基因的上游位置，剪切效率和基因表达效率可被提高。用DON2和DONSA1载体转化的大肠杆菌菌株分别被命名为TOP10-DON2和Top10-DONSA1。它们在1998年6月5日被保藏在韩国微生物培养中心(KoreanCultureCenterofMicroorganism)(保藏号分别为KCCM-10128，KCCM-10127)。表2异源序列插入对基因表达水平的影响</tables>实施例3人类基因的内含子和/或外显子的插入在这一实施例中，构建了MIN-衍生的逆病毒载体，MIN-AI，MIN-EI，MIN-GEI和MIN-2，从而使外源基因的转录，剪切率与翻译在真核细胞中平衡。在MIN载体以及ΔSA载体中不含有病毒序列，但MIN含有IRES-neo盒而不是SV启动子-neo盒(见图5)。上述四个启动子的特征如下●一种含有人类β-肌动蛋白基因的内含子，剪切受体和部分外显子2的DNA片段被插入在MIN-AI载体中外源基因的上游位点。●一种含有人类EF1α基因的内含子，剪切受体和部分外显子2的DNA片段被插入在MIN-EI载体中外源基因的上游位点。●一种含有人类GAPDH基因的内含子，剪切受体和部分外显子2的DNA片段被插入在MIN-GI载体中外源基因的上游位点。除了这些构建体外，制备了一种载体，其中，一种异源的病毒序列被插入。特别是，制备了MIN-2载体，其中，一种含有HCMViel(UL123)基因的内含子，剪切受体，和部分外显子2的DNA片段被插入在MIN载体的克隆位点的上游位点。MIN和MIN衍生的MIN-AI，MIN-EI，MIN-GI和MIN-2的构建如下。(3-1)MIN的构建为得到MLV3’LTR区域，进行PCR，其中，pMLV(Shinnick等，自然，293543-548，1981)被用作模板，两个描述于SEQIDNO12(3LTR5引物)和NO13(3LTR3引物)的合成寡核苷酸被用作引物。被扩增的PCR产物含有3’非翻译区域，聚嘌呤区域，和MLV基因组的3’LTR。将亚克隆在pCRII载体(Invitrogen，CA，USA)中的PCR产物用BamHI和EcoRI酶消化，并将产生的片段插入在pUC18的BamHI-EcoRI位点，制备p3LTR载体(见图6)。另一方面，为得到含有逆病毒5’LTR和剪切共体的非编码序列，进行PCR，其中，pMLV被用作模板和两个被描述于SEQIDNO1(HHIR引物)和NO14(5LTR3引物)的合成寡核苷酸被用作引物。被扩增的PCR产物含有MLV基因组的从5’LTR至+623bp(刚好在gag编码序列的前面)的核苷酸序列。在PCR产物被亚克隆在pCRII载体中后，该载体的HindIII-BamHI片段被插入在p3LTR的HindIII-BamHI位点，来制备p53LTR载体(见图6)。最后，通过BamHI-XhoI消化从pCBIN(韩国专利申请97-48095)分离IRES/neo盒，然后插入在p53LTR载体的BamHI-XhoI位点，构建MIN载体(见图6)。通过将CAT基因插入MIN载体的BamHI位点也构建出MIN-CAT载体，以分析MIN载体的表达效率。(3-2)MIN-AI构建体为了制备将被插入在MIN载体中的人类核苷酸序列，从人类细胞中提取基因组DNA。首先，从人学中通过Ficoll-paque梯度离心分离外周血单核细胞。在洗涤一次或两次并重新收集后，将细胞用TES(10mMTris-Cl(pH7.0)，10mMEDTA，0.7％SDS)裂解。在细胞裂解液中加入蛋白酶K(400μg/ml)并将裂解液在50-55℃温浴1-2小时，然后进行酚/氯仿抽提和乙醇沉淀。将分离的基因组DNA用作PCR的模板，扩增出含有人类β-肌动蛋白基因的启动子，外显子1，内含子和部分外显子2。用于PCR的引物是两个合成的寡核苷酸，描述于SEQIDNO15(β-肌动蛋白5引物)和NO16(β-肌动蛋白3引物)。将PCR产物亚克隆进Pcrii载体，然后将该载体的MluI-NheI片段插入pC3.1载体(Invitrogen，CA，USA)的MluI-NheI位点，制备pβactin。将Klenow处理的pβactin的BglI-BamHI片段(相应于人类β-肌动蛋白基因的+717--+849片段)插入T4-聚合酶-处理的MIN载体的ApaI/BamHI位点(见图7a)。得到的载体被称为MIN-AI。此外，通过将CAT基因插入MIN-AI载体的BamHI位点构建MIN-AICAT载体，以分析MIN-AI的表达效率。(3-3)MIN-EI的构建为得到人类EF1α基因的非编码序列，进行PCR。将实施例3-2中分离的基因组DNA用作模板，两个描述于SEQIDNO17(EF1α5引物)和NO18(EF1α3引物)的合成寡核苷酸被用作引物。被扩增的PCR产物含有人类EF1α基因的启动子，外显子1，内含子和部分外显子2。将PCR产物亚克隆在pCRII载体中，然后将该载体的MluI-NheI片段插入pC3.1载体(Invitrogen，CA，USA)的MluI-NheI位点，制备pEF1α。将Klenow处理的pEF1α的XhoI-BamHI片段(相应于人类基因的EF1α的+772--+1008)插入T4-聚合酶-处理的MIN载体的ApaI/BamHI位点(见图7b)。得到的载体被称为MIN-EI。此外，通过将CAT盒插入MIN-EI载体的BamHI位点构建MIN-EICAT载体，以分析MIN-EI的表达效率。将MIN-EICAT导入大肠杆菌菌株Top10并将该大肠杆菌转化体命名为MIN-EICAT(Top10)，在1999年6月2日保藏在韩国微生物培养中心(保藏号KCCM-10163)。(3-4)MIN-GI的构建为得到人类GAPDH基因的非编码序列，进行PCR。将实施例3-2中分离的基因组DNA用作模板，两个描述于SEQIDNO19(Gint5引物)和NO20(Gint3引物)的合成寡核苷酸被用作引物。被扩增的PCR产物含有人类GAPDH基因的部分内含子和部分外显子2，相应与人类GAPDH基因的+185-+317。将PCR产物亚克隆在pCRII载体中，然后将该载体的MluI-BamHI片段插入MIN载体的MluI-BamHI位点。得到的载体被称为MIN-GI(见图7c)。此外，通过将CAT基因插入MIN-GI载体的BamHI位点构建MIN-GICAT载体，以分析MIN-GI的表达效率。(3-5)MIN-2的构建制备DON2的MluI-BamHI片段(相应于HCMViel基因的+837--+964)，它含有HCMViel(UL123)基因的内含子，剪切受体和部分外显子2。将MluI-BamHI片段插入MIN载体的MluI-BamHI位点。得到的载体被称为MIN-2(见图7d)。此外，通过将CAT基因插入MIN-2载体的BamHI位点构建MIN-2CAT载体，以分析MIN-2的表达效率。将MIN-2CAT导入大肠杆菌菌株Top10并将该大肠杆菌转化体命名为MIN-2CAT(Top10)，在1999年6月2日保藏在韩国微生物培养中心(保藏号KCCM-10164)。(3-6)CAT检测为了检测上述四个载体的外源外源基因表达效率和包装能力，对这些载体进行CAT检测，其中已知的逆病毒载体的CAT插入形式，MFG和LXSN，被用作对照载体(Miller等，生物技术，7980-990，1989；Ohashi等，美国科学院院刊，8911332-11336，1992)。将包装细胞系Phoenix(Kinsella和Nolan，人类基因治疗，71405-1413)用这些载体转染，然后培养48小时。同时，将通过用0.45μm滤膜过滤培养基得到的无细胞病毒上清液用于转导NIH3T3细胞(ATCCCRL1658)。使用转导2天后的蛋白质提取物确定CAT的活性水平。对用每一种载体(见表3中“临时转染”和“转导，临时”栏)转染的或转导的细胞系以及抗生素抗性细胞群(见表3中“转导，稳定”)测定CAT活性。此外，对亚培养4周的稳定细胞群(见表3中“转导，稳定(4周)”栏)测定CAT活性。从用每一种载体转染的或转导的细胞系测定的CAT活性确定转染的细胞系中基因的表达水平和病毒滴度。如表3所示，所有的逆病毒载体比MIN载体显示出较高的CAT活性，除了LXSN载体。但是，根据插入的异源性序列CAT活性有所差别。特别是，MIN-EI和MIN-2产生出显著高的基因表达水平。用MIN-EI或MIN-2稳定转导的细胞产生出非常显著高的基因表达水平，即使在亚培养4周之后。表3异源序列对逆病毒载体的效率的影响工业实用性如上文所述，本发明提供了具有许多基因治疗优点等的逆病毒载体。本发明的载体具有以下特征1.由于所有的逆病毒编码序列(gag，env，和pol序列)被切除，这可完全避免通过同源重组产生具有复制能力的逆病毒的可能性。2.由于异源内含子，剪切受体，和/或非编码序列被插入在外源基因的克隆位点的上游位置，载体中的外源基因可被稳定地或高效地表达。3.由于在5’LTR中的U3区域被特别是在人类细胞中强烈地诱导转录的异源启动子替换，用这些载体转染的来源于人细胞的包装细胞系可产生较高水平的RNA，从而显示出增高的病毒滴度。4.一种IRES或一种异源启动子被同时使用，在载体中表达两个或多个外源基因。在这种情况下，可使用一种最低启动子作为插入的外源启动子，以减小外源内部启动子的干扰和克隆具有较大尺寸的外源基因。本领域的普通技术人员将会看到，本文公开的概念和特定的实施例可被用作进一步改进的基础，设计出其它的实施方案并达到本发明的目的。本领域的普通技术人员也将会看到，这样的等同的实施方案没有脱离本发明的精神和范围。序列表<110>维络麦德公司<120>不含有病毒编码序列的高效逆病毒载体<130>9fpo-05-10<150>KR98-24478<151>1998-06-26<150>KR99-23398<151>1999-06-22<160>20<170>KOPATIN1.0<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>HHIR引物<400>1aagcttatctgaaagacccc20<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>R523Bam引物<400>2ggatcccaaaaattcagacgga22<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>CATATGN引物<400>3ccatggagaaaaaaatcact20<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>CATSTOP引物<400>4ggatccttacgccccgccctgcca24<210>5<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>SV40-5引物<400>5cggatccgtcgacgttaactcatgcatctcaattagtca39<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>Neo-3引物<400>6ctcgagtcagaagaactc18<210>7<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>R15引物<400>7gggaattctcagatcgcctggagacgcc28<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>CMVexon2.3引物<400>1aagcttcgtgtcaaggacggt21<210>9<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>SATop寡聚物<400>9gatctctccacagga15<210>10<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>SA底部寡聚物<400>10agaggtgtcctctag15<210>11<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>外显子13引物<400>11cgggatccgtcactcttggcacgggg26<210>12<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>3LTR5引物<400>12ggatcctcgaggataaaataaaagattttatttagtctcc40<210>13<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>3LTR3引物<400>13gaattcaatgaaagacccccgctgac26<210>14<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>5LTR3引物<400>14ggatccgcgggcccacgcgtattttcagacaaatacagaaacacagtcag50<210>15<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>beta-肌动蛋白5引物<400>15acgcgtgcccagcaccccaaggcggccaacgccaaa36<210>16<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>beta-肌动蛋白3引物<400>16gctagcggtgagctgcgagaatagccgggcgcgctgt37<210>17<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>EF1alpha5引物<400>17acgcgtggcaattgaaccggtgcctagagaaggtgg36<210>18<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>EF1alpha3引物<400>18gctagctttggcttttaggggtagttttcacgacac36<210>19<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>Gint5引物<400>19acgcgtatcgatagatctgtcgacgtgatgcggcgcgggct41<210>20<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>Gint3引物<400>20gcggccgcgttaacggatccatggtgtctgagcgatgtg39权利要求1.基于MLV的逆病毒载体，其中，MLV(小鼠白血病病毒)-编码的gag，env和pol序列完全缺失。2.按照权利要求1所述的基于MLV的逆病毒载体，它含有异源性内含子和/或异源性剪切受体，被插入在外源基因的克隆位点的上游。3.按照权利要求2所述的基于MLV的逆病毒载体，其中，所述的异源性内含子和/或异源性剪切受体选自HCMV(人类肥大细胞病毒)iel(UL123)基因、EF1α(延长因子1α)基因、GAPDH(甘油醛3-磷酸脱氢酶)基因、β-肌动蛋白基因，和小鼠免疫球蛋白基因的内含子和/或剪切受体。4.按照权利要求1所述的基于MLV的逆病毒载体，它含有一种被插入在外源基因克隆位点的上游位置的异源性非编码序列。5.按照权利要求4所述的基于MLV的逆病毒载体，其中所述的异源性非编码序列选自HCMViel(UL123)基因、EF1α基因、GAPDH基因、和β-肌动蛋白基因的非编码序列。6.按照权利要求1所述的基于MLV的逆病毒载体，其中MLV5’LTR的全长U3序列(-419至-1bp)被一种异源性启动子替换。7.按照权利要求6所述的基于MLV的逆病毒载体，其中，该异源性启动子是HCMV主要立即早期启动子。8.按照权利要求1所述的基于MLV的逆病毒载体，它含有一种插入在外源基因的克隆位点的下游的异源性启动子。9.按照权利要求8所述的基于MLV的逆病毒载体，其中该异源性启动子是SV40最小启动子。10.按照权利要求2所述的基于MLV的逆病毒载体，它是DONSA1载体，其中，小鼠免疫球蛋白基因的剪切受体和HCMViel(UL123)基因的外显子1被插入在外源基因的克隆位点的上游位置；MLV5’LTR的全长U3序列(-419至-1bp)被HCMV主要立即早期启动子替换；并且SV40最小启动子被插入在外源基因的克隆位点的下游位置。11.按照权利要求2所述的基于MLV的逆病毒载体，它是DON2载体，其中，HCMViel(UL123)基因的部分内含子A(112-bp3’片段)和部分外显子2(从外显子2的5’端至起始密码子前的5’片段)被插入在外源基因的克隆位点的上游位置；MLV5’LTR的全长U3序列(-419至-1bp)被HCMV主要立即早期启动子替换；并且SV40最小启动子被插入在外源基因的克隆位点的下游位置。12.按照权利要求4所述的基于MLV的逆病毒载体，它是MIN-EI载体，其中，含有人类EF1α基因的部分内含子和部分外显子2(+772至+1008bp)的DNA片段被插入在外源基因的克隆位点的上游位置。13.按照权利要求4所述的基于MLV的逆病毒载体，它是MIN2载体，其中，含有HCMViel(UL123)基因的部分内含子A和部分外显子2(+837至+964bp)的DNA片段被插入在外源基因的克隆位点的上游位置。14.用权利要求10的DONSA1载体转化的大肠杆菌菌株Top10-DONSA1(保藏号KCCM-10127)。15.用权利要求11的DON2载体转化的大肠杆菌菌株Top10-DON2(保藏号KCCM-10128)。16.用一种在权利要求12的载体的克隆位点含有细菌CAT(氯霉素乙酰转移酶)基因的MIN-EICAT载体转化的大肠杆菌菌株MIN-EICAT(Top10)(保藏号KCCM-10163)。17.用一种在权利要求13的载体的克隆位点含有细菌CAT(氯霉素乙酰转移酶)基因的MIN-2CAT载体转化的大肠杆菌菌株MIN-2CAT(Top10)(保藏号KCCM-10164)。全文摘要本发明涉及改良的用于基因治疗的逆病毒载体。在本发明中从基于MLV的起始载体,MON和MIN构建了具有高的安全性和有效性的逆病毒载体。该改良的载体具有以下特征:1)在载体中相应于来源于MLV的pol基因被完全缺失,避免了常规载体中成为棘手问题的同源重组,2)一种异源性内含子,剪切受体和/或非编码序列被插入在克隆位点的上游,通过高效率的剪切使外源基因的表达最大化,3)该载体含有5’LTR的全长U3序列或者一种强的异源性启动子,使RNA大量表达,4)IRES(内部核糖体进入位点)或者内部SV40最小启动子被插入在克隆位点的下游,使两个或多个外源基因同时表达。由于本发明的改良的逆病毒载体被证明是安全的和可高效表达外源基因,它们可被用于基因治疗等。文档编号A61K48/00GK1277636SQ99800828公开日2000年12月20日申请日期1999年6月24日优先权日1998年6月26日发明者金善荣,柳承信,金种默申请人:维络麦德公司