一种多顺反子、唾液腺特异性表达多顺反子的载体及其构建方法

一种多顺反子、唾液腺特异性表达多顺反子的载体及其构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种多顺反子、唾液腺特异性表达该多顺反子的载体及其构建方法，所述多基因共表达的多顺反子具有如SEQ ID No:1所示的碱基序列，所述唾液腺特异性表达多顺反子的载体具有如SEQ ID No:3所示的核苷酸序列，其是以多顺反子真核表达载体pCD?PXAT和pPB?mPSP?neoGFP载体为原料构建得到的。本发明构建的多顺反子能共表达纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、果胶酶与植酸酶，囊括了常规饲料中NSP酶的所有主要成员和植酸酶，这些酶都能较好的兼容动物胃肠消化道pH环境，具有较好的胃蛋白和胰蛋白酶耐受性，且始终保持较高的活性，克服了传统饲料用酶制剂在加工，生产使用中缺陷和问题，由于是动物自身分泌，几乎不存在成本问题。
【专利说明】
一种多顺反子、唾液腺特异性表达多顺反子的载体及其构建 方法
技术领域
[0001 ]本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种可在猪细胞共表达纤维素 酶、木聚糖酶、葡聚糖酶酶、果胶酶及植酸酶的多顺反子及其构建方法和应用，以及唾液腺 特异性表达该多顺反子的载体及其构建方法。
【背景技术】
[0002] 非淀粉多糖(NSP)是饲料中主要的抗营养因子，非淀粉多糖由纤维素、非纤维多糖 (半纤维素性聚合体)和果胶聚糖三大类物质组成，其中纤维素构成细胞壁的"三明治"框架 结构，而以木聚糖和葡聚糖为主的半纤维素和果胶等基质多糖是细胞壁纤维素框架内的 主要成分，起填充和连接作用(Choct，1997 )，细胞内的营养物被牢固地包埋在细胞壁夹层 及其内部，是阻碍动物对饲料营养充分利用的主要原因。部分可溶性NSP溶解后形成粘性食 糜，影响营养物质向肠道扩散，造成有害菌的滋生。
[0003] 植酸（ΙΡ6)是常规植物性饲料中磷的主要贮存形式，约占饲料总磷的44 %~92 % (Marounek et al .，2011; Sel Ie，2003;方热军等，2006 )，由于单胃动物胃和小肠缺失植酸 酶，常规饲料总磷的生物利用率仅14%~30% (NRC，1998)，动物生产中常依赖人工添加的 矿物磷来满足动物对磷的需求，而植酸磷被大肠微生物降解成无机磷后，随粪排出，造成环 境污染。
[0004] 非淀粉多糖酶是能降解日粮中的纤维素、β_葡聚糖、果胶和木聚糖等非淀粉多糖 的一系列酶类，主要包括:纤维素酶、葡聚糖酶、果胶酶、木聚糖酶等。非淀粉多糖酶在提 高饲料消化率，改善肠道健康，提高动物生产性能，扩大饲料资源开发方面具有重要意义。
[0005] 植酸酶是生产中应用最广泛的一类酶，植酸酶可分解动物饲料中的植酸磷，用于 代替部分磷酸氢钙，由于饲料中植物源磷被吸收，动物粪便中磷的排放量可减少20%~ 40%，减少了集约化畜牧场粪磷对环境的污染。
[0006] 但NSP酶和植酸酶在发酵生产和使用中存在诸多缺点：1.饲料工业中植酸酶、纤维 素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、果胶酶等酶的生产都是通过微生物发酵生产而来的，所用的菌 种主要有毕赤酵母、木霉、青霉、大肠杆菌、芽孢杆菌等，由于菌种的生产菌较稳定，往往一 种高产菌株只能生产一种酶，生产上述所有的酶需要多条发酵生产线才能完成，增加了酶 制剂的生产成本;2.NSP酶在选择底物时有着高度的专一性，每一种酶只针对一种底物，所 以在生产中，饲料配方频繁更换，为降低饲料成本，需要针对饲料中NSP的特点探索研究不 同NSP酶组合，给生产造成不便。3.NSP酶的本质是蛋白质，使用过程中易受到光照、湿度、微 生物、贮存时间和饲料粉碎、预混、制粒等因素影响，给酶制剂的效果产生很大的不确定性， 实际添加效果不理想;4.由于原核表达系统或低等生物表达系统和高等动物表达系统细胞 结构的差异，其各自的蛋白分泌信号引导肽迥异，低等生物来源的蛋白质在高等动物细胞 内表达和分泌存在系统障碍;5.由于低等生物和高等生物对密码子使用存在一定偏好性， 低等生物蛋白在高等生物细胞内表达效率较低，需要进行猪源化基因改造;6.用于不同生 物蛋白翻译后修饰系统差异，微生物源的各种NSP酶和植酸酶直接用于动物细胞表达系统， 存在较大的表达失败风险，必须要经过动物细胞表达验证;7 .多基因共表达技术涉及基因 多，重组后各基因受到连接肽和其他序列干扰较大，需要大量序列优化和重组试验探索其 最佳组合，重复序列对基因遗传稳定性存在一定威胁;8.由于NSP酶和植酸酶涉及到基因和 酶种类较多，传统单基因转基因技术工作量大，转基因遗传复杂，很难聚合和应用。

【发明内容】

[0007] 基于此，为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种可在猪细胞内高 效表达的纤维素酶-木聚糖酶-葡聚糖酶-果胶酶-植酸酶的多顺反子，其该多顺反子的制备 方法，该顺反子的应用，以及唾液腺特异性表达该多顺反子的载体及其制备方法。
[0008] 为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
[0009] 一种多基因共表达的多顺反子，所述多顺反子具有如SEQ ID N〇:l所示的核苷酸 序列。
[0010] 一种多基因共表达的多顺反子，所述多顺反子具有如SEQ ID N〇:2所示的氨基酸 序列。
[0011] 本发明还提供了上述多基因共表达的多顺反子在细胞生物反应器、转基因动物制 备或者组合酶制剂开发等方面的应用。
[0012] 本发明还提供了一种多基因共表达的多顺反子真核表达载体，所述真核表达载体 包括上述多基因共表达的多顺反子。
[0013] 本发明还提供了上述多基因共表达的多顺反子真核表达载体的构建方法，包括以 下步骤：
[0014] (1)、对果胶酶基因 Pg7fn进行猪密码子偏好优化，再与bovine腮腺分泌蛋白信号 肽进行重组，中间添加 6 X his标签，获得序列号为SEQ ID No: 4的重组果胶酶基因 Bpsp-6Hi s-Pg7f η;对木聚糖酶基因 Aspxyn进行猪密码子偏好优化，再与猪腮腺分泌蛋白信号肽 进行重组，获得序列号为SEQ ID Ν〇:5的重组木聚糖酶基因 Ppspl-AspXyn;对植酸酶基因 EsAPPA进行猪密码子偏好优化，再与猪腮腺分泌蛋白信号肽进行重组，获得序列号为SEQ ID No:6的重组植酸酶基因 Ppsp2-EsAPPA;对纤维素酶基因 TeEGI进行猪密码子偏好优化， 再与猪腮腺分泌蛋白信号肽进行重组，获得序列号为SEQ ID N〇:7的重组纤维素酶基因 Ppsp3_TeEGI;
[0015] (2)、分别以重组果胶酶基因 Bpsp-6His-Pg7fn为模板，SEQIDNo:14及SEQID No:15作为引物；以重组木聚糖酶基因 Ppspl-AspXyn为模板，SEQ ID No :16及SEQ ID No :17 作为引物；以重组植酸酶基因 Ppsp2-EsAPPA为模板，SEQ ID No: 18及SEQ ID No: 19作为引 物；以重组纤维素酶基因 Ppsp3-TeEGI为模板，SEQ ID No:20及SEQ ID No:21作为引物;进 行PCR扩增，获得具有E2A、P2A和T2A末端的目的基因 infu-Pg7fn、infu-AspXyn、infu-EsAPPA和infu-TeEGI;
[0016] (3)、利用EcoRI和NotI酶切pcDNA3.1载体获得线性化载体pcDNA3.1载体，再与步 骤（2)获得的目的基因 infu_Pg7fn、infU-AspXyn、infU-EsAPPA和infU-TeEGI进行重组反 应，获得多顺反子真核表达载体pCD-PXAT，多顺反子真核表达载体pCD-PXAT包括多基因共 表达的多顺反子，其核苷酸序列为SEQ ID No: 1，氨基酸序列为SEQ ID No:2。
[0017] 在其中一些实施例中，步骤（2)中所述PCR扩增的扩增体系为：总体积为50μL: PrimeSTAR Max Premix(2X)25yL，上下游引物（ΙΟμ mol/L)各 1.5yL，模板DNA lyL，加双蒸 水补至50yL。
[0018] 在其中一些实施例中，步骤(2)中所述PCR扩增的扩增程序为:98°C预变性IOs，98 。(:变性 10s，60°C 退火 5s，72°C 延伸 458,35个循环，72°(：后延伸211^11。
[0019] 在其中一些实施例中，步骤(3)中所述重组反应的反应体系为：2uL5X In-Fusion HD Enzyme Premix、luL线性化载体pcDNA3.1、l~1.5uL infu_Pg7fn、l~1.5uL infu-AspXyrul~1.5uL infu-EsAPPA和 1 ~1.5uL infu-TeEGI、加 dH2〇至10uL。
[0020] 在其中一些实施例中，步骤(3)中所述重组反应的反应条件为:50°C，15min。
[0021] 本发明还提供了一种唾液腺特异性表达多顺反子的载体，所述载体具有如SEQ ID No: 3所示的核苷酸序列。
[0022] 本发明还提供了上述唾液腺特异性表达多顺反子的载体的构建方法，包括以下步 骤：
[0023] (1)、以上述pCD-PXAT为模板，SEQ ID No:24和SEQ ID No:25为引物，进行PCR反 应，得到扩增产物infu-PXAT;
[0024] (2)、利用48(^酶切口1^1^5?-116〇6??载体，得到线性化的口？81^5?-116〇6??载体， 将上述扩增产物infu-PXAT克隆到pPB-mPSP-neoGFP的AscI酶切片段上，构建得到pPB-mPSP-PXAT-neoGFP，其核苷酸序列如SEQIDNo :3所示。
[0025]在其中一些实施例中，步骤(1)中所述PCR的反应体系为:反应体系总体积为50yL: PrimeSTAR Max Premix(2)25yL，上下游引物（ΙΟμL?θΙ/L)各 1.5yL，模板DNA lyL，加双蒸水 补至50yL在其中一些实施例中，步骤（1)中所述PCR的反应程序为:98°C预变性10s，98°C变 性10s，68°C退火和延伸4min，33个循环。
[0026] 在其中一些实施例中，步骤（2)中的反应体系为：2uL5XIn-Fusion HD Enzyme Premix、IuL线性化载体pPB-mPSP-neoGFP、1 ~3uL infu-PXAT、4~6uL dH2〇〇
[0027] 在其中一些实施例中，步骤(2)中的反应条件为:50°C，15min。
[0028] 本发明选择微生物源高活性的酸性的纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、果胶酶等酶 基因候选基因，预测其原信号肽序列，用OptimumGene?基因设计软件进行密码子猪源化改 造，为避免同源信号肽序列一致性太高，增加同源重组丢失的风险，本发明分别选用猪、牛、 鼠等多种来源的腮腺蛋白分泌信号肽序列，与猪源化蛋白酶序列重组，通过信号肽更新和 序列优化，保证基因在猪腮腺细胞正常胞外分泌，筛选到适合在动物细胞表达分泌的纤维 素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、果胶酶等酶基因，这些基因汇聚了细菌，真菌和昆虫源的高效表 达基因，再预先设计单个酶基因组合后的携带的全部表达序列，预先验证其表达活性，模拟 多顺反子表达，利用In-fusion载体构建技术，一次性重组获得多基因重组多顺反子。
[0029] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0030] (1 )、本发明选择T2A(Thosea asigna virus)、E2A(Equine rhinitis A virus)、 P2A(porcine teschovirus)(Donnelly et al，2001)等不同来源linker与furin蛋白酶识 别氨基酸(-Arg-Ly s/Arg-Arg丨)灵活组合，保证多顺反子翻译后各基因独立性，减少冗余序 列对蛋白酶高级结构形成干扰；
[0031] (2)、本发明构建的多顺反子能共表达纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、果胶酶与植 酸酶，该顺反子共表达的蛋白酶囊括常规饲料中NSP酶的所有主要成员和植酸酶，若用于转 基因动物的开发，将大大拓宽饲料资源的选择和开发，提高饲料利用率，减少污染排放；
[0032] (3)、本发明构建的多顺反子共表达的这些酶都能较好的兼容动物胃肠消化道pH 环境，具有较好的胃蛋白和胰蛋白酶耐受性，这些酶主要在动物消化道细胞中表达，在动物 胃、小肠、大肠等整个消化道都能发挥作用，且始终保持较高的活性，克服了传统饲料用酶 制剂在加工，生产使用中缺陷和问题，由于是动物自身分泌，几乎不存在成本问题；
[0033] (4)、本发明多顺反子的构建思路不但可以用于节粮环保型转基因动物的制备和 培育，也可以用于多功能组合酶制剂的开发和应用。
【附图说明】
[0034] 图1为实施例1中纤维素酶基因真核表达酶活测定结果，其中，图A-C测定底物为： 羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，图A'-C'测定底物为:β-葡聚糖，测定温度为39.5°C，A和A'测定 pH 分别为 3.5(Cel5B)、4.8(EgII)、6.0(AG-Egasel);
[0035] 图2为实施例1中猪细胞表达Ppsp3-TeEGI纤维素酶的酶学特性，其中，A:最适pH测 定;B: pH耐受性;C耐胃蛋白试验;D:耐胰蛋白酶试验；
[0036]图3为实施例1中猪细胞表达Rpsp-EgII纤维素酶的酶学特性，其中，A:最适pH测 定;B: pH耐受性(2h); C耐胃蛋白试验(2h); D:耐胰蛋白酶试验(2h);
[0037]图4为实施例1中三种果胶酶酶的活力测定，其中，图A、B测定底物分别为多聚半乳 糖醛酸、55%-70%酯化果胶，测定温度为39 · 5°C，测定pH为4 · 5;
[0038]图5为本发明实施例1中PG7fn基因在PK15细胞中表达果胶酶的酶学性质；其中，A: 最适pH测定;B: pH耐受性(2h); C耐胃蛋白试验(2h); D:耐胰蛋白酶试验(2h);
[0039] 图6为本发明实施例1中三种木聚糖酶的酶学性质比较分析，其中，A:最适pH测定； B:pH 耐受性(2h);C/D，E/F 和 H/I 分别为 Ppspl-AspXyn/Xynlll/PenXyl 耐胃蛋白试验(2h)和 耐胰蛋白酶试验(2h);图A、C、E分别为Axp-Xyn、XyIII、PenXy 1基因真核表达木聚糖酶猪胃 蛋白酶耐受性测定结果；图B、D、F分别为AXp-Xyn、XylII、PenXyl基因真核表达木聚糖酶猪 胰蛋白酶耐受性测定结果;测定温度为39.5°C ;
[0040] 图7为本发明实施例1中pH对CAPPA和EsAPPA影响;其中，A:磷标准曲线;B: CAPPA最 适pH(mean土S.D.) ;C:CAPPA的pH稳定性(mean土S.D.) ;D:EsAPPA最适pH(mean土S.D.);
[00411图8为本发明实施例1中CAPPA和EsAPPA的胃蛋白和胰蛋白耐受能力(mean土S.D.， P〈0.05)，其中，A:加胃蛋白处理；（-):未经胃蛋白或者胰蛋白酶处理；B: 'trypsin+'和 ' EDTA+ 加胰蛋白酶或EDTA处理；' tryps in- '和' EDTA- 未经胰蛋白酶或EDTA处理；
[0042]图9为本发明实施例1中Xyn-EgII双顺反子重组优化的结果；
[0043] 图10为本发明实施例1中pCD-EsAPPA-T2A和EsAPPA在PK15细胞中表达植酸酶的活 性测定；
[0044] 图11为本发明实施例1的pCD-TeEGI_T2A和TeEGI在PK15细胞中表达植酸酶的活性 测定；
[0045] 图12为本发明实施例1构建的PXAT多顺反子示意图；
[0046] 图13为本发明实施例1中多顺反子PXAT使用信号肽的序列优化设计；
[0047]图14为本发明实施例1中构建的p⑶-PXAT多顺反子的酶切结果，其中，M:DL5000;1 为pCD-PXAT质粒;2为对应质粒的双酶切结果。
[0048] 图15为多顺反子PXAT的表达测定与表达量差异比较;其中，A为表达测定图，B为表 达量差异比较图;mo-:单基因转染对照，Re:多顺反子转染；
[0049] 图16为本发明实施例2构建的pPB-mPSP-PXAT-neoGFP载体的图谱；
[0050] 图17为本发明实施例2构建的pPB-mPSP-PXAT-neoGF载体的酶切图，其中，M， DL15000; 1，3为pPB-mPSP-PXAT-neoGF质粒;2，4为对应质粒的限制性酶切结果。
【具体实施方式】
[0051] 以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明，以下实施例中如无特殊说明，所 使用原料均来源于市售，所采用方法均为本领域技术人员公知的常规操作方法。
[0052] 实施例1多基因共表达的多顺反子真核表达载体的构建方法 [0053]包括以下具体步骤：
[0054] 1、候选基因密码子优化及其真核表达载体构建
[0055] 1.1、候选基因选择
[0056] 根据文献报道及候选基因报道活性和特征，本实施例筛选以下基因进行改造和动 物细胞表达适应性验证。
[0057] 候选纤维素酶基因：来源于天牛的Ag-egasel基因 （Lee et al ,2004)和Bh-EgaseI 基因 （Mei et al，2016)、来源于丝状真菌的Cel5B基因 （Kim et al，2012)、来源于梭状芽孢 杆菌的Cel9基因 （Zhang et al,2010)、来源于Trichoderma reesei(里氏木霉）的EgII基因 (Akbarzadeh et al,2014)、来源于蟋蟀的TeEGI基因 （Kim et al,2008)
[0058] 候选木聚糖基因：来源于青霉菌的PenXyl基因 （Liu et al，2010)、来源于黑曲霉 的Xylll基因 （Guo et al,2013)和XynB(张茂等，2010)
[0059] 候选果胶酶基因：来源于耐热真菌沙栖梭孢壳XZ7的Pg7fn基因 （Tu et al，2014)、 来源于毛壳菌的PG基因 （Tu et al，2013)、来源于黑曲霉JL-15的PgaA(Liu et al，2014)
[0060] 候选植酸酶基因：来源于Escherichia coli大肠杆菌的植酸酶基因 APPA(GoLovan et al, 1990)，Citrobacter freundii(Zhao et al. ,2010)植酸酶 CAPPA 将这些酶基因经 SignalP 4. IServer预测信号肽后，分别去掉其原有信号肽。
[0061] 1.2、候选基因猪源化改造
[0062] 纤维素酶基因：将上述文献报道的纤维素酶基因用OptimumGene?基因设计软件进 行猪密码子偏好进行优化，并将其分别与猪密码子优化后的Rat，Pig等腮腺分泌蛋白信号 肽(Rp Sp，Ppsp3)进行重组，利用猪密码子偏好性和简并性，对原始猪Ppsp信号肽密码子进 行适当调整后，命名为Ppsp3，获得 Rpsp-Ag-EGase I/Bh-EGase I/Cel 5B/Cel9/EgII 和 Ppsp3_ TeEGI 基因（图 13)。
[0063] 果胶酶基因：将上述文献报道的果胶酶基因用OptimumGene?软件进行猪密码子偏 好进行优化后，将其与bovine腮腺分泌蛋白信号肽(Bpsp)进行重组，中间添加 6Xhis标签， 最后在氨基酸的C末端与E2A重组，即：获得Bpsp-6His-Pg7fn/PG/PgaA-E2A。
[0064] 木聚糖酶:将上述文献报道的木聚糖酶基因用OptimumGene?软件进行猪密码子偏 好优化后，将其与猪腮腺分泌蛋白信号肽(Ppspl)原始序列进行重组，即：Ppspl-PenXyl/ Xylll/Aspxyn，接着克隆到pCDNA3.1( + )真核表达载体(商业载体）中EcoRI和XhoI位点。
[0065] 植酸酶基因：将上述文献报道的植酸酶基因经过用OptimumGene?软件进行猪密码 子偏好进行优化后，与猪密码子偏好优化后的Ppsp2信号肽重组，利用猪密码子偏好性和简 并性，对原始猪Ppsp信号肽密码子进行适当调整后，命名为Ppsp2,即为：Ppsp2-EsAPPA/ CAPPA(图 13)〇
[0066] 接着将上述重组和修饰后的纤维素酶基因，果胶酶基因、木聚糖酶基因和植酸酶 基因克隆到克隆到P⑶NA3.1( + )真核表达载体中EcoRI和XhoI位点（基因合成和表达载体构 建委托上海金斯瑞公司完成），接着按照转染试剂盒Lipof ectamineTM LTX+PLUSTM Reagent(invitrogen)说明书瞬时转染猪肾pK15细胞系，48~72h收集细胞培养液作为粗酶 液测定酶活，酶活测定方法和定义参考纤维素酶《NYT/912-2004》、葡聚糖酶《NYT/911-2004》、木聚糖酶《GBT/23874-2009》、植酸酶《GBT/18634-2009》，果胶酶测定方法参考张飞 等(2004)《果胶酶果胶酶活力的测定方法研究》。
[0067] 1.3、候选基因真核表达结果
[0068] 1)、纤维素酶
[0069] 纤维素酶基因猪细胞表达结果（图1)显示，仅有Rpsp-EgII ,Rpsp-Bh-EGaseI和 Ppsp-TeEGI在猪细胞表达的纤维素酶和葡聚糖酶有活性，其中Rpsp-EgII和Ppsp-TeEGI活 性最尚。
[0070] 猪细胞表达的Ppsp-TeEGI和Rpsp-EgII酶学测定结果（图2和图3)显示，二者都具 有较宽pH范围和较强的pH耐受力，前者在pHM有优势，后者在pH〈4时有优势。二者对胰蛋白 酶胃蛋白耐受性都比较强，说明二者都是理想的选择。
[0071] 2)、果胶酶
[0072]三种猪源化的果胶酶在PK15细胞表达的酶活测定结果（图4)显示:3种来源的果胶 酶仅有 Bpsp-6His_Pg7fn 和 Bpsp_6His_PG 具有活性，但 Bpsp-6His_Pg7fn 活性最高。Bpsp-6His-Pg7fn不但对低酯化的多聚半乳糖醛酸酶活性高，对55 % -70 %酯化果胶活性也比较 理想，而PGI对55 % -70 %酯化果胶活性较差。酶学测定（图5)显示在pH3~6范围Bpsp-6Hi S-Pg7fn都具有较高的活性，其pH耐受强，对胃蛋白酶(pH4.5)和胰蛋白酶(pH6.5)耐受力也比 较理想。
[0073] Bpsp-6His_Pg7fn基因在表达前已经携带2A尾巴，表达结果显示2A并不影响该基 因活性，表明该酶适合放在多顺反子的首位或中间部分。
[0074] 3)、木聚糖酶活性
[0075] Ppspl-AspXyn/Xynlll/PenXyl三种微生物源木聚糖酶基因在pK15细胞表达结果 (图6)显示，三者都在pH 5·0时酶活力最高，分别为：1 ·88U/mL、1 ·65U/mL、0·72υ/πιΙ^Ρρ8ρ1-AspXyn在ρΗ2.0-6.0范围变化最稳当，该基因对胃蛋白和胰蛋白耐受能力也明显好于其它 两个木聚糖酶基因 Xynlll/PenXyl。
[0076] 4)、植酸酶基因
[0077] 猪细胞表达的Ppsp2-EsAPPA/CAPPA均具有较高的活性，最适pH和pH稳定性测定显 示（图7)，CAPPA有两个最优pH峰，即pH 2.5和5.0;EsAPPA在pHl. 5~5.0均保持较高的活性， 优势明显。
[0078]耐受性测定结果（图8)显示:EsAPPA对胃蛋白酶耐受能力较强，胃蛋白处理前后， 酶活几乎没变化，而CAppA剩余酶活只有52 · 2 %。单独用胰蛋白酶处理CAppA和EsAPPA两个 小时后，CAppA和EsAPPA剩余酶活分别为39.7 %和98.2 %。在EDTA存在情况下，胰蛋白酶处 理CAppA和EsAPPA两个小时剩余酶活分别为13.7%和31.8%。对比结果显示猪源化的 EsAPPA是本发明实施例的理想选择。
[0079] 1.4、可在猪细胞高效表达的候选基因重组优化 [0080] 1 )、木聚糖酶和纤维素酶优化重组试验
[0081 ]分别构建flagXyn-FE2A-flagEgII-FT2A、flagXyn-FE2A-EgII，flagXYN-FE2A-EgII-FT2A，flagXYN-FE2A-flagEgII并克隆到pCDNA3·l( + )EcoRI和XhoI位点（委托金斯瑞 公司基因合成和克隆）。将上述重组的木聚糖酶基因-纤维素酶基因双顺反子与单基因 Rpsp-EgII和Ppspl-Asp-Xynlll分别转染PK15细胞后，收集细胞培养基，分别测定其木聚糖 酶及纤维素酶活性(CMCase)和葡聚糖酶活性，结果显示（图9):flagXYN-furinE2A-EgII融 合效果最好，与单基因载体相比，木聚糖酶活性为单基因 asp-xyn表达活性的57.35 %，β-葡 聚糖酶活性为单基因的46.90%，其CMC的活性分别为纤维单基因的67.97% (由于基因大小 与转染效率直线相关，双基因转染效率不及单基因的50%，直接影响酶活力）。该试验结果 表明Ppspl-AspXyn基因适合放置在首位和中间部位，并且不受其它序列干扰，而Rpsp-EgII 基因较为敏感，无论2A，fur in和flag-tag都直接影响其蛋白功能，表明其只能放于多顺反 子的末位(放在末尾位置，其3末端不需要在与其他基因融合表达，独立性强）。
[0082] 2)、植酸酶EsAPPA和TeEGI基因在多顺反子位置优化重组试验
[0083] 为确定植酸酶EsAPPA和TeEGI基因在多顺反子中位置，设计引物在单基因 PpspEsAPPA和Ppsp-TeEGI3-末端添加 furin-T2A序列及HindΠI和NotI酶切位点，并克隆 到pCDNA3.1( + )的HindIII和NotI酶切位点，引物序列见表1，分别转染PK15细胞，收集细胞 培养基，测定植酸酶活性和纤维素酶活性。
[0084] 表1 EsAPPA和TeEGI基因定点突变所用引物序列
[0086] 测定结果（图10)显示:pCD-EsAPPA-T2A在PK15细胞中表达的植酸酶活力为1.00U/ mL，较不添加2A序列的EsAPPA基因表达的植酸酶活性低0.08U/mL，差异不显著，表明在该基 因3-末端添加 furin-2A对其空间结构和酶活都没影响，表明EsAPPA可以放在多顺反子中间 或两头位置。
[0087]但是TeEGI基因在添加2A后，其纤维素酶活性和葡聚糖酶活性都受到较大的影响 (图11)，表明该基因3-末端添加 furin-2A对其空间结构干扰较大，严重影响了其活力，该结 果表明TeEGI基因只能放置在多顺反子末端位置。
[0088] 2、多顺反子pCT-PXAT构建、表达及酶活检测
[0089] 根据上述对单个基因或双基因初步重组试验结果可知，对候选基因8?叩-6把8-Pg7fn，Ppspl-AspXyn，Ppsp2-EsAPPA，Ppsp3-TeEGI重组排列组合顺序有以下2种：Pg7fn-AspXyn-EsAPPA-TeEGI/EgII，Pg7fn-EsAPPA-AspXyn-TeEGI/EgII。本实施例选择前者进行 验证，即构建BpspHisPg7-E2A-Ppspl-AspXYN-P2A-Ppsp2-EsAPPA-furinT2A-Ppsp3-TeEGI (PXAT)，其示意图如图12所示，核苷酸序列如SEQ ID No: 1所示，氨基酸序列如SEQ ID No:2 所示。
[0090]根据重组基因 Bpsp-6His-Pg7fn(SEQ ID No:4)，Ppspl-AspXyn(SEQ ID No:5), Ppsp2-EsAPPA(SEQ ID No:6),Ppsp-TeEGKSEQ ID No:7)序列，在基因上下游两侧依次设 计infusion接头引物（表3)，接着以PCD-Bpsp-6His-Pg7fn/Ppspl-AspXyn/Ppsp2_EsAPPA/ Ppsp-TeEGI为模板进行扩增，扩增的目的基因末端（infu-Pg7fn/AspXyn/ESAPPA/TeEGI)及 载体末端(PCDNA3.1)具有15bp同源序列，扩增程序:98°C预变性10s，98°C变性10s，60°C退 火5s，72 °C延伸45s，35个循环，72 °C后延伸2min。扩增产物经切胶回收纯化。
[0091] 接着利用EcoRI和NotI酶切PCDNA3.1载体(商业化），纯化回收后，利用In-Fusion? HD Cloning Kits试剂盒，将线性化载体pcDNA3 · 1 载体与infu_Pg7fn/AspXyn/EsAPPA/ TeEGI重组反应，反应条件：50 °C，15min然后放于冰上。反应体系如下表2，接着经转化，涂 板，挑菌，鉴定构建PXAT多顺反子真核表达载体，见图14。
[0092] 表2 PAXT多顺反子构建infusion重组体系

[0097] 抽提无内毒素质粒瞬时转染PK15细胞，同时将单基因载体瞬时转染PK15细胞作为 对照，48小时后，收集细胞培养基，测定相应酶活力，测定结果如图16所示。结果（图15A)显 示，多顺反子在PK15细胞中成功共表达木聚糖酶、纤维素内切酶、β-葡聚糖酶、果胶酶，ΟΡΟ? 结果显示， PXAT 每个基因都得到表达，但由于多顺反子质粒远远大于单个基因载体，其 转染效率远远小于单个质粒的效率，这直接影响其mRNA的转录水平，结果见图15Β。
[0098] 实施例2唾液腺特异表达PXAT载体构建
[0099] 唾液腺特异表达载体pPB-mPSP-neoGFP为本单位专利保护载体（专利号： ZL201310343067.0)。
[0100]载体构建包括以下步骤：
[0101] 首先设计infusion-F和infusion-R(见表4)，以pCD-PXAT为模板，利用 PrimeSTAR? Max DNA PoIymerase进行PCR反应，反应程序：98 °C预变性IOs，98 °C变性 10s，68°C退火和延伸4min，33个循环，扩增产物infu-PXAT末端与线性化pPB-mPSP-neoGFP 载体(AscI酶切）末端具有15bp同源序列；接着利用In-FusionTM HD Cloning Kits将 infusion-PXAT 克隆到pPB-mPSP-neoGFP 的 AscI 酶切片段上构建 pPB-mPSP-PXAT-neoGFP，反 应体系见表5,构建结果见图16,核苷酸序列如SEQ ID No:3所示。
[0102] 表4 pPB-mPSP-PXAT-neoGFP构建及检测引物序列
[0103] 表 L〇1〇6」以上所述实施例仅表达了本发明的
几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保 护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种多基因共表达的多顺反子，其特征在于，所述多顺反子具有如SEQ ID N〇:l所示 的喊基序列。2. -种多基因共表达的多顺反子，其特征在于，所述多顺反子具有如SEQ ID N〇:2所示 的氨基酸序列。3. -种多基因共表达的多顺反子真核表达载体，其特征在于，所述真核表达载体包括 权利要求1或2所述的多基因共表达的多顺反子。4. 权利要求3所述的多基因共表达的多顺反子真核表达载体的构建方法，其特征在于， 包括以下步骤： (1) 、对果胶酶基因 Pg7fn进行猪密码子偏好优化，再与bovine腮腺分泌蛋白信号肽进 行重组，中间添加6Xhis标签，获得序列号为SEQ ID No:4的重组果胶酶基因 Bpsp-6His-Pg7f η;对木聚糖酶基因 AspXyn进行猪密码子偏好优化，再与猪腮腺分泌蛋白信号肽进行重 组，获得序列号为SEQ ID No:5的重组木聚糖酶基因 Ppspl-AspXyn;对植酸酶基因 EsAPPA进 行猪密码子偏好优化，再与猪腮腺分泌蛋白信号肽进行重组，获得序列号为SEQ ID N〇:6的 重组植酸酶基因 Ppsp2-EsAPPA;对纤维素酶基因 TeEGI进行猪密码子偏好优化，再与猪腮腺 分泌蛋白信号肽进行重组，获得序列号为SEQ ID N〇:7的重组纤维素酶基因 PpSp3-TeEGI; (2) 、分别以重组果胶酶基因 Bpsp-6His-Pg7fn为模板，SEQIDNo:14及SEQIDNo:15 作为引物；以重组木聚糖酶基因 Ppspl-AspXyn为模板，SEQ ID No: 16及SEQ ID No: 17作为 引物；以重组植酸酶基因 Ppsp2-EsAPPA为模板，SEQ ID No :18及SEQ ID No:19作为引物；以 重组纤维素酶基因 Ppsp3-TeEGI为模板，SEQIDNo:20及SEQIDNo:21作为引物;进行PCR 扩增，获得具有E2A、P2A和T2A末端的目的基因 infu-pg7fn、infu-AspXyn、infu-EsAPPA和 infu-TeEGI； (3) 、利用EcoR I和Not I酶切pcDNA3.1载体获得线性化载体pcDNA3.1载体，再与步骤 (2)获得的目的基因 infu-Pg7fn、infu_AspXyn、infu-EsAPPA和infu-TeEGI进行重组反应， 获得多顺反子真核表达载体pCD-PXAT，所述多顺反子真核表达载体pCD-PXAT包括权利要求 1或2所述的多基因共表达的多顺反子。5. 根据权利要求4所述的多基因共表达的多顺反子真核表达载体的构建方法，其特征 在于，步骤(2)中所述PCR扩增的扩增程序为:98 °C预变性1 Os，98 °C变性1 Os，60 °C退火5s，72 。(:延伸458,35个循环，72°(：后延伸211^11。6. 根据权利要求4所述的多基因共表达的多顺反子真核表达载体的构建方法，其特征 在于，步骤(3)中所述重组反应的反应体系为:2uL 5 X In-Fusion HD Enzyme Premix、luL 线性化载体pcDNA3.1、l~1.5uL infu_Pg7fn、l~1.5uL infu_AspXyn、l~1.5uL infu-EsAPPA和 1 ~1 · 5uL infu-TeEGI、加 dH20至 1 OuL。7. 根据权利要求4所述的多基因共表达的多顺反子真核表达载体的构建方法，其特征 在于，步骤(3)中所述重组反应的反应条件为:50°C，15min。8. -种唾液腺特异性表达多顺反子的载体，其特征在于，所述载体具有如SEQ ID No: 3 所示的核苷酸序列。9. 权利要求8所述的唾液腺特异性表达多顺反子的载体的构建方法，其特征在于，包括 以下步骤： (l)、以多顺反子真核表达载体pCD-PXAT为模板，SEQIDNo:24和SEQIDNo:25为引 物，进行PCR反应，得到扩增产物infu-PXAT; (2)、利用Asd酶切pro-mPSP-neoGFP载体，得到线性化的pPB-mPSP-neoGFP载体，将上 述扩增产物infu-PXAT克隆到pPB-mPSP-neoGFP的Asc I酶切片段上，构建得到pPB-mPSP-PXAT-neoGFP，其核苷酸序列如SEQIDNo:3所示。10.根据权利要求9所述的唾液腺特异性表达多顺反子的载体的构建方法，其特征在 于，步骤（1)中所述PCR的反应程序为:98°C预变性10s，98°C变性10s，68°C退火和延伸4min， 33个循环;步骤(2)中的反应体系为:2uL5X In-Fusion HD Enzyme Premix、luL线性化载体 pPB-mPSP-neoGFP、1~3uL infu-PXAT、4~6uL dH20。
【文档编号】C12N15/60GK106086068SQ201610397567
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月6日
【发明人】吴珍芳, 张献伟, 孙悦, 钟翠丽, 李国玲, 李紫聪, 蔡更元, 石俊松
【申请人】广东温氏食品集团股份有限公司, 华南农业大学