一对真核表达载体的制备方法及其应用与流程

本发明属于重组抗体技术领域，具体涉及一对真核表达载体的制备方法及其应用。

背景技术：

CD14有mCD14和sCD14两种类型，是细胞表面的糖蛋白，其生物学功能主要是识别、结合LPS或LPS/LBP复合物，介导LPS所致的细胞反应，在LPS性炎症反应、内毒素休克等病理反应中起重要作用。筛选出能识别CD14分子的抗体，对研究CD14分子的功能及整个通路都具有重要作用。若能够完全封闭CD14的功能，特异性的阻断CD14与LPS及LPS/LBP复合物结合，就能够防止或中止LPS性炎症反应、内毒素休克等病理反应的发生，对于临床治疗内毒素血症、内毒素休克等也将会较好的应用前景。

噬菌体展示单链抗体将抗体可变区基因片段插入到噬菌体外壳蛋白基因中，表达的抗体可变区与噬菌体外壳蛋白融合并展示于噬菌体表面，从而实现了抗体基因表现型和基因型的连接。通过对目的抗原的淘选，从抗体库中筛选出识别目的抗原的抗体，获得的抗体基因可以用于进一步改造。

膜蛋白表达成本较高，常规的抗体制备方法，无论是单克隆抗体还是多克隆抗体，均需要制备大量的膜蛋白用于免疫和检测。用噬菌体展示的抗体库的筛选方法，只需要少量的抗原就可以完成筛选和检测。同时，由于膜蛋白本身结构的复杂性，外源表达的膜蛋白在构象上并不能完全模拟细胞表面的膜蛋白，导致用外源蛋白免疫的方法制备的抗体不能很好识别细胞表达的膜蛋白。用细胞直接作为抗原免疫小鼠后，小鼠的免疫系统直接识别细胞表面的膜蛋白，这个天然状态的膜蛋白诱导产生的抗体能更好地识别膜蛋白。结合噬菌体展示抗体库可以高通量筛选的优点，可以细胞免疫后的抗体库中快速筛选出识别膜蛋白的抗体。

技术实现要素：

本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题之一，为此，本发明的一个目的在于提供了一对真核表达载体的构建技术，旨在完整表达能够识别CD14蛋白的嵌合抗体。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

本发明的具体技术方案如下：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一对能够完整表达出完整的可识别CD14蛋白的嵌合抗体的真核表达载体，包括以下步骤：

1.获取CD14抗体重链及轻链可变区序列：

利用PBMC细胞免疫小鼠后，提取脾脏mRNA，设计特异性引物扩增重链和轻链可变区，构建抗体可变区文库，筛选抗体噬菌体文库，得到重链可变区基因和轻链可变区基因。

2.构建重链真核表达载体：

设计引物用于PCR扩增重链可变区，用限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切位点分别对回收的PCR产物和pFUSEss-CHIg-hG1空载体进行37℃双酶切过夜，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析回收纯化后，在T4DNA连接酶作用下16℃连接过夜。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化液涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，次日随机挑取8个平板上单克隆菌落进行菌落PCR，筛选阳性单克隆菌落扩增提取质粒，进一步对质粒进行双酶切及测序鉴定。

3.构建轻链真核表达载体：

设计引物用于PCR扩增轻链可变区，用限制性内切酶AgeI和NcoI酶切位点分别对回收的PCR产物和pFUSE2ss-CLIg-hk空载体进行37℃双酶切过夜，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析回收纯化后，在T4DNA连接酶作用下16℃连接过夜。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化液涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，次日随机挑取8个平板上单克隆菌落进行菌落PCR，筛选阳性单克隆菌落扩增提取质粒，进一步对质粒进行双酶切及测序鉴定。

4.共转染293T细胞表达CD14抗体:

将获得的两种载体通过PEI转染293T细胞，获得含有重链和轻链的细胞株，通过抗生素筛选含有两种质粒的细胞株，培养细胞株，得到嵌合抗体。

5.嵌合抗体的纯化

1)取亲和层析柱，水洗10倍柱床体积；

2)用10倍柱床体积乙酸钠缓冲液洗涤层析株；

3)取细胞培养液，4℃12000rpm离心10min,收集上清，用0.45μm的滤膜过滤；

4)取5mL细胞培养基上清与等量的乙酸钠缓冲液混合；

5)以0.5mL/min的速度上样，收集穿透；

6)上样结束后，继续以乙酸钠缓冲冲洗至G250检测无色；

7)用冰乙酸洗脱缓冲冲洗柱床，搜集洗脱峰；

8)迅速用饱和碳酸钠调洗脱峰pH至中性；

9)若上样体积较大，边洗脱边加饱和碳酸氢钠；

10)用10倍体积的超纯水洗涤1层析柱；

11)用10mL NaCl-叠氮钠缓冲封闭层析柱，置于4℃备用；

12)将洗脱峰超滤浓缩到血清等体积，装入透析袋。

13)置于5L PBS中4℃透析过夜；

14)次日换液一次(5L PBS)；

15)6h后取出样品，4℃,12000rpm离心10min，收集上清，置于4℃暂存；

16)取出4μL抗体，用SDS-PAGE检测抗体的纯化。

17)用Nanodrop测定抗体的浓度。

6.嵌合抗体的Western blot检测

1)样品制备，取THP-1细胞，去掉培养基后用PBS进行清洗，按106加入500μL上述RIPA蛋白抽提液裂解细胞，取上清。

2)取匀浆液加入等体积2×上样缓冲液混匀，煮沸8min后上样，进行10％SDS-PAGE电泳分离蛋白，恒定电压140伏，电泳至溴酚蓝染料快到玻璃板边缘时；

3)将变性分离蛋白条带电转移到硝酸纤维素膜(NC膜，美国Millipore产品)上，恒定电流100毫安，持续时间1h；

4)取出NC膜，用4％PBSM封闭1h，PBS洗三次后，加入用4％PBSM稀释100倍后的本发明的可溶性单链抗体P1A8溶液，37℃保温孵育1h；

5)BST和PBS分别洗膜三次，10min/次，加入PBSM稀释(1:5000)的HRP/E tag conjugate抗体，37℃保温孵育1h；

6)PBST和PBS分别洗膜三次，10min/次，加入超敏ECL化学发光底物，显色拍照。

结果如图1所示，本发明的P1A8抗体可以从THP-1细胞裂解液中特异性识别CD14蛋白。

7.嵌合抗体的免疫荧光检测

1)使用交联剂，4％预冷的多聚甲醛覆盖细胞，室温固定15min，避光；

2)吸去多聚甲醛后，用PBS洗4遍，每次3min。

3)10％正常非免疫山羊血清(PBS稀释)室温封闭30min。

4)配制一抗：用5％正常山羊血清稀释一抗(P1A8)，至终浓度为0.1μg/μL；

5)加入一抗液覆盖细胞，4℃孵育过夜，避光。

6)取出细胞复温至室温，用PBS洗4遍，每次3min；

7)配制荧光标记二抗：用5％正常山羊血清稀释二抗，稀释比例为1:300；

8)加入二抗，室温孵育45min(避光)；

9)吸去多余二抗，PBS洗4遍，每次3min。

10)配制DAPI液：用PBS稀释DAPI原液，稀释比例为1:100；

11)加入DAPI染液覆盖细胞，染色1min。

结果如图2所示，本发明的P1A8抗体可以检测HepG2细胞细胞表面的CD14蛋白。

本发明采用了分子生物学和基因工程的办法，构建了CD14嵌合抗体基因的真核表达载体，通过诱导表达，亲和层析，获得了纯化的嵌合抗体。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1 CD14嵌合抗体的Western blot验证

图2 嵌合抗体IF验证

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例一

1.获取CD14抗体重链及轻链可变区序列

利用PBMC细胞免疫小鼠后，提取脾脏mRNA，设计特异性引物扩增重链和轻链可变区，构建抗体可变区文库，筛选抗体噬菌体文库，得到重链可变区基因和轻链可变区基因，重链可变区DNA序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区DNA序列如SEQ ID NO:2所示。序列。主要步骤如下：(1)动物免疫及脾细胞总RNA提取以PBMC为免疫原免疫小鼠三次，在取小鼠脾脏前3天加强免疫一次。测定抗血清效价，取效价高的小鼠，取脾组织提取总RNA；(2)反转录得到抗体的cDNA；(3)根据抗体可变区两端的保守序列设计特异性引物，引物序列见表1.分别以引物VH对和引物VL对扩增重链可变区和轻链可变区，反应条件如下:94℃预变性5min,94℃45s,58℃1min,72℃45s,共进行30个循环,72℃延伸10min。在设计引物时分别在重链可变区的下游引物序列和轻链可变区的上游引物序列引入linker序列，linker是重复三次排列组合的4个甘氨酸和1个丝氨酸((Gly4Ser)3)的15肽序列对应的45bp的基因序列，详见引物序列(该处缺少)；在重链可变区的上游和轻链可变区下游的引入酶切位点SfiⅠ和NotⅠ酶切位点；(4)全长单链抗体(scFv)基因的组装以linker序列为接头，通过SOE-PCR将重链可变区和轻链可变区的片段连接起来，PCR程序如下:首先在常规PCR反应体系(50μL)中加入等摩尔VL、VH基因,94℃预变性5min,94℃45s,68℃1min,72℃45s,共进行10个循环,72℃延伸10min；以此产物为模板,以引物scFv for和scFv back进行二次PCR,94℃预变性5min,94℃45s,60℃1min,72℃45s,共进行30个循环,最后72℃延伸10min，得到单链抗体的ScFV片段；(5)噬菌体单链抗体表面展示文库的构建分别对scFv基因和pCAN TAB5E噬菌粒载体进行Sfi Ⅰ、Not Ⅰ双酶切并连接,转化TG1感受态细胞并涂板,37℃过夜培养后进行菌落计数,估算库容量；将剩余转化菌液扩大培养,加入M13KO7辅助噬菌体37℃静置感染30min后,离心沉淀菌体细胞,用2×YT-AK培养基重悬,37℃震荡培养过夜,离心取上清液,加入PEG/NaCl冰浴1h,离心并重悬沉淀,经0.45μm滤膜过滤后所得即为初级噬菌体抗体库；(6)噬菌体单链抗体库的亲和富集与免疫筛选将所得初级噬菌体抗体库加入CD14蛋白包被的免疫管中,37℃静置孵育1h,洗涤,100mmol/L三乙胺洗脱与抗原吸附的噬菌体,随后立即加入1mol/L Tris(pH8.5)进行中和,以此感染对数生长期TG1,经培养后收集菌体细胞,再次加入M13KO7辅助噬菌体进行感染,重复上述富集程序3次,挑取单菌落扩大培养,进行菌液PCR鉴定和单克隆Phage-ELISA鉴定。鉴定正确的菌液进行测序。得到重链和轻链可变区的序列。

注:＊V H for中含S fi Ⅰ酶切位点,VL back中含Not Ⅰ酶切位点；VH back及VL for中下划线部分为(Gly4Ser)3序列；序列中简并碱基符号为W＝A/T；S＝G/C；M＝A/C；R＝A/G。

2.分别构建重链轻链真核表达载体(使用pFUSE2载体)分别设计用于扩增重链可变区，引入一对特异性引物，上游引物为，如SEQ ID NO:15所示

引物序列为：

5’-CTTGGAATTCGAGGTGAAGCTCAAGGAGTCT-3’；

下游引物为，如SEQ ID NO:16所示

引物序列为：

5’-GAATCTCGAGTGTCGACACGGTGACCGTGG-3’；

(下划线分别为EcoRI和XhoI酶切位点)。以筛选出来的抗体基因作为模板，用上述引物及Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增，反应条件如下：94℃预变性2min、94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸60s，共35个循环，最后72℃终延伸5min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析回收纯化。

真核表达载体pFUSE2/CD14重链的构建用限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切位点分别对回收的PCR产物和pFUSEss-CHIg-hG1空载体进行37℃双酶切过夜，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析回收纯化后，在T4DNA连接酶作用下16℃连接过夜。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化液涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，次日随机挑取8个平板上单克隆菌落进行菌落PCR，筛选阳性单克隆菌落扩增提取质粒，进一步对质粒进行双酶切及测序鉴定。

设计用于扩增轻链可变区的上下游引物，

上游引物为，如SEQ ID NO:17所示

引物序列为：

5’-CGTCACCGGTGACGTCGTGATGACCCAGTCT-3’；

下游引物为，如SEQ ID NO:18所示

引物序列为：

5’-AATTCCATGGGCGCTTGATTTCCAGCTTGG-3’；

(下划线分别为AgeI和NcoI酶切位点)。以筛选出来的抗体基因作为模板，用上述引物及Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增，反应条件如下：94℃预变性2min、94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸60s，共35个循环，最后72℃终延伸5min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析回收纯化。

真核表达载体pFUSE2/CD14轻链的构建用限制性内切酶AgeI和NcoI酶切位点分别对回收的PCR产物和pFUSE2ss-CLIg-hk空载体进行37℃双酶切过夜，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析回收纯化后，在T4DNA连接酶作用下16℃连接过夜。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化液涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，次日随机挑取8个平板上单克隆菌落进行菌落PCR，筛选阳性单克隆菌落扩增提取质粒，进一步对质粒进行双酶切及测序鉴定。

3.共转染293T细胞表达CD14抗体

将获得的两种载体通过PEI转染293T细胞，获得含有重链和轻链的细胞株，通过抗生素筛选含有两种质粒的细胞株，培养细胞株，得到抗体，主要步骤如下：.采用碱裂解法提取pFUSEss_CHIg重链表达质粒和pFUSE2ss_CLIg轻链表达质粒，两种质粒等比例混合后进行.细胞转染与抗体表达。

1)转染前细胞传代2次以上，大于活率95％，转染前一天将细胞传代，保证第二天的细胞汇合度达到80％-85％；

2)转染当天细胞换培养体积一半的新鲜培养基(无添加)，准备好DNA稀释液和PEI稀释液；

3)将DNA稀释液和PEI稀释液混合，静置5min后加入293T细胞中；

4)放于37℃的二氧化碳培养箱中培养；

5)转染24h后补充一半体积的完全培养基；

6)转染48h可以取样检测抗体是否表达；

7)根据检测情况确定收样时间。

4.嵌合抗体纯化

1)取亲和层析柱，水洗10倍柱床体积；

2)用10倍柱床体积乙酸钠缓冲液洗涤层析株；

3)取细胞培养液，4℃12000rpm离心10min,收集上清，用0.45μm的滤膜过滤；

4)取5mL细胞培养基上清与等量的乙酸钠缓冲液混合；

5)以0.5mL/min的速度上样，收集穿透；

6)上样结束后，继续以乙酸钠缓冲冲洗至G250检测无色；

7)用冰乙酸洗脱缓冲冲洗柱床，搜集洗脱峰；

8)迅速用饱和碳酸钠调洗脱峰pH至中性；

9)若上样体积较大，边洗脱边加饱和碳酸氢钠；

10)用10倍体积的超纯水洗涤1层析柱；

11)用10mL NaCl-叠氮钠缓冲封闭层析柱，置于4℃备用；

12)将洗脱峰超滤浓缩到血清等体积，装入透析袋；

13)置于5L PBS中4℃透析过夜；

14)次日换液一次(5L PBS)；

15)6h后取出样品，4℃,12000rpm离心10min，收集上清，置于4℃暂存；

16)取出4μL抗体，用SDS-PAGE检测抗体的纯化；

17)用Nanodrop测定抗体的浓度。

5.用Western blot方法检测本发明的筛选出来的抗体P1A8，其方法按下列步骤进行：

1)样品制备，取THP-1细胞，去掉培养基后用PBS进行清洗，按106加入500μL上述RIPA蛋白抽提液裂解细胞，取上清；

2)取匀浆液加入等体积2×上样缓冲液混匀，煮沸8min后上样，进行10％SDS-PAGE电泳分离蛋白，恒定电压140伏，电泳至溴酚蓝染料快到玻璃板边缘时；

3)将变性分离蛋白条带电转移到硝酸纤维素膜(NC膜，美国Millipore产品)上，恒定电流100毫安，持续时间1h；

4)取出NC膜，用4％PBSM封闭1h，PBS洗三次后，加入用4％PBSM稀释100倍后的本发明的可溶性单链抗体P1A8溶液，37℃保温孵育1h；

5)BST和PBS分别洗膜三次，10min/次，加入PBSM稀释(1:5000)的HRP/E tag conjugate抗体，37℃保温孵育1h；

6)PBST和PBS分别洗膜三次，10min/次，加入超敏ECL化学发光底物，显色拍照；

结果如图1所示，本发明的P1A8抗体可以从THP-1细胞裂解液中特异性识别CD14蛋白。

6.用免疫荧光检测本发明筛选出来的抗体P1A8，其方法按下列步骤进行：

1)使用交联剂，4％预冷的多聚甲醛覆盖细胞，室温固定15min，避光；

2)吸去多聚甲醛后，用PBS洗4遍，每次3min；

3)10％正常非免疫山羊血清(PBS稀释)室温封闭30min；

4)配制一抗：用5％正常山羊血清稀释一抗(P1A8)，至终浓度为0.1μg/μL；

5)加入一抗液覆盖细胞，4℃孵育过夜，避光；

6)取出细胞复温至室温，用PBS洗4遍，每次3min；

7)配制荧光标记二抗：用5％正常山羊血清稀释二抗，稀释比例为1:300；

8)加入二抗，室温孵育45min(避光)；

9)吸去多余二抗，PBS洗4遍，每次3min；

10)配制DAPI液：用PBS稀释DAPI原液，稀释比例为1:100；

11)加入DAPI染液覆盖细胞，染色1min。

结果如图2所示，本发明的P1A8抗体可以检测HepG2细胞细胞表面的CD14蛋白。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

<110> 武汉金开瑞生物工程有限公司

<120>一对真核表达载体的制备方法及其应用

<130> 2016

<160> 18

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

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<212> DNA

<213>重链可变区序列

<400> 1

atggcccaga tccagttgct gcagtctgga gctgagctgg taaggcctgg gacttcagtg 60

aagatatcct gcaaggcttc tggctacacc ttcactaact actggctagg ttgggtaaag 120

cagaggcctg gacatggact tgagtggatt ggagatattt accctggagg tggttatact 180

aactacaatg agaagttcaa gggcaaggcc acactgactg cagacacatc ctccagcact 240

gcctacatgc agctcagtag cctgacatct gaggactctg ctgtctattt ctgtgcaaga 300

gacgataggt acgactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca 357

<210> 2

<211> 336

<212> DNA

<213>轻链可变区序列

<400> 2

gacattgtgc tgacccagtc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60

atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttatat gaactggtac 120

caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa tctagaatct 180

gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240

cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatcctccc 300

acgttcggtg ctgggaccaa gctggaaatc aagcgc 336

<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gcggcccagc cggccatggc csaggtycag ctkcagcagt ctgga 45

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gcggcccagc cggccatggc cgakgtrcag cttcaggagt argga 45

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gcggcccagc cggccatggc cgargtgaag ctggtggart ctggr 45

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gcggcccagc cggccatggc csaggtccar ctgcagsary ctggr 45

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<212> DNA

<213> 人工序列

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tccagaaccg ccaccgccgc taccgccgcc acctgmrgag acdgtgasca grgtc 55

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<212> DNA

<213> 人工序列

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tccagaaccg ccaccgccgc taccgccgcc acctgmrgag acdgtgastg argtt 55

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<212> DNA

<213> 人工序列

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agcggcggtg gcggttctgg aggcggcggt tctgayatgc agatgacmca gwc 53

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<212> DNA

<213> 人工序列

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agcggcggtg gcggttctgg aggcggcggt tctramattg tgmtgaccca atc 53

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<213> 人工序列

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actagtcgcg gccgcgtcga cagcmcgttt cagytccary tt 42

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<213> 人工序列

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cgcaattcct ttagttgttc ctttctatgc ggcccagccg gccatggcc 49

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ggttccagcg gatccggata cggcaccgga ctagtcgcgg ccgcgtcgac 50

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cttggaattc gaggtgaagc tcaaggagtc t 31

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gaatctcgag tgtcgacacg gtgaccgtgg 30

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cgtcaccggt gacgtcgtga tgacccagtc t 31

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