专利名称：作为体外检测试剂的真核通用表达载体系统及其构建方法
技术领域：
本发明涉及一种体外检测试剂，具体地说涉及一种通过在毕赤酵母中利用穿梭质粒pPIC9构建的一种通用的表达载体系统及构建方法。
背景技术：
嗜甲醇毕赤酵母表达系统是最常用的真核表达系统之一。与原核表达系统相比，它所产生的蛋白绝大部分都能折叠成正确的构象，保留了其原来的活性；并能将蛋白分泌至细胞外以利于其后期的分离纯化。而与哺乳动物细胞相比，它作为一种低等的真核生物，培养周期短、成本低、易于操作，并能产生更多数量的分泌型功能蛋白。此外，毕赤酵母本身分泌的蛋白量很少，因此分泌的蛋白大部分都是外源蛋白，有利于后期处理。
根据Invitrogen公司的说明手册A annual of Methods for Expression ofRecombinant Proteins in Pichia pastoris的报道，穿梭质粒pPIC9是毕赤酵母表达系统中经典的分泌型表达载体。它含有AOX1启动子和转录终止子片断，AOX1作为一种强启动子，可以使所克隆的蛋白得到高表达。此外还含有组氨酸脱氢酶基因(HIS4)选择标记及3’AOX1区。它还含有当前分泌性能优越的酿酒酵母信号肽片段，以达到使蛋白成功分泌到胞外的目的。
根据文献“Complete amino acid sequence of a mouse immuno buil alphaclain(MOPC 511)(Proc Natl Acad Sci USA 1980 Aug；77(9)4909-13.)”报道的小鼠抗体Fc段包括其IgG1重链恒定区的铰链区、CH2和CH3三部分。它能介导抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。构建含有Fc片段的融合蛋白已有许多报导，它具有多方面的应用，包括介导ADCC作用，激活补体反应，延长其在体内的半衰期，以及增强对于肿瘤细胞的功效。
上述的表达载体系统通用性较差，使用不便，不易于检测，检测不够快速、价格较高。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种作为体外检测试剂的真核通用表达载体系统及其构建方法，以克服现有技术存在的上述缺陷，满足医疗领域需要。
所述的载体含有一个转录单位，该单位由以下一系列组成(1)一个在毕赤酵母中可以启动基因表达的遗传因子；(2)信号肽；(3)合适的多克隆位点；(4)小鼠IgG1 Fc段的脱氧核糖核酸片段；(5)六个组氨酸组成的短肽；(6)转录及翻译的起始及终止序列。
上述的表达载体系统的构建方法包括如下步骤本发明从毕赤酵母表达载体pPIC9出发，克隆入小鼠抗体Fc片段、并引入Sfi I、Not I酶切位点以及HIS(6)-tag，分别作为引入目的基因和融合蛋白纯化之用，从而构建了一种用以体外检测的新型载体系统。
首先用Klenow酶将pPIC9载体多克隆位点中Not I位点补平，得pPIC9-Not I minus，以便后期基因片段的插入。
从小鼠脾脏中用Trizol试剂抽提总RNA，经变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性。用提取的总RNA反转录成cDNA，以此为模板，由引物MO-1(5’-GTGCCCAGGGATTGTGGT-3’)和MO-2(5’-TTATTTACCAGGAGAGTGGG AGAGG-3’)经PCR扩增，获得扩增产物即为小鼠IgG1 Fc段，将此Fc段装入pMD18-T载体。
再以此为模板，用带有酶切位点的引物MO-3和MO-4扩增出Fc段以引入Sfi I、Not I和HIS-tag至其两端。
MO-3和MO-4分别为(5’-GGGATTCAAGGGCCAGCCGGCCAGCGGCCGCGTGCCCAGGGATTGT
EcoR I Sfi I Not IG-3’)(5’AAAACATGCCTAGGAAGCTTGTGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTACCAGGAGAGTGG-3’)Avr II Hind III (His)6sequences经EcoR I和Not I双酶切，将此PCR扩增产物装入pPIC9-Not I minus中。得到pPIC9-Fc。
至此完成了此载体系统的构建。PCR鉴定电泳结果，表明，Fc段确已装入，测序结果如下1gaattcaagg cccagccggc cgcggccggc cgcgtgccca gggattgtgg ttgtaagcct61 tgcatatgta cagtcccaga agtatcatct gtcttcatct tccccccaaa gcccaaggat121 gtgctcacca ttactctgac tcctaaggtc acgtgtgttg tggtagacat cagcaaggat181 gatcccgagg tccagttcag ctggtttgta gatgatgtgg aggtgcacac agctcagacg241 caaccccggg aggagcagtt caacagcact ttccgctcag tcagtgaact tcccatcatg301 caccaggact ggctcaatgg caaggagttc aaatgcaggg tcaacagtgc agctttccct361 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaaacc aaaggcagac cgaaggctcc acaggtgtac421 accattccac ctcccaagga gcagatggcc aaggataaag tcagtctgac ctgcatgata481 acagacttct tccctgaaga cattactgtg gagtggcagt ggaatgggca gccagcggag541 aactacaaga acactcagcc catcatggac acagatggct cttacttcgt ctacagcaag601 ctcaatgtgc agaagagcaa ctgggaggca ggaaatactt tcacctgctc tgtgttacat661 gagggcctgc acaaccacca tactgagaag agcctctccc actctcctgg taaacaccac721 caccaccacc acttaagctt cctagggcgg ccggccgcga attaa本发明的载体系统可生产融合蛋白以作为体外检测试剂。
本发明的优点在于此表达载体系统具有显著的通用性由于在pPIC9-Fc中人为引入了SfiI、Not I酶切位点，与pHEN 1和pCANTAB 5E这两种噬菌粒中的多克隆位点一致，因此使得那些从噬菌体展示系统中所筛出的目的基因片段能直接克隆入pPIC9-Fc中而不需中间的克隆步骤，非常方便。另外也可根据需要装入任何在其5’和3’端含有Sfi I、Not I酶切位点的基因片段。更加推广了此载体系统的应用。
易于检测目的基因片段与小鼠抗体Fc片段是以融合蛋白的形式表达，因此只要用普通的抗鼠抗体便可检测到。使得其应用更加方便、快速、低廉。
所表达的融合蛋白易于、分离纯化由于在多克隆位点的3’端引入了His-Tag，可以使用镍性的亲和层析柱分离纯化。而对于带有His-Tag的蛋白的纯化已经是一项较为成熟的技术，因此也使得本系统更加方便使用。
图1为质粒简图；图2为多克隆位点详图；图3是PCR鉴定凝胶电泳图；图4是ScFv-Fc融合蛋白小量表达SDS-PAGE分析图；图5是ScFv-Fc融合蛋白大量表达和纯化的SDS-PAGE分析图；图6是Western Blotting鉴定ScFv-Fc融合蛋白活性分析图。
具体实施例方式
图1为质粒简图，图中，S为α因子分泌信号肽；Fc为小鼠IgG1 Fc重链恒区中的铰链区、CH2、CH3；HIS-tag为六个组氨酸组成的短肽；5’及3’AOX1为醇氧化酶1启动子；HIS4为编码组氨酸脱氢酶的基因；Co1E1为原核复制起始点；Amp为氨苄抗性基因。
图2为多克隆位点详图。S、Fc和HIS-tag见图1的说明，Xho I、SnaBI、Sfi I、EcoR I、Not I、HindIII、AvrII皆为限制性核酸内切酶位点。
由图1和图2可见，所述的载体含有一个转录单位，该单位由以下一系列组成(1)一个在毕赤酵母中可以启动基因表达的遗传因子；(2)信号肽；(3)合适的多克隆位点；(4)小鼠IgG1 Fc段的脱氧核糖核酸片段；(5)六个组氨酸组成的短肽；(6)转录及翻译的起始及终止序列。
所述的遗传因子是启动子，所述的启动子选自醇氧化酶1基因，所述的信号肽选自酿酒酵母α因子。
实施例1装入一个抗GST的单链抗体ScFv
抗GST(谷胱甘肽-S-转移酶)的ScFv的克隆将从噬菌体抗体库中筛出的一个抗GST的ScFv片段，经PCR扩增和Sfi I、Not I双酶切，克隆至Sfi I、Not I消化的pPIC9-Fc质粒之中，得表达载体pPIC9-ScFv-Fc。
ScFv-Fc融合蛋白的小量表达。
按Invitrogen操作手册制备毕赤酵母KM71菌株的感受态细胞，将pPIC9-ScFv-Fc用Sal I酶切线性化后电转入以上感受态细胞中(1500伏、25uF、400欧)，立刻加入1ml预冷的1M山梨醇，转移至管中离心，涂布在MD平板上，30℃培养。
从MD板上挑取7个克隆培养在10ml BMGY培养基中(1％酵母粉，2％蛋白胨，100mM磷酸钾缓冲液，pH6.0，1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甘油)，30℃，250rpm下培养至O.D.600＝2.0-6.0。细胞离心后重悬在2ml BMMY培养基中(1％酵母粉，2％蛋白胨，100mM磷酸钾缓冲液，pH6.0，1.34％YNB，4×10-5％生物素，0.5％甲醇)以诱导蛋白表达。30℃、250rpm条件下培养6天，每24小时添加甲醇至终浓度为0.5％。6天后离心收集上清，取少量进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图3所示。
ScFv-Fc融合蛋白的大量表达挑选表达量最高的克隆进行大量表达，即在5升发酵罐中进行发酵。具体操作按Invitrogen的发酵手册(Pichia Fermentation Process Guidelines，Invitrogen)进行。100小时后离心收集上清，-80℃保存。取少量进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图4所示。其中lane1 Marker，lane2未插入Fc段的pPIC9转化株，lane3-lane8 MD板上挑取的七个克隆。
ScFv-Fc 融合蛋白的纯化取1生发酵得上清液，加入PMSF至终浓度为1mM，以防止蛋白降解。并加入1/10总体积的1.0Mtris，8.0将培养基的pH值调至8.0。然后加入硫酸铵至饱和度为60％以沉淀蛋白质，冰浴下搅拌2小时。沉淀离心后重悬在40ml 20mM Tris-HCl，pH7.9中，透析过夜。加入imidazole和NaCl至终浓度分别为0.5M和5mM。然后将样品上至镍性亲和层析柱，经洗涤液(20mM Tris/HCl，pH7.9，60mM imidazole，0.5M NaCl)充分洗净杂质后，用洗脱液(20mM Tris/HCl，pH7.9，0.5M imidazole，0.5M NaCl)将目的蛋白洗下。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如图5所示。其中lane1大量表达后的上清液，lane2纯化后的ScFv-Fc融合蛋白，lane3 Marker。
5、Western Blotting检测ScFv-Fc融合蛋白活性为检测此ScFv-Fc蛋白的活性，获得GST和一批含GST的融合蛋白，包括hCG(绒毛促肾上腺激素)，FGF(碱性成纤维细胞生长因子)，来自多药抗性P糖蛋白的蛋白片段，B37，C21，C23，D1，D2。
将以上GST和GST融合蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，其中包括未经诱导的BL21细胞裂解液作为阴性对照。分离出的目的蛋白由semi-dry transfer apparatus(Bio-Rad Laboratories)转移至PVDF膜上。将膜用封闭缓冲液(PBST中含有5％脱脂奶粉)封闭1小时。进行三次洗涤，每次用PBST洗10分钟，之后室温下与ScFv-Fc融合蛋白温育1小时。同样三次洗涤后，在由辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG1 1∶1000稀释液中温育1小时。再经三次洗涤后，膜用ECL Western Blotting检测试剂(AmershamPharmacia Biotech.)处理后送去暗室曝光。Western Blotting结果如图6所示。其中lane1未诱导的BL21细胞裂解液lane2 FGF lane3 D1 lane4 D2lane5 hCG lane6 B37 lane7 C21 lane8 C23 lane9 GST lane2-9所示蛋白的预期分子量分别为42kDa，54kDa，50kDa，43kDa，30kDa，29kDa，30kDaand 26kDa。
结果表明实施例1中将抗GST单链抗体克隆入所构建的载体系统中后，获得了高表达，不仅引入了Fc段检测此融合蛋白的功效，还保留了单链抗体部分抗GST的活性。因此，此ScFv-Fc融合蛋白可以开发成检测GST及其融合蛋白的体外检测试剂。也验证了所构建的表达载体系统的意义。
权利要求
1.一种作为体外检测试剂的真核通用表达载体系统，其特征在于，所述的载体含有一个转录单位，该单位由以下一系列组成(1)一个在毕赤酵母中可以启动基因表达的遗传因子；(2)信号肽；(3)合适的多克隆位点；(4)小鼠IgG1 Fc段的脱氧核糖核酸片段；(5)六个组氨酸组成的短肽；(6)转录及翻译的起始及终止序列。
2.根据权利要求1所述的真核通用表达载体系统，其特征在于，所述的遗传因子是启动子。
3.根据权利要求1所述的真核通用表达载体系统，其特征在于，所述的启动子选自醇氧化酶1基因。
4.根据权利要求1所述的真核通用表达载体系统，其特征在于，所述的信号肽选自酿酒酵母α因子。
5.根据权利要求1～4任一项所述的真核通用表达载体系统的构建方法，其特征在于，包括如下步骤从毕赤酵母表达载体pPIC9出发，克隆入小鼠抗体Fc片段、并引入合适的酶切位点以及HIS(6)-tag，分别作为引入目的基因和融合蛋白纯化之用，从而构建了一种用以体外检测的新型载体系统。
6.根据权利要求5所述的真核通用表达载体系统的构建方法，其特征在于，所说的酶切位点为SfiI和NotI。
7.一种根据权利要求1～4任一项所述的真核通用表达载体系统的应用，其特征在于，用于生产融合蛋白以作为体外检测试剂。
全文摘要
一种作为体外检测试剂的真核通用表达载体系统，含有一个转录单位，该单位包括(1)一个在毕赤酵母中可以启动基因表达的遗传因子；(2)信号肽；(3)合适的多克隆位点；(4)小鼠IgG1 Fc段的脱氧核糖核酸片段；(5)六个组氨酸组成的短肽；(6)转录及翻译的起始及终止序列。构建方法包括如下步骤从毕赤酵母表达载体pPIC9出发，克隆入小鼠抗体Fc片段、并引入合适的酶切位点以及HIS(6)－tag，分别作为引入目的基因和融合蛋白纯化之用。该真核通用表达载体系统可用于生产融合蛋白以作为体外检测试剂。此表达载体系统具有显著的通用性易于检测，所表达的融合蛋白易于、分离纯化，使用方便。
文档编号G01N33/68GK1544639SQ20031010881
公开日2004年11月10日 申请日期2003年11月24日 优先权日2003年11月24日
发明者魏东芝, 刘江澜, 钱峰, 杨忠 申请人:华东理工大学