pIRES/TgDHFR-TS真核表达重组质粒及其构建和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体地说，是将刚地弓形虫二氢叶酸还原酶-胸 苷酸合成酶基因引入到pIRES表达载体中，构建一种新的真核表达重组质粒。本发明构建 的质粒能够通过转染的方法进入弓形虫速殖子中，通过加入乙胺嘧啶进行过表达稳定速殖 子克隆的筛选。
【背景技术】
[0002] 刚地弓形虫goflt/ii)是一种专性细胞内寄生原虫，可感染人类和其 他温血动物，全球约1/3的人感染弓形虫。刚地弓形虫一般为隐性感染，患者无明显的临床 症状，但其感染孕妇后，常导致流产、早产、死产、畸形等异常妊娠结局，存活者中80%有智 力发育障碍。先天性弓形虫病在新生儿中的发生率高达1%。?6%。。近年来，随着医源性免 疫抑制、器官移植以及艾滋病患者的增多，弓形虫病的发病率有升高的趋势，甚至造成致死 性损害。因此，弓形虫致病基因功能及其致病机制的研宄，有助于揭示弓形虫的致病机理， 同时为弓形虫病的防治提供新的思路。
[0003] 目前基因或蛋白质功能的研宄通常采用两种策略，其一是构建该基因的真核表达 重组质粒，将其转染宿主细胞后，筛选出稳定表达该基因的细胞克隆（overexpression)， 进行基因或蛋白质的研宄；其二是将该基因从宿主细胞中敲低（knockdown)或敲除 (knockout)，再研宄该基因的功能。
[0004] 乙胺喃啶（pyrimethamine)是目前治疗弓形虫感染的主要药物之一，其作用机 理是通过阻碍二氢叶酸的合成，导致四氢叶酸生成减少，阻止弓形虫核酸合成，从而达到 抑制弓形虫增殖的作用。而在弓形虫体内过表达二氢叶酸还原酶-胸苷酸合成酶基因 (DHFR-TS)及其编码的蛋白质，可以补偿由于乙胺嘧啶作用导致的二氢叶酸合成障碍，继续 其生活周期。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种pIRES/7y)HFR-TS真核表达重组质粒，以及该重组质粒 的构建方法和应用。
[0006] 本发明提供的pIRES/T^DHFR-TS真核表达重组质粒由二氢叶酸还原酶-胸苷酸合 成酶基因T^DHFR-TS片段与表达载体pIRES重组获得，具有SEQIDNO. 4所示的核苷酸序 列，所述序列共计7973bp。本发明在所述真核表达重组质粒中引入HA标签序列。
[0007] 本发明所述真核表达重组质粒的构建方法是设计具有SEQIDNO. 1和SEQID NO. 2所示核苷酸序列的引物，通过聚合酶链式反应（PCR)方法从弓形虫速殖子的cDNA中克 隆得到7^DHFR-TS，并将通oI和及I双酶切的ADHFR-TS基因PCR产物连接在同样双 酶切的真核表达载体pIRES的B克隆位点，构建重组的pIRES/T^DHFR-TS真核表达重组质 粒。
[0008] 其中，PIRES是一种哺乳动物细胞的单启动子双表达载体，该载体含有两个多克 隆位点（A和B)，两个多克隆位点之间含有脑炎心肌炎病毒（ECMV)的核糖体内插入位点 (IRES)，允许两个双顺反子mRNA转录本的同时高效表达。在多克隆位点A的上游含有巨细 胞病毒启动子，可以高效启动两个多克隆位点引入基因的转录。
[0009] 本发明首先成功克隆了二氢叶酸还原酶-胸苷酸合成酶基因7y)HFR-TS，并将该 基因引入pIRES的多克隆位点B处，构建了真核表达重组质粒pIRES/7y)HFR-TS。
[0010] 本发明所构建的重组质粒经PCR、双酶切和序列测序分析表明，载体上7y)HFR-TS 基因读码框完整，插入方向正确，并且保留了羧基端的HA标签，便于后期通过检测HA标签 来判断7^DHFR-TS的表达。
[0011] 进而，本发明构建的真核表达重组质粒pIRES/7y)HFR-TS可以作为新的载体，在 其多克隆位点A处引入需要研宄的目标基因。具体的，所引入的目标基因为弓形虫基因，如 SAG、ROP17等基因，转染弓形虫速殖子后便于进一步研宄该基因的功能。
[0012] 通过脂质体介导的转染方法，将pIRES/7y)HFR-TS真核表达重组质粒转染真核细 胞，RT-PCR和Westernblotting结果显示，该基因能够在真核细胞中表达。
[0013] 乙胺嘧啶可以有效抑制弓形虫的增殖，在弓形虫速殖子中引入本发明所述的真核 表达重组质粒，可以拮抗乙胺嘧啶的作用，使速殖子继续增殖。因此，本发明真核表达重组 质粒pIRES/7y)HFR-TS可以作为一种新的质粒载体，将需要研宄的弓形虫的其他基因引入 速殖子中，通过加入乙胺嘧啶进行过表达感兴趣基因稳定速殖子克隆的筛选，为进一步研 宄目标基因在弓形虫中的功能提供有力的工具支持。
【附图说明】
[0014] 图1是pIRES/7y)HFR-TS真核表达重组质粒的构建示意图。
[0015] 图2是弓形虫DHFR-TS基因的PCR产物。
[0016] 图中，M:DNA分子标记；1 : 7^DHFR-TSRT-PCR产物；2 :阴性对照。
[0017] 图3是pIRES/7y)HFR-TS重组质粒的菌落PCR和双酶切鉴定图。
[0018] 图中，A:M:DNA分子标记；1，2,3,4 :pIRES/7^DHFR-TS菌液PCR产物；5 :阴性对 照；B:M:DNA分子标记；1，2 :pIRES/7^DHFR-TS双酶切产物。
[0019] 图4是RT-PCR(A)和Westernblotting(B)检测pIRES/7y)HFR-TS在HEK293T 细胞中的表达。
[0020] 图中，A:M:DNA分子标记；1 :转染空质粒的细胞；2 :转染pIRES/7y)HFR-TS的细 胞；B:1 :转染空质粒的细胞；2 :转染pIRES/7y)HFR-TS的细胞。
【具体实施方式】
[0021 ] 本发明实施例中使用的构建材料和主要试剂的来源。
[0022] 刚地弓形虫RH株：本实验室保存，小鼠腹腔接种传代。真核表达载体：pIRES，购自 美国Clontech公司。HEK293T细胞，购自北京协和医学院基础所细胞中心。大肠埃希菌 DH5a，购自北京全式金生物技术有限公司。
[0023] 限制性内切酶油aI和AfotI，购自宝生物工程(大连）有限公司；Trizol、 HiFi-MMLVcDNA第一链合成试剂盒、2XEsTaqMasterMix、T4DNA连接酶、琼脂糖凝胶回 收试剂盒、DL2000DNAMarker、质粒小提试剂盒、小鼠抗HA单克隆抗体、小鼠抗0-actin 抗体，购自北京康为世纪有限公司；预染蛋白Marker，购自加拿大Fermentas公司；辣根酶 标记的山羊抗小鼠IgG，购自北京中山金桥有限公司；ECL发光液，购自北京英格恩公司。