地衣芽胞杆菌表达宿主的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及重组的地衣芽胞杆菌化10宿主 菌株，W及在此宿主细胞中表达目的蛋白的方法。
【背景技术】
[0002] 在研究蛋白表达的过程中，发展了多种有价值的表达系统，主要包括原核表达系 统和真核表达系统。原核表达系统是最早被采用，也是目前研究得相对成熟的表达系统。 目前最常用的原核表达系统有大肠杆菌表达系统、枯草芽胞杆菌表达系统和链霉菌表达系 统等，其中大肠杆菌表达系统应用最为广泛，枯草芽胞杆菌用于分泌表达目标蛋白也越来 越受到重视。目标蛋白在胞内完成转录翻译后，从胞内出来在周质空间正确折叠并通过细 胞壁来到胞外，就需要选择合适的信号肤酶高效的切除信号肤，并抑制细胞壁和胞外存在 的大量蛋白酶的活性，减少蛋白酶对目的蛋白的降解。提高目标蛋白分泌表达最重要的 一步就是抑制其折叠环境的蛋白酶活性。通过缺失8个蛋白酶基因（吨rE;np巧；ap巧； 巧r ;mpr ;bpf，vpr ;wprA)，前人构建了枯草芽胞杆菌WB800宿主菌，可高效表达多种目标蛋 白，显示了巨大的应用潜力（Murashima 等，J Bacteriol, 2002,184:76-81 ;Westers 等，J Biotechnol，2006，123 ;211-224)。缺失WB800菌株的的蛋白酶基因Apri((编码稳定期后期 随细胞裂解释放到胞外的蛋白酶）和化rA /化rB(编码与细胞膜结合的蛋白酶），得到重 组菌 Dpr9AhtrA / B，其表达 a-amylase-A522-PreS2 产量达到 80mg / L，LipA 的产量可 达到llOOmg / L,进一步提高了目标蛋白产量化odama等，Adv Appl Biotechnol, 2012,8 : 163-17 巧。
[0003] 地衣芽胞杆菌作为一个新型表达系统，目前对其研究主要在于利用野生型表达其 自身的蛋白，对于该新型表达宿主的改造还处于初步的探索阶段，与枯草芽胞杆菌相比，地 衣芽胞杆菌生长温度高5-7度；其生长速率适中，容易使刚跨膜的未合适折叠的蛋白充分 折叠，分泌蛋白至培养基的能力大约是枯草芽胞杆菌的2倍，在特定优化的发酵工艺条件 下，特定蛋白表达水平可达到30mg / ml,为所见报道的所有芽胞杆菌表达水平最高者。还 未见构建同时缺失mpr (编码胞外金属蛋白酶）、vpr (编码丝氨酸蛋白酶）、ap巧（胞内丝氨 酸蛋白酶）、epr (编码微小胞外蛋白酶）、bpr (编码芽胞杆菌肤酶巧、wprA (编码与细胞壁 结合的蛋白酶）、ap巧（编码胞外碱性丝氨酸蛋白酶）、bprA (编码芽胞杆菌肤酶巧、hag (编 码鞭毛蛋白）和amyL(编码a-淀粉酶）的地衣芽胞杆菌宿主菌。构建高效分泌表达目标 蛋白的地衣芽胞杆菌宿主菌，具有重要的应用价值。本研究构建的目标蛋白表达系统，是一 种性能优异的原核表达系统。
【发明内容】
[0004] 本发明目的在于克服现有技术的缺陷，通过构建无痕敲除载体，敲除能抑制目标 蛋白表达的10个有关的基因，最终获得完全没有胞外蛋白酶活性的地衣芽胞杆菌宿主菌 株。
[0005] 本发明的另一目的是提供一种利用化10高效表达目标蛋白的方法。
[0006] 本发明的目的是该样实现的：
[0007] 采用冷冻保藏的地衣芽胞杆菌WX-02(2008年4月28日保藏于中国典型培养物保 藏中也，保藏编号为CCTCC N0;M208065)为出发菌。分析WX-02基因组序列。利用多种数 据库和软件，分析出WX-02中存在所有胞外蛋白酶（或肤酶）、与细胞壁结合和与细胞膜结 合的蛋白酶（或肤酶）W及位于胞内的蛋白酶（或肤酶）。从中选择要删除的10个蛋白酶 基因，其序列见SEQ ID NO. 1到10,从WX-02基因组序列中查得其具体的基因序列。例如根 据本实验测得的B. licheni化rmis WX-02全基因组序列中的amyL基因上下游序列，设计了 a -淀粉酶基因的两个同源臂的引物；amyKFl，amyKRl和amyKF2, amyKR2。
[0008] amyKFl ;5'-GCTCTAGA CCGAAACGATAAAACGGATG-3' 狂bal)
[0009] amyKRl ; 5'CCGTTTACGTGAAACTCTCCACCATTTTCCCTATATTTTC-3'
[0010] amyKF2 ：
[0011] 5'-GAAAATATAGGGAAAATGGTGGAGAGTTTCACGTAAACGG-3,
[0012] amyKR2 ;5'CGGGATCC GCAAAGCATAATGATGACGG-3,炬amHI)
[001引 WB. licheniformis WX-02的基因组DM作为模板，扩增得到上下游同源臂（A，B) 片段各500bp左右，再W amyKFl和amyKR2为引物，S0E-PCR连接上下游同源臂，得到片段 A+B，大小为1005bp。用限制性内切酶甜a I和BamHI双酶切A+B，得到的amyL(A+B)片段 与经同样双酶切处理过的温敏型敲除质粒T2(ori)连接，连接产物转化E. coli D册a。转 化子经PCR验证确定为阳性克隆后，抽质粒进行双酶切验证并测序。得到的重组敲除质粒 为T2-amyL。构建过程如图1。用同样的方法还构建了 T2-api'E，T2-hag，T2-mpr、T2-apri(、 T2-epr、T2-bpr、T2-wprA、T2-bprA。10个质粒的酶切验证结果如图2所示。
[0014] 将敲除质粒T2-hag转化到野生型菌株WX-02中，通过在45C单交换和37C双交 换，得到hag基因缺失的菌株化1，双交换验证结果如图3所示。同样的方法，在BL1的基础 上，依次叠加部分或完全删除另外9个基因。最终得到缺失突变株地衣芽胞杆菌化1-10,其 中 E5L10 即是 WX-02 ( A hag ; A mpr ; A vpr ; A ap;rX ; A 巧r ; A bpr ; A wprA ; A ap;rE ; A amyL ; AbprA)。其中敲除bprA基因（编码芽胞杆菌肤酶巧后，对宿主细胞影响最大，宿主细胞 完全无胞外蛋白酶活性。
[0015] 地衣芽胞杆菌化10保藏在中国典型培养物保藏中也（CCTCC)，编号为CCTCC NO: M2013400,保藏日期为2013年9月10日。
[0016] 在ME培养基中发酵，检测发酵液的特征。发现化10宿主菌聚谷氨酸（y-PGA)的 产量比野生型的WX-02菌株大为降低，只有野生型菌株WX-02的16. 8%，低聚谷氨酸含量有 利于降低发酵粘度，促进发酵过程传质，并有利于发酵产品的分离纯化。
[0017] 本发明提供一种利用宿主细胞化10表达目标蛋白的方法，是该样实现的：
[0018] 根据NCBI公布的B. subtillisl68基因组上P43启动子的序列设计一对引物P43F 和 P43R1，
[0019] P43F ;5'-GGAATTCTGATAGGTGGTATGTTTTCG-3' 巧coRI)
[0020] P43R1：5' -AAGCCGTTTTTGTTGTTTCATTTCATGTGTACATTCCTCTC-3^
[002。 PCR扩增得到启动子P43片段，大小为30化P。
[0022] 根据本实验测得的B. licheni化rmis WX-02全基因组序列中的amyL基因序列（见 SEQ ID NO. 9)，在NCBI上的登陆编号为MUY_00877,设计一对引物PamyLFl和PamyTR,
[0023] PamyLFl ：
[0024] 5'-GAGAGGAATGTACACATGAAATGAAACAACAAAAACGGCTT-3，
[00巧]PamyTR;5'-GAAGATCT CGCAATAATGCCGTCGCACTG-3,炬gill)
[002引 W B. licheniformis WX-02的基因组DM作为模板，PCR扩增得到amyl基因的编 码区（包括信号肤）和终止子片段，大小约为2040bp ;将P43启动子基因与目标蛋白基因纯 化回收后作为模板，用S0E-PCR连接在一起，纯化后回收，用EcoR I和Bgl II双酶切，酶切 后纯化回收检测。然后将PHY300PLK空质粒用同样的酶双酶切，纯化回收后与前面得到的 片段连接。连接产物转化E.coli D册a。既获得分泌表达载体PP43SAT。电转化至地衣芽 胞杆菌化10表达宿主，获得工程菌。用同样的方法，即可将脂肪酶基因和各种蛋白酶基因 与P43启动子基因连接构建表达载体，进而电转化至化10获得表达目标蛋白的工程菌株。 [0027] 对于淀粉酶基因来说，利用相同的方法同时转化淀粉酶缺缺失的 B. licheniformisWX-〇2(AamyL)，获得了 工程菌 B. licheniformis WX-〇2(AamyL; pP43SAT)作为对照，进行淀粉酶发酵。相比WX-02(AamyL;pP43SAT)(241.72U/血）， BL10(pP43SAT) (263. 18U /血）的淀粉酶酶活力提高了 9%，说明蛋白酶缺失宿主菌有利于 增强目标蛋白的表达。
[002引本发明的有益效果：
[002引 （1)首次在地衣芽胞杆菌WX-02中叠加敲除了 10个基因，得到系列突变株 BL