一株地衣芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于环境工程、生物领域，涉及一株具有好氧反硝化性能的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)B2菌株及其在高温环境下脱除废水中脱除水中的硝酸根与亚硝酸根的应用。
【背景技术】
[0002]农业生产方式发生了重大改变，农药、化肥大量使用且与日倶增。农药化肥施于农作物上，其中1 %?20 %附着在植物体上，其余80 %?90 %散落在土壤、水体、大气中。农药化肥通过地表径流或降水带入等方式进入地表水体，造成富营养化，甚至污染地下水。印染和纺织废水、炼油废水、肉类加工和饲料生产废水等都含有高浓度的氨氮和硝酸盐。另外，由于能源需求日益强劲，矿物燃料的燃烧、汽车尾气的排放量不断增加，大气中活性氮化合物含量近年来迅速增长。氮污染不仅破坏生态系统，也严重危害到人体健康。
[0003]在众多处理硝酸氮废水的研究中生物脱除法具有对环境影响程度轻、工艺简单等优点，作为一种绿色高效的处理技术而越来越被重视。而在废气脱氮治理方法中，生物过滤法作为一种低成本、高效率、无二次污染的方法，已成为大气污染控制领域热点之一。
[0004]最早提出好氧反硝化(aerobicdenitrificat1n)的是Robertson和KuenenJtMH在实验室中观察到在氧气存在的条件下发生了反硝化现象。国内外学者在好氧反硝化领域进行了广泛深入的研究，证明好氧反硝化较之传统反硝化技术存在明显优势。近年来，不断有好氧反硝化菌被分离出来，存在于副球菌属、假单胞菌属、产碱菌属、芽孢杆菌属等50多个属。然而这些报道的好氧反硝化菌大多生长于常温环境下(25?35°C)，关于高温条件下(40°C以上)的好氧反硝化菌报道较少，由于目前很多工业废水都超过40°C，高温菌可直接处理高温废水，节省成本。另外，在30?50°C均能保持高效反硝化效能的菌种更鲜有报道。生物法的其中一个缺点是容易受温度波动的影响，因此，筛选分离在较广温度范围下(包括尚温)具有尚效性能的好氧反硝化细菌的研究具有实际意义。
【发明内容】
[0005]本发明之目的是提供一种在较广温度范围下(包括高温)具有高效好氧反硝化性能的菌株及其用途。
[0006]本发明的目的通过以下技术方案实现:
[0007]本发明较广温度范围下具有高效好氧反硝化性能的菌株是地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)B2，该菌株具有以下特征:
[0008](I)菌落特征:菌落表面不光滑不透明，边缘不整齐;杆菌，菌体单个，成对或链状排列;革兰氏染色阳性;芽孢椭圆形，中生；
[0009](2)糖、醇类发酵试验显示为发酵型，接触酶、厌氧生长、V-P测定、硝酸盐还原、明胶液化、淀粉水解、酪素水解等实验均为阳性，氧化酶、卵磷脂酶、吲哚、酪氨酸、苯丙氨酸脱氨酶等实验均为阴性，可进行反硝化作用，能利用硝态氮或亚硝态氮生长；
[0010](3)该菌株的16S rDNA基因序列特征:其16S rDNA具有序列表所示的核苷酸序列，其16S rDNA具有序列的片段长度为1272bp，在GenBank中的登录号为N0.KT777466，与GenBank数据库中已知细菌的16SrDNA进行BLAST比对，结果表明该菌株与地衣芽孢杆菌(Bacillus Iicheniformis)的同源性为99%，其中与菌株BaciIIus Iicheniformisstrain AVl2最相似，同源性达99%。
[0011 ] 应用MEGA软件采用Neighbor-Joining法构建16S rDNA系统发育树，确定其进化地位，结合其形态特征和生理生化特征，该菌株最有可能是地衣芽孢杆菌属(Baci I IusIicheniformis)，并命名为Bacillus licheniformis B2。
[0012]所述地衣芽孢杆菌用于含氮废水的脱氮处理，或用于含NOx烟气脱硝处理。地衣芽孢杆菌B2对温度耐受程度强，在30?50°C条件下生长且具有高效的好氧反硝化能力，硝酸盐去除率均^ 99%，并且没有亚硝酸盐积累。此外，地衣芽孢杆菌B2对氧气的耐受性强，在
11.2mg/L溶解氧浓度下，硝酸盐去除率仍达98.7%,且没有亚硝酸盐积累。以上特性表明该菌株能应用于温度波动大、氧气含量高的实际高温废水或烟气中，将含氮污染物还原为氮气，达到脱氮的目的。
[0013]优选地，所述地衣芽孢杆菌B2用于30?50°C含氮废水的高效好氧反硝化脱氮处理。
[0014]优选地，所述地衣芽孢杆菌B2用于30?50°C烟气波动情况下的高效好氧反硝化脱硝处理。
[0015]所述地衣芽孢杆菌B2脱氮、脱硝处理的条件为:利用葡萄糖、蔗糖或丁二酸钠为碳源，控制C/N为6?15，pH为7?9，振荡转速为120?200rpm。
[0016]优选地，所述C/N为9，pH为8，振荡转速为160rpm。
[0017]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:
[0018](I)本发明提供的地衣芽孢杆菌生长温度范围广，且具有高效好氧反硝化能力，能应用于处理硝酸盐废水或含NOx的烟气。
[0019](2)该菌株可在30?50°C下在24小时内对初始浓度为140mg/L硝酸盐氮去除率达99%以上，并且没有亚硝酸盐积累。
[0020](3)该菌株的发现可解决温度波动对生物脱氮脱硝影响大的难题。
[0021 ] 本发明所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)B2，由中国典型培养物保藏中心保藏(简称CCTCC)，其保藏编号是CCTCC Ν0:Μ 2015590，保藏日期为2015年10月8日，保藏地址为中国武汉大学。
【附图说明】
[0022]图1为Bacilluslicheniformis B2的系统发育树图。
[0023]图2不同碳源下菌Bacillus licheniformis B2的反硝化性能比较图。
[0024]图3不同C/N下菌Bacillus licheniformis B2的反硝化性能比较图。
[0025]图4不同转速下菌Bacillus licheniformis B2的反硝化性能比较图。
[0026]图5不同pH下菌Bacillus licheniformis B2的反硝化性能比较图。
[0027]图6不同温度下菌Bacillus licheniformis B2的反硝化性能比较图。
[0028]图7为烟气脱硝生物过滤装置示意图，进气口1、雾化器增湿器2、温度控制器3，生物滴滤塔4、恒温水浴锅5、质量流量计6、出气口 7。
[0029]图8为在真实烟气环境下培养菌Bacillus licheniformis B2的反硝化性能图。
【具体实施方式】
[0030]下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
[0031]实施例1:菌种的分离、纯化及鉴定
[0032]本研究向玉米叶水解液中接入不含碳源的反硝化培养基，初始温度为40°C，160rpm的振荡培养箱中。培养24h后，以体积比为10%的接种量接入90mL无菌的含反硝化培养基的玉米叶水解液中。重复上述步骤3天后发现菌液生长良好，并且脱氮率达到了85%以上。经过富集培养后的菌液通过倍比稀释法后涂布平板以分离出单菌落。将菌液取ImL至装有9mL无菌水的试管中，充分混合后得到10—1梯度的菌悬液，以此类推制备10—2?10—8不同梯度的菌悬液，为了获得可以清晰观察的菌落形态，选取I O—4、I O—5、10—6三个梯度的菌悬液，各取0.1mL涂布至已制备好的带有溴百里酚蓝(BTB)显色的反硝化固体培养基上，倒置放入40°C恒温恒湿培养箱中。培养2天后，可见平板中长有单菌落，由于BTB指示剂的作用，发生反硝化作用的菌落周围产生蓝色晕圈。从平板中挑取形态不同且周围有蓝色晕圈的单菌落，在无菌的反硝化固体培养基中划线后放置在40°C恒温恒湿培养箱中培养，如此重复三次得到纯菌落。
[0033]在复筛阶段将上述分离得到后的不同形态的单菌落分别接种于装有90ml的无菌反硝化培养基中，在40°C，160rpm条件下振荡培养24小时，取培养后的菌液测量0D6QQ值以及培养液中的硝态氮浓度包括硝酸盐氮和亚硝酸盐氮，考察菌株在24h内的生长状况和硝态氮去除效果，最后筛选出一株优势菌株编号为B2，其24h内脱氮率大于95%。
[0034]将上述分离纯化得到的菌株进行生理生化鉴定及16SrDNA测序。PCR引物为通用引物ieSFA' -AGAGTTTGATCATGGCTCAG-37 (上游引物)和 16SR: 5' -GGTACCTTGTTACGAC TT-37(下游引物)ICR扩增反应条件为:94°C预变性Imin，经过30个循环，56°C退火Imin，72°C扩增2min，最后72°C延伸7min。得到的产物进行16S rDNA测序(上海英俊生物技术有限公司)，片段长度为1272bp。将测序结果在NCBI网站上进行BLAST，结果得出B2与Baci I Iuslicheniformis同源性达99%，命名为Bacillus licheniformis B2(GenBank登录号为KT777466)。利用MEGA软件进行多序列比，运用Neighbor-Joining法构建系统发育树，详见图1。为了进一步确定鉴定结果的可靠性，请广东省微生物分析测试中心对该菌进行生理生化鉴定，最终确定该菌为地衣芽孢杆菌BaciIIus licheniformis。
[0035]实施例2:地衣芽孢杆菌(BaciIIus licheniformis)B2反硝化性能测定
[0036]1、不同碳源下Bacillus licheniformis B2的反硝化性能
[0037]考察菌株B2对不同碳源的利用情况，包括葡萄糖、蔗糖、乙酸钠、丁二酸钠、柠檬酸钠这5种碳源。具体操作步骤如下: