对钒具有耐受性的芽孢杆菌及其用途的制作方法

本发明属于微生物领域，具体涉及一种对钒具有耐受性的芽孢杆菌及其用途。

背景技术：

重金属污染日趋严重，工业废弃物、农业废水和生活污水的大量排放，重金属污染物也被一起排放，造成水环境重金属污染。重金属被排入环境后，不容易降解且能在环境中长久性积累，重金属的处理不当将导致释放大量潜在致癌和致突变作用的有毒化合物，导致重金属污染对生物和环境的危害性非常严重，因此，加强重金属污染治理，提高人类健康和生态系统安全至关重要。

钒是一种银灰色金属，具有延展性、质坚硬、无磁性等特征，熔点1890±10℃，沸点3380℃，属于高熔点稀有金属之列。钒因其优异的物理化学性质，在工业方面发挥了重要的不可替代的作用，有金属“维生素”的美誉。近年来由于工业排放与人为排放，导致环境和生物体内钒不断的积累，引发日趋严重的钒污染问题。在钒冶炼和钒共生矿石的烧结中，产生微小的颗粒，比较容易挥发到大气中，造成大气钒污染。此外，煤和石油的燃烧、火山灰的喷发、废金属的熔炼等都会产生钒污染。钒具有氧化态的2、3、4和5价，钒的毒性随价态的增加而增加，五价钒毒性最高。进入大气中的钒的化学形态主要是钒氧化合物，如VO、V₂O₃、VO₂和V₂O₅等，这些钒氧化合物在大气中通过各种渠道与其他颗粒或化合物接触，产生协同作用，往往对生物更具有毒性。钒化合物吸入时具有刺激作用，急性吸入V₂O₅可引发支气管肺炎，甚至肺水肿。慢性吸入时，可以对神经系统和呼吸系统造成伤害，更严重导致中毒型肾病和蛋白代谢异常等。

钒污染带来的问题越来越严重，导致一系列动物和人类的生存健康事件和隐患发生，引起了世界各国的高度重视，并且制定出相应的法律法规，严格控制钒的排放，降低由钒引起的环境污染。目前，治理修复钒污染技术主要采用物理化学、生物修复技术。物理化学修复技术尽管有一定的成效，但是因为突然、水体本身理化性质以及内部结构成分的复杂性，且价格昂贵，操作复杂，而且容易造成二次污染等诸多限制性因素的存在，造成大多数方法还处在在实验室阶段，短期间内还不能应用于实际污染治理。

生物修复技术是利用生物本身具有结构和化学特性治理环境污染的一种现代方法，达到去除环境中的重金属或降低重金属毒性的目的。水体生物修复主要是微生物修复技术，目前该方法已经成为各国环境保护工程科学和技术研究领域内的一个热门话题。微生物修复技术是通过某些微生物自身具有的对重金属的吸收、沉淀、转化等作用来达到清除环境中重金属的目的，或者是减少重金属毒害的一种新技术。微生物在治理重金属污染的多种技术中具有优异的表现，首先微生物通过自身结构和大分子物质吸附、固定以及吸收重金属达到清除环境中重金属的目的；其次微生物对重金属的还原氧化作用，改变重金属的价态，以此降低环境中重金属的毒性；另外有些微生物与根际具有共生作用，可以改变土壤中根际微环境来提高植物对重金属的吸收和固定，从而达到修复重金属污染的目的。目前，在钒的生物修复方面还没有很好的实用方案。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是对被重金属污染的环境的生物修复提供技术方案。本发明解决技术问题的技术方案是提供了一种芽孢杆菌Bacillus sp.PFYN01，其保藏号为CCTCC NO：M2016174。

该芽孢杆菌Bacillus sp.PFYN01已于2016年4月5日向中国典型培养物保藏中心(CCTCC)提交生物保藏，中国典型培养物保藏中心地址为中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC NO:M2016174。

进一步的，所述芽孢杆菌Bacillus sp.PFYN01，其16sRNA的对应核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

此外，本发明还提供了上述芽孢杆菌Bacillus sp.PFYN01在去除环境钒毒性中的用途。所述用途包括在单独钒异常或除钒异常外还有Cd、Cr、Pb、Ni、Co、Zn中一种至多种金属异常环境中去除钒毒性的用途。

进一步的，上述的环境为液体环境。

同时，本发明还提供了一种钒毒性去除剂。该钒毒性去除剂是以上述的芽孢杆菌Bacillus sp.PFYN01为主要活性成分制备而成的。

此外，本发明还提供了一种去除环境中重金属钒毒性的方法。该方法包括以下步骤：在被钒污染的环境中引入上述的芽孢杆菌Bacillus sp.PFYN01，引入方式为直接将所述菌株生长至对数期的菌液或将以所述菌株为主要活性成分的制剂引入液体环境中生长，以达到去除环境重金属钒毒性的目的。所述液体环境pH值为4～11。

所述的菌液可按以下方法制备：将上述的芽孢杆菌Bacillus sp.PFYN01在基本培养基中培养，配方为胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L和pH 7.0，待其生长至对数期，将所述对数期菌液引入钒污染液体环境中，达到去除环境钒毒性的目的。

其中，上述方法中的处理温度为15～50℃，处理的较佳温度为30℃左右。

本发明的有益效果在于：

1、本发明所提供的芽孢杆菌Bacillus sp.PFYN01对钒具有较高的耐受性，而且能够耐受高浓度Cr(800mg/L)和Pb(1200mg/L)等其它重金属，其钒耐受能力大于2000mg/L。同时该菌株Bacillus sp.PFYN01为芽孢杆菌属Bacillus首次报道可以将五价钒还原成四价钒，为高钒污染环境治理提供菌种资源。

2、本发明提供的细菌只需要提供简单的C源、N源和无机盐即可在复杂的不同重金属培养环境中存活并生长，生命力强，生长速度快，生物量大，对多种重金属具有较高的耐受性，耐受浓度高。

3、本发明所述的钒生物还原剂能够将在高浓度下将五价钒还原成四价钒，还原能力高达46.67％。

4、本发明所述的细菌能耐重金属Cd、Cr、Pb、Ni、Co、Zn，尤其对钒的耐受力高达2000mg/L，对Pb的耐受力也高达1200mg/L。基于对多种重金属的高耐受力，便于各种极端污染水体中钒毒性物质去除，具备简单、便捷、高效的优点。

附图说明

图1、菌株Bacillus sp.PFYN01的菌落照片，示菌落特征。

图2、菌株Bacillus sp.PFYN01的系统发育分析树。

图3、菌株Bacillus sp.PFYN01在含钒LB培养基溶液中培养后的照片。培养后能将含钒LB培养基溶液的颜色变为深蓝或趋于黑色，可见能有效的将五价钒还原成四价钒。

本发明芽孢杆菌Bacillus sp.PFYN01已于2016年4月5日向中国典型培养物保藏中心(CCTCC)提交生物保藏，中国典型培养物保藏中心地址为中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC NO:M2016174。

具体实施方式

本发明采集四川攀枝花市钒钛磁铁矿西渣堆场的排水道中采集的钒污染水，经过筛选、富集、分离得到一株细菌，经鉴定，其16sRNA基因序列与芽孢杆菌Bacillus sp.Cp-h36有99％的相似性，命名为芽孢杆菌Bacillus sp.PFYN01。该细菌已于2016年4月5日向中国典型培养物保藏中心提交生物保藏，保藏号为CCTCC NO:M2016174。

该菌的适合培养条件为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L和pH 7.0。实验证明利用该菌株可制得高耐钒微生物还原剂，用于含钒废水处理。此外该菌具有高耐重金属特性，可以制备极端环境下重金属毒性去除剂；特别是制备去除水体中重金属钒毒性的生物还原剂，能将溶液中高毒的五价钒还原成低毒的四价或其它价态钒。

实施例1 细菌的获取和分离

1、分离、纯化细菌的过程：

(1)取四川四川攀枝花市钒钛磁铁矿西渣堆场排水道中含钒污染水，静置2h，取1mL上清加入到50mL含重金属钒为10mg/L的液体培养基中，30℃ 120rpm培养4d；

(2)取(1)中培养4d的液体培养基1mL加入到50mL含重金属钒为50mg/L的液体培养基中，30℃ 120rpm培养4d；

(3)取(2)中培养4d的液体培养基1mL加入到50mL含重金属钒为100mg/L的液体培养基中，30℃ 120rpm培养4d；

(4)取(3)中培养4d的液体培养基1mL加入到50mL含重金属钒为200mg/L的液体培养基中，30℃ 120rpm培养4d；

(5)取(4)中培养4d的液体培养基1mL加入到50mL含重金属钒为400mg/L的液体培养基中，30℃ 120rpm培养4d；

(6)取(5)中培养4d的液体培养基1mL加入到50mL含重金属钒为800mg/L的液体培养基中，30℃ 120rpm培养4d；

(7)取(6)中培养4d的液体上清液1mL涂布于含V⁵⁺(20mg/L)的固体培养基上，30℃恒温培养箱培养；

(8)48h后挑取已生长的单菌落，再分别多次划线生长，纯化得到耐钒单菌落。命名为PFYN01

上述固体培养基配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、琼脂粉15g/L、氯化钠10g/L和pH 7.0。

上述液体培养基配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L和pH 7.0，添加不同浓度钒(10、50、100、200、400、800mg/L)。

实施例2 细菌形态特征及生物学鉴定

1.形态特征

挑取实施例1得到的单克隆菌落划线接种在LB固体培养基上，将平板倒置于恒温培养箱中，30℃培养24h，观察其菌落形态。Bacillus sp.PFYN01形成近似圆形，表面光滑湿润，边缘不整齐，质地软，乳白色，色素不扩散，参见图1。

2.生理生化特性

将实施例1所得的单克隆菌落接种至LB液体基本培养基中，取对数生长期的Bacillus sp.PFYN01菌株按照《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等，2001)进行革兰氏染色、淀粉水解试验、油脂水解实验、甲基红实验、H₂S实验、明胶水解试验、糖发酵实验，结果见表1.。

表1菌株Bacillus sp.PFYN01生理生化特性

注:“+”为阳性或产酸，“-”为阴性或不产酸。

3. 16sRNA特性及系统发育树构建

提取细菌基因组DNA并进行PCR扩增，引物是细菌16sRNA PCR通用引物(上游引物(SEQ ID No.2)27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,下游引物(SEQ ID No.3)1492R：CGGTTACCTTGTTACGACTTC)，Taq聚合酶为TaKaRa公司生产的rTaq酶，PCR系统为：10×PCR缓冲液5μL，dNTP(2.5mmol/L)4μL，27F(10μM)1uL，1492R(10μM)1uL，基因组DNA 1uL，ExTaq酶(5U/uL)0.2μL，加重蒸水37.8μL。

PCR反应程序为：①94℃预变性5min；②94℃变性30s；③54℃退火30s；④72℃延伸1min30s；⑤72℃延伸10min；⑥4℃保存。其中重复步骤②、③、④34次，再进行步骤⑤、⑥。

PCR产物采用2.0％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收。回收产物由北京鼎国昌盛生物公司进行测序。将测得的16sRNA的序列结果提交到GenBank数据库，并利用Blastn将菌种的16sRNA的序列与GenBank数据库中已登录的序列进行同源性比对，用ClustalX进行序列比对,然后采用Mega4.0软件进行系统发育分析。该菌株的系统发育分析树见图2，其16sRNA基因序列与芽孢杆菌Bacillus sp.Cp-h36有99％的相似性，根据结果，命名为芽孢杆菌Bacillus sp.PFYN01。

实施例3：细菌对重金属的最大耐受浓度

挑取实施例1得到的单克隆菌落，接种于LB液体培养基中，30℃、120rpm振荡培养36h，收集细菌浓度OD₆₀₀为1.2，将菌液按照1、10、100、1000、10000的比例稀释制备梯度菌液；并制备不同浓度重金属LB固体培养基。分别吸取各浓度菌液50μL至各种重金属浓度平板涂布均匀，在30℃培养，每隔24h观察记录细菌生长情况，120h内抑制其出现明显生长的最低重金属浓度，即该菌的最大耐受浓度。

上述不同浓度重金属固体培养基分别为LB固体培养基中添加Cr、Pb、Cu、Ni、Co、Cd、Zn或V。Cr添加浓度为100mg/L、200mg/L、400mg/L、800mg/L、1600mg/L；Pb添加浓度为100mg/L、200mg/L、400mg/L、800mg/L、1200mg/L、1600mg/L；Cu添加浓度为1mg/L、2mg/L、4mg/L、8mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L；Ni添加浓度为10mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L、160mg/L、200mg/L、320mg/L；Co添加浓度为10mg/L、20mg/L、40mg/L、50mg/L、100mg/L、160mg/L；Cd添加浓度为10mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L、100mg/L、160mg/L；Zn添加浓度为10mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L、100mg/L、160mg/L；V添加浓度为50mg/L、125mg/L、250mg/L、500mg/L、1000mg/L、2000mg/L。

菌株Bacillus sp.PFYN01能在重金属Cd、Cr、Pb、Cu、Ni、Co、Zn含量较高的固体培养基中生长，结果表明，菌株Bacillus sp.PFYN01对V、Cd、Cr、Pb、Ni、Co、Zn这几种重金属均有较高的耐受性，菌株Bacillus sp.PFYN01对重金属的抗性为：V>Pb>Cr>Ni>Zn＝Cd>Co>Cu。

表2 菌株Bacillus sp.PFYN01对重金属的最大耐受浓度(单位：mg/L)

由于Bacillus sp菌种中有钒耐受作用的菌种报道，我们用相同或近似实验条件，对比分析已报道芽孢杆菌属Bacillus的钒耐受性菌种。其中Ilunga Kamika(2014)报道菌种Bacillus licheniform对钒具有耐受性，其耐受性为200mg/L(Effect of vanadium toxicity at its different oxidation states on selected bacterial and protozoan isolates in wastewater systems.Environmental Technology.35(16):2075-2085)，而本发明的不同种菌株Bacillus sp.PFYN01对钒耐受性高达2000mg/L，显著高于芽孢杆菌属Bacillus licheniform对钒的耐受性。另外，Jennifer(2004)报道了芽孢杆菌属另一菌种Bacillus subtilis对钒的耐受性，其值达5000mg/L，但是，其对铬Cr敏感，不耐受钒(Methods evaluating vanadium tolerance in bacteria isolated from crude oil contaminated land.J.Microbiological Methods.58:87-100)。而本试验分离的Bacillus sp.新菌株Bacillus sp.PFYN01不但对钒具有较高的耐受性，而且能够耐受高浓度的Cr(800mg/L)和Pb(1200mg/L)等其它重金属，对于综合利用菌株Bacillus sp.PFYN01修复含其它重金属的钒污染水体具有很好应用前景。

实施例4：细菌对五价钒的还原效果

挑取实施例1得到的单克隆菌落接种到LB液体培养基中，在30℃、120rpm振荡培养18h，获得对数期菌液；按照0.2％的体积分数接种量将菌液接入LB液体培养基(含V⁵⁺浓度为30mmol/L)中，振荡培养48h；然后将培养液6000rpm离心10min，取离心液上层清液10mL，按照陈富于《钒电池电解液中不同价态钒的分光光度分析》(光谱学与光谱分析，2011,31(10):2839-2842)方法测定上清液中五价钒和四价钒浓度。

结果表明，菌株Bacillus sp.PFYN01能使含钒LB培养基溶液颜色由黄转变为深蓝或趋于黑色，参见图3。通过分光光度法测定溶液中V⁵⁺和V⁴⁺含量，测得溶液中4价和5价钒总浓度为25.6mmol/L，V⁴⁺的浓度为14.0mmol/L，V⁵⁺的浓度为11.6mmol/L，其它4.4mmol/L的钒转变为3价或2价。由此，菌株Bacillus sp.PFYN01能使V⁵⁺还原成V⁴⁺，转化率为46.7％，显著降低溶液中钒毒性。菌株Bacillus sp.PFYN01这种对钒的还原特性在芽孢杆菌属Bacillus菌株中尚未见报道。