一种南极低温适生解淀粉芽孢杆菌EZ15‑07及其应用的制作方法

本发明属于生物技术和农业病害防治
技术领域：
，涉及一种南极低温适生解淀粉芽孢杆菌ez15-07及其应用。
背景技术：
：近年来在河北等地区大规模爆发了一种由菠萝泛菌(pantoeaananatis)引起的玉米细菌性褐腐病，症状表现为叶梢枯死卷曲，叶脉产生黄色病斑，茎秆处黄褐色干腐。长期以来人们对玉米细菌性病害关注较少，由于缺乏有效的防控手段，玉米细菌性病害给农业生产带来的损失往往十分严重。我国是玉米生产和消费大国，玉米播种面积以及产量都位居世界第二。近年来，由于玉米播种面积扩大、气候条件变化、新品种的推广以及耕作制度的改变，玉米病害的发生呈上升趋势，给农业生产以及食品安全带来了严重危害。河北是玉米种植大省，无论种植面积还是产量均居华北地区首位，玉米病害是影响河北地区玉米产量与品质的主要原因。以往多采用化学农药防治田间病害的发生，但该种防治方式的弊端日渐突出：一方面容易使病原菌产生抗药性，另一方面更与国家大力倡导的“两减”政策相违背。目前，很多人开始从生防的角度来寻找答案，并且已经有很多生物农药应用于生产实践中，已经取得了很好的经济效益和生态效益。根际微生物种类繁多，其中，有很多细菌能够促进植物生长、防治植物病害、增加作物产量等，这类微生物一般被称为根围促生菌(plantgrowth-promotingrhizobacteria,简称pgpr)。他们与植物之间有很好的互利共生关系，不仅能使植物产生诱导抗病性，而且可以提高作物的产量和品质。所以，根围促生菌在植物病害防治中有很重要的应用价值。技术实现要素：本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌，有针对性地解决当前植物病害防治中存在的问题。该菌为低温适生菌，对玉米细菌性褐腐病菌等病原菌有抑菌效果，有潜在的生防价值。本发明的另一目的是提供该解淀粉芽孢杆菌的应用。本发明涉及的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07，于2016年12月26日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为cgmccno.13494。所述解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07cgmccno.13494，是一种从南极企鹅聚集地土壤中分离得到的生防芽孢杆菌。经80℃水浴后稀释涂平板获得。所述解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07cgmccno.13494为革兰氏阳性细菌，杆状。所述解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07cgmccno.13494的16srrna的部分核苷酸具有如序列表seqidno.1所示序列。所述解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07cgmccno.13494的gyrb的部分核苷酸具有如序列表seqidno.2所示序列。本发明涉及的菌株，参照《芽孢杆菌属》(蔡妙英等译.农业出版社，1988年)和《微生物分类学》(张继忠.上海复旦大学出版社，1995)的检索表进行检索，对其在生理生化上进行鉴定，以及16srrna和gyrb基因序列结果，经多相分类鉴定为解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)，命名为ez15-07。所述解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07cgmccno.13494能在10℃生长，是一种低温适生菌。一种由所述的解淀粉芽孢杆菌ez15-07制备的生防菌剂。所述的生防菌剂优选通过以下方法制备得到:将ez15-07菌株接种在lb培养基上，过夜培养，然后将活化的ez15-07菌株转接到landy培养基中进行摇瓶发酵，温度为30℃，摇床转速为200rpm，发酵时间35-40小时至菌量达到2.06×109cfu/ml；其中landy培养基组成为：20g葡萄糖，5gl-谷氨酸，0.5gmgso4，0.5gkcl，1gkh2po4，0.15mgfe2so4·6h2o，5.0mgmnso4·h2o，0.16mgcuso4·5h2o，ph7.0，1000ml蒸馏水。所述的解淀粉芽孢杆菌ez15-07在抑制玉米细菌性褐腐病菌、水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、小麦赤霉病菌和/或玉米轮枝镰孢菌中的应用。应用方法是发酵培养ez15-07获得发酵液，对发酵液进行稀释后叶面喷施。所述的解淀粉芽孢杆菌ez15-07在制备防治玉米细菌性褐腐病菌、水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、小麦赤霉病菌和/或玉米轮枝镰孢菌的生防菌剂中的应用。本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07菌株，是一种对玉米细菌性褐腐病菌、水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、小麦赤霉病菌和/或玉米轮枝镰孢菌有良好防效的芽孢杆菌，是一种低温适生菌，对环境无污染，具有潜在的应用价值。附图说明图1ez15-07生长情况a为ez15-07，b为对照菌株fzb42，c为ez10-01图2ez15-07对玉米细菌性褐腐病菌的抑菌效果图3ez15-07对玉米细菌性褐腐病的田间防效a为ck，b为ez15-07图4ez15-07菌株对水稻白叶枯病菌的抑菌效果图5ez15-07菌株对水稻细菌性条斑病菌的抑菌效果图6ez15-07对小麦赤霉病菌的抑菌效果图7ez15-07对玉米轮枝镰孢菌的抑菌效果生物材料保藏信息ez15-07，分类命名为解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciens，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年12月26日，保藏地位为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.13494。具体实施方式下面结合实施例进一步说明本发明。实施例1：本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07菌株的筛选。用于分离的土壤样品均来自南极企鹅聚居地，土样采集于距地面10-15cm处。称取5g土样于45ml生理盐水中，摇床上震荡30分钟，静置使澄清。吸取上清液分别用无菌水稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5五个浓度梯度，80℃水浴10min。吸取200μl涂lb平板，37℃过夜培养。待平板上长出菌落后，挑取单菌落，划线纯化后编号保存。实施例2：本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07菌株的抗低温筛选过程。具体实施步骤：培养基：1c培养基成分浓度1×1c5×1c蛋白胨0.74.2g21g氯化钠0.53g15g大豆粉0.31.8g9g总体积加水至600ml加水至600ml土壤浸出液终培养基成分终浓度体积(ml)5×1c1×5020％葡萄糖0.1％1.25土壤浸出液10％25水173.75将菌株接种到上述液体培养基中，37℃培养过夜，取10μl菌液点到距离固体培养基平板中心2.5cm的十字交叉点，每个菌株5个重复，分别放置在4℃、10℃、14℃、18℃、30℃培养箱中培养，每天记录菌株生长情况，记录15天。该菌株能在温度≤10℃的环境中生长，我们将在此温度下，能在一周内显现菌落的菌株记为低温生长菌株。进一步测试该菌株可以在10℃的条件下生长，且平板培养7d后，将平板上显示出菌落的区域连同培养基一并从平板上剥离，置于离心管中并加入1ml无菌水震荡10min。震荡后取上清稀释涂平板计数。此时，菌量增长为5.85×107cfu/ml，是初始菌量的2.9倍。菌量的增长率是对照菌株fzb42的2.72倍。生长情况如附图1所示。实施例3：本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07菌株的16srrna基因的pcr扩增和序列测定。将该菌株接种于液体lb培养基，180rpm，37℃震荡培养10小时，离心收集菌体，悬浮后加入溶菌酶和sds破壁，采用酚—氯仿法提取基因组dna，用正向引物27f(5’-agagtttgatcmtggctcag-3’)和反向引物1492r(5’-ggytaccttgttacgactt-3’)，对16srrna基因进行pcr扩增，将其进行pcr产物回收以后送测序进行测序。pcr条件为：95℃，4min；94℃，1min；50℃，1min；72℃，2min；34cycle；72℃，10min，4℃保存。16srrna基因序列长度约为1400bp，在genbank中与bacillusamyloliquefaciensrx-34相似性为99％。其结果如seqidno.1所示。实施例4：本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07菌株的gyrb基因的pcr扩增和序列测定。将该菌株接种于液体lb培养基，180rpm，37℃震荡培养10小时，离心收集菌体，悬浮后加入溶菌酶和sds破壁，采用酚—氯仿法提取基因组dna，用正向引物up1f(5’-gaagtcatcatgaccgttctgcaygcnggnggnaarttyga-3’)和反向引物up2r(5’-agcagggtacggatgtgcgagccrtcnacrtcngcrtcngtcat-3’)，对gyrb基因进行pcr扩增，将其进行pcr产物回收以后送测序进行测序。pcr条件为：95℃，4min；94℃，1min；62℃，1min；72℃，2min；34cycle；72℃，10min，4℃保存。gyrb基因序列长度约为1200bp，在genbank中与bacillusamyloliquefacienscc178相似性为100％。其结果如seqidno.2所示。参照《芽孢杆菌属》(蔡妙英等译.农业出版社，1988年)和《微生物分类学》(张继忠.上海复旦大学出版社，1995)的检索表进行检索，对其在生理生化上进行鉴定，以及16srrna和gyrb基因序列结果，经多相分类将细菌ez15-07鉴定为解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)。实施例5：本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07菌株的发酵培养。将ez15-07菌株接种在lb培养基上，过夜培养，然后将活化的ez15-07菌株转接到landy培养基中进行摇瓶发酵，温度为30℃，摇床转速为200rpm，发酵时间为38小时。其中landy发酵培养基组成为：20gglucose，5gl-glutamicacid，0.5gmgso4，0.5gkcl，1gkh2po4，0.15mgfe2so4·6h2o，5.0mgmnso4·h2o，0.16mgcuso4·5h2o，ph7.0，1000mldistilledwater。摇瓶发酵38h后菌量达到2.06×109cfu/ml。实施例6：本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07菌株对玉米细菌性褐腐病菌的抑菌作用。采用平板抑菌法，吸取5ml液体培养18h的玉米细菌性褐腐病病原菌菌液于放凉至50℃左右的lb培养基中摇匀后倒平板吹干。在上述平板中放入无菌滤纸片，吸取液体培养18h的芽孢杆菌菌液5μl滴加于滤纸片之上，37℃恒温培养20h。观测ez15-07对玉米细菌性褐腐病菌的抑菌效果，抑菌圈平均直径为12.3mm，如附图2所示。实施例7：通过发酵液能够抑制玉米细菌性褐腐病，具体过程为：对菌株ez15-07进行发酵，发酵液稀释100倍后进行叶面喷施处理。在玉米的灌浆期进行叶面喷施，其生防效果可达59.3％。发酵培养条件为：将ez15-07菌株接种在lb培养基上，过夜培养，然后将活化的ez15-07菌株转接到landy培养基中进行摇瓶发酵，温度为30℃，摇床转速为200rpm,发酵时间为38小时。田间防效如附图3所示。实施例8：本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07菌株对水稻白叶枯病菌的抑菌作用。采用平板抑菌法，在150ml的na培养基中加入培养好水稻白叶枯病菌5ml，倒na平板，每个平板放四个灭菌的滤纸片，然后吸取5μl的芽孢杆菌菌悬液滴在滤纸片上，28℃培养3天后观察结果。重复3次，观测菌株ez15-07对水稻白叶枯病菌的抑菌效果。抑菌圈平均直径为25.3mm，如附图4所示。实施例9：本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07菌株对水稻细菌性条斑病菌的抑菌作用。采用平板抑菌法，在150ml的na培养基中加入培养好水稻细菌性条斑病菌5ml，倒na平板，每个平板放四个灭菌的滤纸片，然后吸取5μl的芽孢杆菌菌悬液滴在滤纸片上，28℃培养3天后观察结果。重复3次，观测菌株ez15-07对水稻细菌性条斑病菌的抑菌效果。抑菌圈平均直径为15.1mm，如附图5所示。实施例10：本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07菌株对小麦赤霉病菌的抑菌作用。采用平板对峙法，倒好pda平板，在平板中央放置直径1cm的小麦赤霉病菌菌块，在其四周距离2cm处对称放置四个滤纸片，在滤纸片上滴加5μl的芽孢杆菌发酵液，重复三次，在25℃光照培养箱中培养3天，观测ez15-07对小麦赤霉病菌的抑菌效果，抑菌圈平均直径为31mm，如附图6所示。实施例11：本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07菌株对玉米轮枝镰孢菌的抑菌作用。采用平板对峙法，倒好pda平板，在平板中央放置直径1cm的玉米轮枝镰孢菌菌块，在其四周距离2cm处对称放置四个滤纸片，在滤纸片上滴加5μl的芽孢杆菌发酵液，重复三次，在25℃光照培养箱中培养3天，观测ez15-07对玉米轮枝镰孢菌的抑菌效果，抑菌圈平均直径为22mm，如附图7所示。<110>南京农业大学<120>一种南极低温适生解淀粉芽孢杆菌ez15-07及其应用<160>2<210>1<211>1451<212>dna<213>解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07<220><223>16srrna<400>1gacggggcgctctatactgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttag60cggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaa120accggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttc180ggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcacc240aaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacgg300cccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacgg360agcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaa420caagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaac480tacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgt540aaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagg600gtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcgg660tgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaact720gacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgcc780gtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcat840taagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggc900ccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtc960ttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtg1020gtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgca1080acccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaa1140ccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacg1200tgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatc1260tgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaat1320cgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacac1380cacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacctttaggaccagccgccgaaggg1440acagagtt1448<210>2<211>1138<212>dna<213>解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07<220><223>gyrb基因<400>2cgcgctttttcaagattaaaatcttctccgattcctgttccgagggccgtgatcattgat60ctgacctcattgtttgagagaattttatcaagtctggctttctcaacgttcagaatctta120ccgcgcagcggcagaatggcttggaaatgacggtcccgtccctgtttcgctgatccgccc180gcagagtcaccctctacgatatacagctcggaaatgctcggatctttagaagaacagtcc240gccagtttgcccggcagattggaaatctcaagcgcacttttgcggcgggtcaattcccgc300gcttttttcgctgccatccgcgctcttgcggccattaaacctttttcaacgattttgcgg360gctgagtccggattttcaagaaggaatgtttccagcgcagaagaaaacagcgtatcagtg420atcgttctcgcttcggagttgccgagcttcgttttcgtctgcccttcgaattgcggatca480gggtgcttaattgaaataatggcagtcagcccttctctcacatcatccccgcttaaattc540ggatcattttctttgaaaatcccttttcttcttgcatagtcgtttatgacacgggtcaga600ccggttttaaatccggcttcgtgcgtcccgccttcgtatgtgttgatgttatttgtgaaa660gaataaatgttgcttgtatagctgtcgttgtattgcaacgcaacttcaaccgttatgccg720tctttctcgccttcgatataaatcggctcttcatgaacgacttctttggaacggtttaag780tactcaacatagcttttgattccgccttcgtagtggtactcgtttttccgttcttgtcct840tcacgtttgtcttcaatcgtgatgtttacgccttttgtcaggaaggccaattcccggaca900cggtttgaaagcagatcatagtcgtatacgattgtttctttgaagatttccggatccgga960acgaagtgcgtaatcgttccggtcttatcagtatcaccgatcacttcaagatcagccaca1020ggtacaccgcgctcgtacgcctgatagtggatttttccgtcacgatgaaccgtaacgtca1080agagtggtcgacaaggcgtttacgacggacgcccctacaccgtgaagaccgccggata1138当前第1页12