具有钝化重金属功能的解淀粉芽孢杆菌及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)及其应用，其中，所述解淀粉芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.10126，命名为cd?B。本发明还公开了一种含有该解淀粉芽孢杆菌的组合物和一种钝化重金属的方法。本发明的解淀粉芽孢杆菌用于重金属的钝化效果评估中，以土壤中的重金属镉为例，土壤可交换态镉在15d内可由39.47mg/kg降到0.08mg/kg，这说明本发明提供的解淀粉芽孢杆菌对土壤中的镉具有极强的钝化能力。并且，采用本发明的解淀粉芽孢杆菌对重金属钝化，操作简便，能耗小，不会造成二次污染，并且周期较短，具有较高的经济效益和社会效益。CGMCC No. 1012620141202
【专利说明】
具有钝化重金属功能的解淀粉芽孢杆菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌，具体地，涉及一株具有钝化重金属功能的解淀 粉芽孢杆菌及其应用，以及含有该解淀粉芽孢杆菌的组合物和一种钝化重金属的方法。
【背景技术】
[0002] 随着我国工业化和城镇化飞速发展，工业规模的不断扩大，住宅、公路、铁路及各 类公共设施的建设等侵占了大量耕地，以至耕地面积急剧减少。而且大量可用耕地因工矿 排污灌溉农田、农药化肥的大量施用以及固体废弃物的堆放等遭受污染，导致环境质量恶 化，绿色植被受到侵蚀，农作物大量减产或具有毒性。重金属污染土壤具有隐蔽性，累积性， 滞后性，一旦发生便很难恢复。目前，我国土壤受镉、镍、砷、铜、铅、汞等重金属污染严重，导 致耕地土壤中有益菌大量减少，自净能力减弱，影响农作物的产量与品质。耕地是农业经济 和生态环境可持续发展的必要条件，耕地资源的持续开发利用关系到国民经济及粮食安全 问题，因此，耕地的保护及治理迫在眉睫。
[0003] 近年来，"镉大米"事件在南方地区多有发生。由于耕地土壤受到重金属镉的污染， 导致稻米中镉含量超标。镉是人体非必需元素，具有一定的致癌和致突变性，少量进入人体 便可通过生物放大和生物积累对人体产生一系列损伤，在人体内累积性，长期会导致急性 肺炎、肺水肿，损害肾功能等。镉的水溶性强、活性大、毒性高、难降解，目前已成为农业环境 中超标率最高的重金属污染物，镉污染耕地已涉及11个省25个地区，给人们的生活生产带 来很多负面影响。
[0004] 重金属污染土壤的修复方法可分为物理法、化学法以及生物法。物理方法往往工 程量大，能耗大；化学方法大多花费高，易造成二次污染；生物法中的植物修复受到较多研 究人员的青睐，但植物生长缓慢，修复周期长。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的为了克服现有技术修复重金属污染工程量及能耗大，或者是容易造 成二次污染，或者修复周期长的缺陷，提供一株能够在简单操作的条件下，无污染的且修复 周期短的对重金属进行钝化的解淀粉芽孢杆菌及其应用。
[0006] 为了实现上述目的，一方面，本发明提供了 一种解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)，其中，所述解淀粉芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No. 10126。
[0007] 第二方面，本发明提供了一种组合物，其中，该组合物含有如上所述的解淀粉芽孢 杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)的菌体。
[0008] 第三方面，本发明提供了如上所述的解淀粉芽孢杆菌和/或如上所述的组合物在 重金属钝化中的应用。
[0009] 优选的，所述重金属为镉。
[0010] 第四方面，本发明提供了一种钝化重金属的方法，该方法包括：将如上所述的解淀 粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens),和/或如上所述的组合物加入到含有重金属 污染的环境中，以对所述重金属进行钝化。
[0011] 优选的，所述重金属为镉。
[0012] 本发明的解淀粉芽孢杆菌用于重金属的钝化效果评估中，以土壤中的重金属镉为 例，土壤可交换态镉在15d内可由39. 47mg/kg降到0. 08mg/kg，这说明本发明提供的解淀粉 芽孢杆菌对土壤中的镉具有极强的钝化能力。并且，采用本发明的解淀粉芽孢杆菌对重金 属钝化，操作简便，能耗小，不会造成二次污染，并且周期较短，具有较高的经济效益和社会 效益。
[0013] 本发明的其它特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
[0014] 生物保藏
[0015] 本发明的菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)，被命名为 cd-B，并于2014年12月02日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101) (保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 10126。
【具体实施方式】
[0016] 以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0017] 第一方面，本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)， 其中，所述解淀粉芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No. 10126。
[0018] 本发明的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)分离自安徽宣城的烟 植土壤。
[0019] 本发明提供的解淀粉芽孢杆菌经过培养能够产生大量解淀粉芽孢杆菌的活菌体， 所述培养的方法没有特别的要求，只要是能使所述解淀粉芽孢杆菌增殖即可，例如可以按 照IO 7CFlVmL的接种量将解淀粉芽孢杆菌的活菌体接种于LB培养基中，并且在好氧条件 下，在25-38°C的温度下培养8-72小时后，得到培养液。
[0020] 本发明可以进一步分离上述培养液中的解淀粉芽孢杆菌的活菌体，所述分离的方 法没有特别的限制，只要是能从培养液中富集菌体即可，例如可以通过离心和/或过滤的 方法实现，所述离心和所述过滤的条件可以为公知的条件，本发明在此不再赘述。
[0021] 本发明提供的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)的16s rDNA的核 苷酸序列如SEQ ID No :1所示。
[0022] 第二方面，本发明提供了一种组合物，其中，该组合物含有如上所述的解淀粉芽孢 杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)的菌体。
[0023] 本发明的发明人在研究的过程中意外的发现，本发明的解淀粉芽孢杆菌的死菌体 和活菌体均能够有效的对金属进行钝化。因此，如上所述的解淀粉芽孢杆菌的菌体可以为 活菌体，也可为死菌体，还可以为活菌体和死菌体的混合菌体。
[0024] 根据本发明，对于以上死菌体的制备方法没有特别的限制，例如但不限于，可以通 过自然裂解制备，也可以通过热致死制备。
[0025] 根据本发明，所述组合物中所述解淀粉芽孢杆菌的浓度没有特别的限制，可以根 据具体的情况进行具体的选择，在此不再详细赘述。
[0026] 另外，根据预定的用途不同，本发明提供的组合物可以制备为不同的剂型，并添加 相应的赋形剂等成分。其中，在何种剂型的组合物中添加何种赋形剂为本领域技术人员所 公知，在此不再详细赘述。
[0027] 第三方面，本发明还提供了如上所述的解淀粉芽孢杆菌和/或如上所述的组合物 在重金属钝化中的应用。
[0028] 本发明提供的解淀粉芽孢杆菌对重金属，例如，镉、镍、砷、铜、铅、汞等均有一定的 钝化作用，但其更适用于对重金属镉进行钝化。
[0029] 本申请中，术语"钝化"是指使重金属固定在污染土壤的表面，降低重金属的生物 有效性，减少植物对其吸收利用，从而达到修复重金属污染的环境的目的。
[0030] 第四方面，本发明提供了一种钝化重金属的方法，该方法包括：将如上所述的解淀 粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)，和/或如上所述的组合物加入到含有重金属 污染的环境中，以对所述重金属进行钝化。
[0031] 本发明优选在所述解淀粉芽孢杆菌能够存活的条件下对重金属进行钝化。其中， 术语"解淀粉芽孢杆菌能够存活"是指在含有重金属镉的环境中，至少大于20 %，优选至少 大于40 %，更优选至少大于60 %的菌体能够存活。术语"解淀粉芽孢杆菌能够存活的条件" 是指至少包括解淀粉芽孢杆菌能够存活最基本的条件，例如，温度、营养源等，此为本领域 技术人员所公知，在此不再赘述。
[0032] 本发明中的所述重金属的具体选择可以为如上所述的，此处不再重复。
[0033] 根据本发明，所述含有重金属污染的环境可以包括任何含有重金属的环境，例如， 所述含有重金属污染的环境可以包括含有重金属，优选镉，的土壤或水体。
[0034] 根据本发明，加入至所述含有重金属污染的环境中的解淀粉芽孢杆菌的形式并没 有特别的限定，只要保证加入后所述解淀粉芽孢杆菌能够在所述含有重金属污染的环境中 起作用并且对所述重金属有效钝化即可，加入的所述解淀粉芽孢杆菌的形式，例如，可以为 培养至对数期的菌体，也可以为冷冻干燥后的菌体干粉。
[0035] 本发明对加入的解淀粉芽孢杆菌的数量也没有特别的限制，这可以根据所述含有 重金属污染的环境中的重金属的含量以及钝化难易程度来决定，例如，当所述环境中的重 金属含量较高或较难钝化或所述环境对于所述解淀粉芽孢杆菌的生存较不利时，可以提高 所述解淀粉芽孢杆菌的接种量；当所述环境中的重金属含量较低或较易钝化或所述环境对 所述解淀粉芽孢杆菌的生存的影响较小时，可以减少所述解淀粉芽孢杆菌的接种量。
[0036] 本发明中对所述含有重金属污染的环境中重金属的含量也没有特别的限制，但综 合考虑所述解淀粉芽孢杆菌对重金属的降解效果，相对于每千克所述含有重金属污染的环 境，所述重金属的含量不高于200mg,优选不高于IOOmg,更优选不高于50mg。
[0037] 另外，本发明需要说明的是，当所述含有重金属污染的环境为水体时，重金属污染 的环境中重金属的含量也可以近似的认为是相对于每升所述含有重金属污染的环境，所述 重金属的含量不高于200mg,优选不高于IOOmg,更优选不高于50mg。
[0038] 根据本发明，当所述含有重金属的环境为土壤时，为了进一步促进本发明提供的 解淀粉芽孢杆菌对重金属的钝化效率，优选的，将土壤中的水含量控制在至少15重量％， 更优选为18-30重量％。
[0039] 以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
[0040] 以下实施例中：
[0041] LB液体培养基：0. 8-1 %蛋白胨，0. 5-0. 8 %酵母粉，1-1. 5 %氯化钠 ，pH = 6· 8_7· 0〇
[0042] 本发明的菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)，被命名为 Cd-B，并于2014年12月02日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101) (保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 10126。菌株的活化在LB液体培养基中 进行。
[0043] 其它未具体列出具体组成的培养基具有本领域公知的含义。
[0044] 实施例1
[0045] 本实施例用于说明本发明提供的解淀粉芽孢杆菌的生理生化性能
[0046] (1)糖、醇发酵试验
[0047] 取蛋白胨水培养基（pH = 7. 4-7. 6) 100ml，加入葡萄糖糖或甘油0. 5-lg，加热溶解 后再加入1% (g/100ml)溴百里酚蓝混匀。将培养液分装于试管内，培养液高度约为4-5cm， 管内倒置杜氏小管，使其充满培养液，115°C灭菌20min。用穿刺针将培养8-12h的幼龄菌种 接种于培养基中，适温培养ld，3d，5d后观察，颜色变黄，且有气泡产生，为阳性反应。
[0048] (2)淀粉水解试验
[0049] 以18_24h的纯培养物，点接于淀粉琼脂平板（一个平板可分区接种）或直接移种 于淀粉肉汤中，于36土 1°C培养24-48h，或于20°C培养5天。然后将碘试剂直接滴浸于培养 表面，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中。立即检视结果，琼脂培养基呈深蓝色、菌 落或培养物周围出现无色透明圈，为阳性反应" + "。
[0050] (3) V-P试验（二乙酰试验）
[0051] 将试验菌接种于葡萄糖蛋白胨培养基中（pH :7. 0-7. 2)，36 土 1°C培养4天后加入 α -萘酚纯酒精溶液，再加40%氢氧化钾水溶液，摇动2-5min，立即呈现红色，为阳性反应 " + '
[0052] (4)甲基红试验
[0053] 挑取新的待试纯培养物少许，接种于LB培养基中，36土 1°C培养3-5天，从第二天 起，每日取培养液，加入甲基红指示剂1-2滴，呈黄色，为阴性反应
[0054] (5)触酶试验
[0055] 直接滴加3%过氧化氢于不含血液的细菌培养物中，立即观察，有大量气泡产生， 为阳性反应" + "。
[0056] (6)菌膜形成试验
[0057] 将菌种接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，30土 1°C培养24小时，观察培养物有菌膜 形成，为阳性反应" + "。
[0058] (7)明胶液化试验
[0059] 挑取18_24h待试菌培养物，以较大量穿刺接种于含有明胶的蛋白胨水固体培养 基中，深度约2/3。20-22°C培养7-14天。明胶高层亦可培养于36土1°C。每天观察结果， 若因培养温度高而使明胶本身液化时应不加摇动、静置冰箱中待其凝固后、再观察其是否 被细菌液化，明胶确被液化，为阳性反应" + "。
[0060] (8)氧化酶试验
[0061] 在琼脂斜面培养物上或血琼脂平板菌落上分别滴加 Kovacs氏试剂和Ewing氏试 剂1-2滴，在数分钟内观察结果，无颜色改变，为阴性反应
[0062] (9)革兰氏染色
[0063] 涂菌：取干净载玻片一块，在载玻片上加一滴生理盐水，按无菌操作法将8_12h的 菌种涂在载玻片上，注意取菌不要太多。
[0064] 干燥：让涂片自然晾干或用酒精灯烘干。
[0065] 固定：手执载玻片一端，菌膜朝上，在火焰上固定2-3次。
[0066] 初染：滴加结晶紫（刚好覆盖菌膜为宜），染色l_2min，水洗。
[0067] 媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约lmin，水洗。
[0068] 脱色：用滤纸吸去载玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴流管滴加 95%乙醇脱色，直至流下的乙醇无紫色时，立即水洗。
[0069] 复染：用番红液复染约2min，水洗。
[0070] 镜检：干燥后，用油镜观察，菌体被染成紫色，为革兰氏阳性菌。
[0071] 实施例2
[0072] 本实施例用于说明本发明的解淀粉芽孢杆菌镉对镉的钝化性能
[0073] (1)对水体中镉的钝化效果
[0074] 向LB液体培养基中加入浓度分别为50mg/L、100mg/L和200mg/L的Cd2+，121°C 灭菌15min。向培养基中分别接入1体积％的菌体。170rpm，30±rC下培养，不同时间取 样测OD值及镉含量。镉含量的检测方式为：取适量菌液，8000rpm离心5min，取上清液，用 ICP-AES检测上清液中Cd2+浓度，结果见表1。
[0075] (2)对土壤中镉的钝化效果
[0076] 相对于Ig含有重金属镉的污染土壤，加入1体积％的菌液，搅拌均匀，24土1°C下 培养15d，保证含水量为20%左右。15天后，分别将钝化前后的土壤在70°C下烘干，准确称 取lg，加入40ml 0. lmol/L的HAc，放在恒温振荡器中24°C下连续震荡16h，然后8000r/min 下离心5min。取上清液，用ICP-AES测定Cd2+含量。使用本发明的解淀粉芽孢杆菌前后测 定的土壤中的Cd 2+含量见表1。
[0077] 对比例1
[0078] 本对比例用于说明参比的菌种对镉的钝化性能
[0079] 按照实施例2中的方法对水体中镉进行钝化，不同的是，所使用的菌株为从镉 污染土壤中筛选得到的一株錯状芽孢杆菌（Bacillus cereus)，来自文献Huang F, Dang Z, Guo C L, et al. Biosorption of Cd(II)by live and dead cells of Bacillus cereus RC-I isolated from cadmium-contaminated soil[J]. Colloids and Surfaces B:Biointerfaces, 2013, 107:11-18.。结果见表1。
[0080] 对比例2
[0081] 本对比例用于说明自然状态下镉的钝化性能
[0082] 按照实施例2中的方法对水体中和土壤中的镉进行测试，不同的是，不加入任何 菌株。结果见表1。
[0083] 表 1
[0085] 由以上表1可以看出，在Cd2+浓度为50mg/L、100mg/L、200mg/L时，本发明的菌种 能达到的最高OD值分别为6. 07,4. 99和3. 78,对Cd2+的去除率分别为94. 27%，75. 20% 和52. 49%，土壤可交换态镉可由39. 47mg/kg降到0. 08mg/kg ;并且，由表1可以看出，本 发明提供的菌种对镉的钝化效果要高于现有的同属的其他菌株（蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus))对镉的钝化效果。
[0086] 经本发明菌株处理过的镉污染土壤或水体中镉的含量得到了明显下降，说明该菌 株对土壤或水体中重金属镉的钝化得到了良好的效果，能有效降低镉在土壤中的生物可利 用度。
[0087] 同样的，本发明的菌种对土壤或水体中镍、砷、铜、铅、汞的钝化效果与对镉的钝化 效果类似。另外，使用死菌体也能够达到类似趋势的效果，但钝化效果稍差于如上使用活菌 体的钝化效果。
[0088] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中 的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这 些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0089] 另外需要说明的是，在上述【具体实施方式】中所描述的各个具体技术特征，在不矛 盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可 能的组合方式不再另行说明。
[0090] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本 发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
【主权项】
1. 一种解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)，其特征在于，所述解淀粉芽 孢杆菌的保藏编号为CGMCC No. 10126。2. -种组合物，其特征在于，该组合物含有权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens)的菌体。3. 根据权利要求2所述的组合物，其中，该组合物含有所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)的死菌体和/或活菌体。4. 权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌、权利要求2或3所述的组合物在重金属钝化中 的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其中，所述重金属为镉、镍、砷、铜、铅和汞中的至少一 种。6. -种钝化重金属的方法，该方法包括：将权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens)，和/或权利要求2或3所述的组合物加入到含有重金属 污染的环境中，以对所述重金属进行钝化。7. 根据权利要求6所述的方法，其中，所述重金属为镉、镍、砷、铜、铅和汞中的至少一 种。8. 根据权利要求6或7所述的方法，其中，所述含有重金属污染的环境包括土壤或水 体。9. 根据权利要求6或7所述的方法，其中，相对于每千克所述含有重金属污染的环境， 所述重金属的含量不高于200mg。
【文档编号】C12R1/07GK105861351SQ201510031942
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2015年1月22日
【发明人】过钰梁, 林森, 张飞燕, 卢滇楠, 张 杰, 刘铮
【申请人】北京禾和润生科技有限公司