一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM及制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及植物保护领域，更具体设及一种能同时括抗蔬菜软腐病和油茶主要病 害的解淀粉芽抱杆菌BacillusamyloliquefaciensD2WM，同时还设及一种解淀粉芽抱杆 菌BacillusamyloliquefaciensD2WM的制备方法，还设及一种解淀粉芽抱杆菌Bacillus amyloliquefaciensD2WM在制备治疗或预防蔬菜软腐病及油茶病药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 蔬菜软腐病又称水烂、烂瘡落，除危害十字花科蔬菜（如萝K大白菜等）外，还 可危害马铃馨、番茄、窝宦、黄瓜、芹菜和葱类等蔬菜，引起不同程度的损失。蔬菜软腐病 发病初期，病部为水浸状半透明，后扩大为淡灰褐色湿腐，病部组织黏滑，失水后表面下 陷，常溢出白色菌浓，并有恶臭，后期蔬菜整个软化，全部烂掉，请见（易图永.蔬菜软腐 病[J].湖南农业，2015 (2) :28-29.)欧文氏菌巧rwinia)是引起植物软腐病发生的主要 病原菌，它属于肠杆菌科巧nterobacteriaceae)，主要包括胡萝h软腐欧文氏菌胡萝h亚 种巧rwiniacarotovorassp.carotovora，Ecc)、胡萝h软腐欧文氏菌黑腔亚种巧rwinia carotovorassp.atroseptica，Eca)和菊欧文氏菌巧rwiniachrysanthemi，Ech)S个亚 种，请见（PerombelonM.Pot曰todiseasescausedbysoftrotErwini曰s:曰noverview ofpathogenesis[J].Plantpathology. 2002, 51 (I) : 1-12.)其中，Eca的专一性较强，主要 侵染溫带上豆；Ecc在自然条件下寄主范围和地理分布最为广泛，可W侵染±豆、胡萝K 芹菜、黄瓜、辣椒和菊宦等植物，遍布亚热带和溫带等地；Ech则可侵染±豆、大丽花和玉 米等，请见（TothIKjBellKS,HolevaMC,etal.Softroterwiniae:fromgenesto genomes[J].Molecularplantpathology. 2002, 4(1):17-30.)近年来，蔬菜种植规模不断 扩大，蔬菜病害逐步引起重视，其中尤W蔬菜软腐病发生严重，造成的损失巨大。 阳00；3]油茶（Camelliaoleifera)属山茶科（Theaceae)山茶属（Camellia)，是我国特 有的一种高级油料作物，主要生长于中国南方亚热带地区高山及丘陵地带，是重要的木本 油料树种之一，请见（庄瑞林.中国油茶[M].北京：中国林业出版社，2008.)油茶种子含 大量优质的不饱和脂肪酸和维生素E，是一种在优质、耐储藏的高级食用油，在食用油中占 重要地位；另外，茶油在医药、工业上也应用广泛，可作为肥皂、凡±林、防诱油、润滑油等的 原料；茶枯可做农药，也是优质的有机肥料，还是提取拷胶、皂素、慷醒、活性炭等产品的原 料，提取后的固体残渣可作为猪的精饲料。可W说，油茶全身都是宝，具有很好的应用开发 前景，对促进农民增收、加快山区综合发展、维护国家粮油安全等方面有非常重要的作用。
[0004] 油茶病害种类繁多，其危害也愈发严重。油茶炭痘病、叶枯病、软腐病是由病原物 引起的3种毁灭性病害，在我国各油茶产区普遍发生，油茶的地上各部位均可受害，主要引 起落果、落蕾、枝梢枯死、枝干溃瘍、甚至整株死亡，请见（束庆龙，张良富.中国油茶栽培 与病虫害防治[M]..北京：中国林业出版社，2009.)同样，油茶根腐病、茶饼病、黑斑病、溃 瘍病等也时常发生，每年油茶产业因病害造成了巨大的经济损失。近年来，湖北油茶种植规 模不断扩大，相应的病害逐步引起重视。
[0005] 然而，目前对蔬菜软腐病和油茶主要病害的防治普遍通过种植抗性品种和化学防 治来控制，过多使用化学杀菌剂有危害人类身体健康、药物残留破坏生态环境、引发病原物 产生抗药性、影响蔬菜和茶油质量和食用安全等诸多缺点，不利于蔬菜和油茶产业的绿色 可持续发展。寻求安全、高效和经济的生物源农药已成为当前防治蔬菜和油茶病害的热点 和当务之急，其中括抗微生物在植物病害生物防治中起到十分重要的作用。
[0006] 在植物病害的生物防治中研究和应用较多的微生物主要有细菌类、真菌类和放线 菌。芽抱杆菌度acilus)是一类理想的生防菌筛选对象，在目前生防细菌中研究较多。它 能够抑制植物根部、枝干、叶、花和果实等各个部位的病害，应用范围很广。因其能够产生耐 热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂的抱子，因此十分利于生防芽抱杆菌在环境中的定殖与繁殖 及其发酵菌液的生产加工，请见（班慧芳.转aiiA基因魔芋的软腐病抗性及魔芋内生菌产 生抑菌蛋白的组成分析巧].华中农业大学，2009.)和（柴蠢莉，周盈，林拥军，等.苏云金 芽胞杆菌抗软腐病aiiA基因转花魔芋研究[J].分子植物育种，2007, 5(5) :613-618.)。目 前的生防芽抱杆菌主要包括枯草芽抱杆菌化subtilis)、巨大芽抱杆菌化megaterlum)、 多粘芽抱杆菌度.polymyxa)、短小芽抱杆菌度.pumilus)W及蜡状芽抱杆菌度.cereus) 等。孙明等发明了一种对胡萝h软腐欧文氏菌具有抑菌活性的枯草芽抱杆菌BSn5及抑菌 蛋白APn5(【申请号】200710053427. 8)，该枯草芽抱杆菌的抑菌活性物质是蛋白APn5,只能 括抗胡萝h软腐欧文氏菌亚种，其生防范围较窄；黄静等公开了一种解淀粉芽抱杆菌化-1 在防治棉花黄萎病、大白菜软腐病、青枯病、桃树腐烂病、苹果腐烂病等方面的应用（申请 号：201410735508. 6)，需利用解淀粉芽抱杆菌与壳寡糖组合成微生态菌剂，比较而言只对 棉花黄萎病的防治效果较好；刘君昂等公开了一种括抗油茶病害的短短芽抱杆菌Z26,能 够有效抑制油茶炭痘病菌、根腐病、半边疯等病原菌的生长（【申请号】201110027957. 1)，该 生防菌剂对油茶炭痘病的最大抑制率达到83. 4%，还有进一步提高的空间；周国英等发明 了一种有效防治油茶病害的复合微生物源农药及应用方法（【申请号】201310203845. 6)，公 开发明了一种由放线菌球抱链霉菌球抱亚种和细菌短短芽抱杆菌及其他助剂复配的微生 物农药，可防治油茶一种或几种主要病害，该复配的微生物农药制备过程相对繁琐，耗时较 长；也有利用枯草芽抱杆菌和苏云金芽抱杆菌MLl分别在花生果腐病和魔芋软腐病防治上 的相关报道（【申请号】201310708367. 4,【申请号】201510015310. 5)。然而，关于解淀粉芽抱 杆菌能同时在蔬菜软腐病及油茶主要病害上的防治研究及应用报道很少。另外，文献报道 多为针对油茶某一种病害的单一防治，目前市面基本没有可W同时防治两种W上油茶病害 效果很好的单一菌剂产品，且还未见对防治油茶黑斑病及油茶溃瘍病两种病害的报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是在于提供了一种解淀粉芽抱杆菌Bacillusamyloliquefaciens D2WM，该解淀粉芽抱杆菌从健康油茶根际±壤分离筛选获得，能同时高效的防治蔬菜软腐 病和油茶主要病害，是一株具有广谱括抗作用的生防芽抱杆菌，填补了单一微生物菌剂同 时防治欧文氏菌=个亚种和多种油茶病原真菌的技术空白，对软腐病及油茶无公害防治具 有一定的实际意义。
[0008] 本发明的另一个目的是在于提供了 一种解淀粉芽抱杆菌Bacillus amyloliquefaciensD2WM生防菌剂的制备方法，方法易行，操作简便。菌剂经如下步骤得 至IJ:将LB平板或者斜面上的D2WM菌落挑取一环移植到试管活化，35°C摇床培养16h，转速 150rpm，试管中LB液体培养基为：蛋白腺lOg/l，酵母提取物5g/l，氯化钢5g/L，pH7. 0 ;活 化后的菌液按照1% -3%的接种量移植到装有IOOmLLB液体培养基的250mL锥形瓶中，转 速150巧m，35°C摇床培养10h-24h，当菌含量大于2XIO8C化/mLW上即可获得发酵菌液，储 存作为生防菌剂。该生防菌剂制作容易，生长速度快，液体培养代谢产物只需要在液体培养 基中培养l〇-24h即可获得很好的括抗效果，相对于一般细菌、真菌大大缩短了培养时间， 降低了生产成本。
[0009] 本发明还有一个目的是在于提供了 一种解淀粉芽抱杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM在制备治疗或预防蔬菜软腐病药物中的应用，该生防菌株可同时 治疗或预防凡是能由欧文氏菌引发的蔬菜软腐病，包括青椒、红椒、窝宦、±豆、辄瓜、白菜 软腐病等。对胡萝h软腐欧文氏菌胡萝h亚种、胡萝h软腐欧文氏菌黑腔亚种和菊欧文氏 菌=个亚种均有很好的括抗作用。
[0010] 本发明的第4个目的是在于提供了 一种解淀粉芽抱杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM在制备治疗或预防油茶主要病害药物中的应用，该菌株的生防菌 剂可高效防治油茶炭痘病、叶斑病、黑斑病、溃瘍病等，液体发酵滤液抑菌率实验表明，该解 淀粉芽抱杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM对油茶主要病害的抑菌率达到95% W 上。
[0011] 为了实现上述的目的，本发明采用W下技术措施：
[0012] 其技术构思是：采用常规法进行分离、纯化和保存对软腐病和油茶主要病害同时 有括抗作用的生防菌株。请见（姚丽逵，王埼，付学池，等.小麦纹枯病生防芽抱杆菌的筛 选及鉴定[J].中国生物防治，2008,24(1):53-57.)。W实验室分离到的软腐病菌为指示 菌，分离得到的菌株为待检菌，将分离纯化到细菌利用点接法依次