解淀粉芽孢杆菌植物亚种wk1菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物纯化及其在植物疾病防治中的应用，具体是解淀粉芽抱杆菌植 物亚种Bacillus amyloliquefaciens subsp.plan 1:a;rum WK1菌株及该菌株在防治山核桃 干腐病中的应用。
【背景技术】
[0002] 芽抱杆菌生物特征丰富多样，分布极其广泛，是±壤微生物系统中的优势生物种 群。芽抱杆菌突出的特征是能产生对热、干旱、紫外线和一些化学物品有很强的抗逆性的芽 抱，因此在不同环境中存活、定殖与繁殖的能力很强。很多优良的芽抱杆菌已经应用到防治 植物病害上，并且获得商品化许可。芽抱杆菌防治植物病害的作用机制W竞争、括抗和诱导 植物抗性为主，其中括抗作用主要是产生抗菌物质抑制有害病原物的生长或发展或直接杀 灭病原物。非核糖体合成的脂肤类抗生素是抗菌物质中的一类，且对真菌具有强烈的括抗 作用。脂肤类物质在很多芽抱杆菌中发现，有伊枯草菌素（Iturin)，生物表面活性素 (Surf act in )、丰原素（fengycin)S 大家族（参见 Ongena Μ 著 Bacillus lipopept ides : versatile weapons for plant disease bioconhol)，其相应的抗真菌活性的报道中， ;Uu;rins和fengycins抗真菌效果相对显著。Fengycins具有强烈的抗真菌效果，特别是抗丝 状真菌（参见Deleu Μ著Effect of fengycin,a lipopeptide produced by Bacillus subtilis,on model 111011113招]108)〇此夕1'，与1化1'1]18和8山寸曰〇1：1]18相化^兩]1邑7〇1]18具有明显 的降低溶血活性的效果（参见Kumar A著Antimicrobial lipopeptides of Bacillus: natural weapons for biocontrol of plant pathogens)。
[0003] 山核桃化巧a cathayensis为胡桃科化glandaceae山核桃属化巧a落叶乔木，是投 入产出效益很高的经济树种之一。山核桃干腐病是近年来山核桃林中发生的一种新病害， 该病在浙江省的临安、淳安、桐庐的山核桃栽培区普遍发生，个别地区株发病率达80%~ 100%。病原菌有性态为子囊菌亚口 Ascomycotion座囊菌目Dothidelales葡萄座腔菌科 Bohyosphaeriaceae葡萄座腔菌Botryosphaera. sp.。有关山核桃干腐病的化学防治的研 究报道的有春季刮除病斑结合喷洒药剂。药剂主要有402抗菌剂、乙蒜素乳油、硫酸铜晶体 等。随着人们环保意识的不断增强W及高新技术在农业中的应用，利用有益生物来控制植 物病害越来越得到广泛重视。施用化学药剂产生农药残留、提高病原菌的抗药性、污染环境 等对生态环境和人体健康造成危害的一系列问题已经受到广泛关注。因此，寻找环境友好 型的植物病害防治技术已经成为研究的热点之一。生物防治就是其中一项备受关注的技术 与方法。
[0004] 本发明中所设及的解淀粉芽抱杆菌植物亚种Bacillus a町loliquefaciens subsp. plantarum WKl (简称WKl)，不仅菌株本身具有防效作用，其菌体发酵液和灭菌发酵 液都有较高的防效。从WK1菌株发酵液中提取的脂肤类化合物，表现为fengycin类脂肤占绝 对优势，且成分多样。由此说明WK1菌对真菌病原菌有很强的抑制效果，可作为一种生物防 治菌开发利用。
【发明内容】
[000引本发明要解决的技术问题是提供一种解淀粉芽抱杆菌植物亚种Bacillus amyloliquefaciens subsp.plan1:a;rum WK1菌株及其在抑制山核桃干腐病病原菌生长方面 的应用。
[0006] 解决上述技术问题，采用W下技术方案：
[0007] 本解淀粉芽抱杆菌植物亚种WK1菌株，其分类命名为解淀粉芽抱杆菌植物亚种 (Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum WK1)，保藏在中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中屯、（地址：北京市朝阳市北辰西路1号院3号），保藏编号为： CGMCCNo. 11640，保藏日期为2015年11月9日；该菌株在牛肉膏蛋白腺琼脂平板生长时，菌落 直径为2.0~3.0mm、圆形、凸起、边缘波状、表面權皱粘稠、乳白色、不透明的菌落;革兰氏阳 性杆菌，单个或成对排列，有芽抱，芽抱端生，楠圆形，芽抱囊膨大;营养肉汤液体静置培养， 表面产生菌膜，液体浑浊;在质量比为10 % NaCl水溶液、pH= 1~13条件中生长。
[0008] 本解淀粉芽抱杆菌植物亚种WK1菌株的应用，是应用该菌株及其发酵液或灭菌发 酵液上清液来抑制山核桃干腐病病原真菌的生长。
[0009] 本解淀粉芽抱杆菌植物亚种WK1菌株抑制山核桃干腐病病原真菌的生长的主要成 分为脂肤类物质中的丰原素 fengycins，成分有C15 fengycin A、C16 fengycin A、C17 fengycin A、C18 fengycin A及其异构体，异构体为侧链的11〇1'1]1日1-、13〇-和日]11日13〇^种异 构化形式。
[0010] 本解淀粉芽抱杆菌植物亚种WK1菌株及其发酵液和灭菌发酵液上清液的制备方法 按如下步骤进行：
[0011] (1)活化菌种：
[0012] 将保存在斜面培养基中的解淀粉芽抱杆菌植物亚种WK1菌株，在NA固体培养基上 划线生长48小时；
[001引（2)WK1菌株发酵液的制备：
[0014] 选取NA固体培养基上的单菌落，接种于100ml NA液体培养基中，在37°C、180r/min 条件下培养14小时，得到种子液;再将种子液按接种量为3% (v/v)分别接种于500ml ΝΑ液 体培养基中，在37°C、180r/min条件下培养48小时，得到WK1菌株发酵液；
[001引（3)WK1灭菌发酵液上清液的制备：
[0016] 将步骤(2)所述菌体的WK1菌株发酵液于高溫高压灭菌锅里12rC灭菌30min后，将 灭菌发酵液3000r/min离屯、15min后，得WK1灭菌发酵液上清液。
[0017] 本解淀粉芽抱杆菌植物亚种WK1菌株的应用，其特征是所述的脂肤类物质具有抑 制杉木枯萎病、棉花黄病、哈密瓜枯萎病、黄瓜枯萎病、立枯丝核菌、蔬菜根腐病、茄子辣椒 根腐病病原菌菌丝生长的作用。
[0018] 本发明的有益效果是：
[0019] WK1菌株是针对山核桃干腐病而筛选出来的有较强生防效果的生防菌，且在生防 应用上芽抱杆菌具有很强的生位态，能在环境中很好的存活，因此具有很强的生长优势。不 仅WK1菌株本身具有防效作用，其菌体发酵液和灭菌发酵液的上清液都有较高的防效。最大 的特点是，WK1菌株主要代谢物的脂肤类化合物成分表现为fengycin类脂肤占绝对优势，且 成分多样，而fengycin被证明是3种脂版类化合物中抗真菌效果最好（参见Deleu Μ著 Effect of fengycin,a 1ipopeptide produced by Bacillus subtilis,on model membrane s)。由此说明WK1菌具有很强的抗真菌病原菌的效果。因此，该菌株在病害的生物 防治实践中具有潜在的商业开发和应用价值。
【附图说明】
[0020] 图1为菌株WK1菌落形态图
[0021] 图2为菌株WK1革兰氏染色镜检图
[0022] 图3为菌株WK1芽抱染色镜检图
[0023] 图4为菌株WK1对山核桃干腐病的抑制5天的效果显示图
[0024] 图5为菌株WK1对山核桃干腐病的抑制15天的效果显示图
[0025] 图6为菌株WK1的系统发育树图
[0026] 图7为流动相条件1(乙腊:0.05%Ξ氯乙酸水溶液= 40:60)的WK1菌株脂肤粗提物 高效液相色谱图
[0027] 图8为流动相条件1 (乙腊：0.05 % Ξ氯乙酸水溶液=40 : 60)的地衣芽抱杆菌 (Bacillus licheniformis)脂肤高效液相色谱图
[0028] 图9为流动相条件2(乙腊:0.05%Ξ氯乙酸水溶液= 49:51)的WK1菌株脂肤粗提物 高效液相色谱图
[0029] 图10为流动相条件2的高效液相色谱图中保留时间12.78min的fengycins质谱图
[0030] 图11为流动相条件2的高效液相色谱图中保留时间15.18min的fengycins质谱图 [0031 ]图12为流动相条件2的高效液相色谱图中保留时间16.98min的fengycins质谱图