>[0032] 图13为流动相条件2的高效液相色谱图中保留时间18.64min的fengycins质谱图
[0033] 图14为流动相条件2的高效液相色谱图中保留时间19.59min的fengycins质谱图
[0034] 图15为流动相条件2的高效液相色谱图中保留时间21.39min的fengycins质谱图
[0035] WK1菌株的菌种保藏:WK1菌种的活体纯培养已于2015年11月9日保藏于'中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、'，保藏号:CGMCC No. 11640。
【具体实施方式】
[0036] 本发明下面结合实施例并参照附图作详述：
[0037] 本解淀粉芽抱杆菌植物亚种WK1菌株，其分类命名为解淀粉芽抱杆菌植物亚种 (Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarunOWKl，保藏在中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中屯、，保藏编号为:CGMCC No. 11640,保藏日期为2015年11月9日；该菌株 在牛肉膏蛋白腺琼脂平板生长时，菌落直径为2.0~3.0mm、圆形、凸起、边缘波状、表面權皱 粘稠、乳白色、不透明的菌落;革兰氏阳性杆菌，单个或成对排列，有芽抱，芽抱端生，楠圆 形，芽抱囊膨大;营养肉汤液体静置培养，表面产生菌膜，液体浑浊;在质量比为10%NaCl水 溶液、pH= 1~13条件中生长。
[0038] 本解淀粉芽抱杆菌植物亚种WK1菌株的应用，是应用该菌株及其发酵液或灭菌发 酵液上清液来抑制山核桃干腐病病原真菌的生长。
[0039] 本解淀粉芽抱杆菌植物亚种WK1菌株抑制山核桃干腐病病原真菌的生长的主要成 分为脂肤类物质中的丰原素 fengycins，成分有C15 fengycin A、C16 fengycin A、C17 fengycin A、C18 fengycin A及其异构体，异构体为侧链的11〇1'1]1日1-、13〇-和日]11日13〇^种异 构化形式。
[0040] 本解淀粉芽抱杆菌植物亚种WK1菌株及其发酵液和灭菌发酵液上清液的制备方法 按如下步骤进行：
[0041] (1)活化菌种：
[0042] 将保存在斜面培养基中的解淀粉芽抱杆菌植物亚种WK1菌株，在NA固体培养基上 划线生长48小时；
[0043] (2)WK1菌株发酵液的制备：
[0044] 选取NA固体培养基上的单菌落，接种于100ml NA液体培养基中，在37Γ、摇瓶转速 为18化/min条件下培养14小时，得到种子液;再将种子液按接种量为3% (v/v)分别接种于 500ml NA液体培养基中，在37°C、180r/min条件下培养48小时，得到WK1菌株发酵液；
[0045] (3)WK1灭菌发酵液上清液的制备：
[0046] 将步骤(2)所述菌体的WK1菌株发酵液于高溫高压灭菌锅里12rC灭菌30min后，将 灭菌发酵液3000r/min离屯、15min后，得WK1灭菌发酵液上清液。
[0047] 本解淀粉芽抱杆菌植物亚种WK1菌株抑制山核桃干腐病病原真菌生长的脂肤类物 质的应用，其特征是所述的脂肤类物质具有抑制杉木枯萎病、棉花黄病、哈密瓜枯萎病、黄 瓜枯萎病、立枯丝核菌、蔬菜根腐病、茄子辣椒根腐病病原菌菌丝生长的作用。
[0048] 下面本发明将与申请主题相关的一些具体试验方法介绍如下：
[0049] WK1菌株的筛选:从天目山雷竹林±壤中分离筛选出的一株菌株，该菌株对其周围 生长的其他菌株有括抗作用，故经划线培养，得到纯化的菌株。再在PDA培养基上与山核桃 干腐病致病菌葡萄座腔菌Bo化yosphaeria dothidea进行对時培养。平板对時试验结果见 图4，图5，WK1菌株与病原菌同时打饼接种，中间为病原菌，两边为WK1。图4为培养5天两种菌 的生长状况，图5为培养15天的两种菌生长状况。由图5可W看出两边的WK1与中间的病原菌 形成抑制隔离带，说明WK1对山核桃干腐病致病菌葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea有 抑制作用。
[0050] WK1菌株的形态鉴定:将菌株WK1在NA固体培养基平板上于37°C下培养2d，观察其 菌落形态(形状、颜色光泽、表面是否隆起或凹陷、边缘形状等）。菌株WK1在NA固体培养基上 菌落直径2.0~3.0mm，圆形、凸起、边缘波状、表面權皱粘稠、乳白色、不透明的菌落(见图 1);革兰氏阳性杆菌，单个或成对排列（见图2);有芽抱，芽抱端生，楠圆形，芽抱囊膨大(见 图3);
[0051 ] WK1菌株的生理生化反应:将WK1菌株接种到API 50C皿鉴定条中，37°C下2地培养， 结果见表1。
[0052] 表1 WK1菌株的生理生化反应(表1)
[0053]
[0055] 注:+表示阳性;-表示阴性
[0056] WK1菌株分子生物学鉴定：提取菌株的基因组0熟，^通用引物（上游引物27F5/- TACGGCTACCTTGTTACGAC-3'，下游引物 1492R 5'-CTGAGCCAGGATCAAACTCT-3'，引物由上海生 工合成)PCR扩增掉抗菌株的16S rDNAaPCR扩增后经电泳检测，测序。经测序分析确定16S rDNA片断长度为1514kb。运用在线BLAST全序列比对软件化ttp: z7www.eztaxon.org)网站 SimTable选项比对，点击"view all seq"获得同一分类单元相近菌株的16S rRNA基因序 列。将该菌株的16S rDNA序列与GenBank数据库收录的对比菌株的16S rDNA基因序列进行 同源性比对D结果与B·amyloliquefacienssubsp·PlantarumFZB42等解淀粉芽抱杆菌的 同源性高达99% D米用neighbour-joining方法和Kimura 2-Parameter Distance模型构建 系统发育树（图6)，WK1菌株与Β· amyloliquefaciens subsp .Plantarum FZB42聚成一支，因 此将菌株WKl确定为解淀粉芽抱杆菌植物亚种B·amyloliquefacienssubsp·Plantarum，自 定代号为Ml。
[0057] WKl菌株对山核桃干腐病的抑制作用：在平板对時试验培养过程中病原菌菌丝与 WK1菌形成隔离带，说明WK1对山核桃干腐病病原菌的生长有很强的抑制作用（见图4和图 5)。
[0058] WK1菌株发酵液对山核桃干腐病的抑制作用:将WK1菌液与山核桃干腐病病原菌混 合培养在PDA液体培养基中，180r/min，培养溫度37 °C，培养2天。之后将混合培养液涂布在 PDA固体培养基上，观察病原菌不生长，说明WK1菌液与山核桃干腐病病原菌混合培养时，前 者对后者有很强的抑制作用，导致山核桃干腐病病原菌死亡。
[0059] WK1菌株灭菌发酵液的上清液对山核桃干腐病的控病效果:将灭菌发酵液的上清 液按照1:9、2:8、5:5的比例加入PDA培养基后混匀，制成含药平板，再将病原菌菌饼接入平 板中央，28Γ培养。WPDA纯培养基作为对照，处理1是上清液:纯培养基=1:9,处理2为上 清液:纯培养基= 2:8,处理3为上清液:纯培养基= 5:5。每个处理重复3次。待对照组病原菌 菌丝长满培养皿时，十字交叉法测量各处理组菌落直径，计算平均值和相对抑制率。
[0060] 抑制率的计算方法：
[0061]
[0062] 表2 WK1菌株灭菌发酵液上清液对山核桃干腐病病原菌的抑制效果表 [006引（表 2)
[0064]
[0065] 由表2可W看出，WK1菌株菌株灭菌发酵液的上清液对山核桃干腐病病原菌菌丝生 长均具有较强的抑制作用，且随着上清液含量的增加，抑制效果越强。
[0066] WK1菌株发酵液中脂肤类物质的提取:提取方法为酸沉淀法。先用2%化0田容液将 细菌发酵液调节抑至8.0，4000;r/min离屯、30min;去除菌体，取上清液，用6mol/L盐酸调节上 清液抑至2.0,静置于4°C冰箱中过夜;过夜后的发酵上清液于4000;r/min离屯、30min，弃上清 液取沉淀，将沉淀用pH 2.0的盐酸洗涂3次后，用甲醇少量多次萃取，萃取液在RE-2000A旋 转蒸发仪中于35 °C减压蒸干溶剂，得到脂肤粗提物。
[0067] WK1菌株发酵液的脂肤类化合物成分分析:将菌株发酵液经过酸沉淀法提取出的 脂肤粗提物用甲醇溶解，用高效液相色谱-质谱联用化C-MS)分析测定脂肤粗提物所含化合 物类型。高效液相色谱分析柱为化enomenex Luna C18,4.6X250mm,流动相为乙腊:0.05% Ξ氯乙酸水溶液= 40:60(体积比），流速ImL/min，检测波长:UV 220nm。
[0068] 图7为流动相条件1(乙腊:0.05%