筛选25羟基维生素d3高产菌株和发酵培养基中聚山梨酯-80含量的方法
【专利说明】筛选巧超基维生轰〇3高产菌株和发醒培养基中聚山梨 醋-80含量的方法
[0001]
技术领域： 本发明设及一种筛选25径基维生素化高产菌株和发酵培养基的方法。
[000引【背景技术】： 骨质疏松症（Osteoporosis,OP)日益成为严重威胁老年人的健康的一种慢性疾病；维 生素D类药物中的25径基维生素化是自然存在人体内的维生素D3的活性代谢产物；多年 来，25径基维生素化主要用于治疗老年人骨质疏松症等各种慢性骨素乱，W及与慢性肾衰 竭有关的代谢性骨疾病，低巧血病，另外，近年也作为饲料添加剂用于饲料行业。
[0003] 25径基维生素化的制备有化学合成和生物发酵两种方法；化学合成反应步骤繁 多、需要昂贵试剂、反应过程中会产生外消旋体，需要进行复杂的拆分过程，不仅大大影响 收率，而且难W拆分完全，而且化学合成生产25径基维生素化会对环境产生较大的污染。 而微生物发酵的方式能够利用微生物细胞内的酶特异性的解决25径基维生素的手性 结构问题，其生产条件溫和，收率高，成本低廉，环境友好，成为一种有效替代化学合成的方 法。
[0004]随着25径基维生素化市场需求量正日益扩大，优良的25径基维生素D3高产菌株 就成为发酵生产25径基维生素化的关键。
[0005] 从当前国内生物技术产业来看，目前高产的工业生产菌种的获得主要还是采用 随机选育，包括自然选育、诱变育种和W原生质体融合为代表的杂交育种技术，常常正突变 率低，导致筛选工作量大，费时费力，从而不易筛选到高产菌株。
[0006] 由于细胞膜对底物和产物的透性屏障作用，常导致微生物细胞的转化效率低下。 主要表现为细胞催化效率一般比酶催化效率低10到100倍。此外，如果产物不能及时从 细胞中释放出来而在其中过度积累，通常会造成反馈抑制效应，使目标产物的得率下降。因 此，有必要采取措施来改善细胞膜对底物及产物的传质阻力，利用细胞膜通透性的变化来 提高微生物的代谢通量，提高菌体发酵过程中的催化效率，从而提高目标产物的产量。利用 细胞膜通透性的变化来提高微生物的代谢产物产量已经逐步应用到发酵产业中。例如，汪 江波(汪江波.调控细胞通透性W提高透明质酸的产量和分子量.华西药学杂志，2006,21 (5):465 ~ 467)报道了诱变选育甘油缺陷型菌株，添加甘油调控使得细胞膜的通透性大大 增加，大幅提高了透明质酸的产量。魏娜(魏娜.丫-亚麻酸产生菌深黄被抱霉细胞膜通透 性调控的研究(硕±学位论文）.上海水产大学，2007)报道了W深黄被抱霉甜RJ-13为出 发菌株，通过低频超声波4min与制霉菌素0. 05ml方法使得菌体细胞膜通透性的增加，从而 提高了丫-亚麻酸产率。胡炎华(胡炎华.逐级诱变及细胞膜通透性调节改造谷氨酸棒杆 菌.2011年国际氨基酸产业创新与联盟发展高峰论坛论文集，152~156)报道了通过香豆 素抗性筛选，增加细胞膜通透性提高了谷氨酸产量。
[0007]
【发明内容】
： 本发明的目的是提供了一种培养基原料来源广，成本低，出发菌株正突变株的几率高、 突变株25径基维生素化效价高的筛选25径基维生素D3高产菌株的方法。
[0008] 本发明的另一个目的是提供了一种25?基维生素化高产菌株生产25?基维生 素化的发酵培养基中聚山梨醋-80含量的筛选方法。
[0009] 本发明是运样实现的： 筛选25径基维生素化高产菌株的方法，包括如下步骤： (1) 初筛：将诱变处理的自养假诺卡氏菌单抱子悬浮液稀释后涂布于含有聚山梨 醋-80含量为15-20g/L的分离培养基做成的若干平板上，在29°C培养箱中培养144-19化， 从若干平板中挑选生长和产抱良好的菌株接种于斜面培养基制成的若干斜面上，在29°C 培养箱中培养16化，斜面成熟后挖块种入=角瓶中的种子培养基中，同时将用于诱变处理 的出发菌株斜面也挖块种入S角瓶中的种子培养基中，作为对照，摇床转速为280r/min， 29 °C培养7化后，种入发酵培养基，将S角瓶置于摇床上，摇床转速为280r/min，29 °C培养 4化后，补入维生素化，使得维生素化在发酵液中的终浓度为500ug/ml，继续培养72h，停止 发酵，测定两种菌的发酵效价，与出发菌株相比，选出自养假诺卡氏菌突变株相对发酵效价 较高的菌株若干支进行复筛， (2) 复筛：将发酵效价较高的若干菌株接种于若干=角瓶中的种子培养基中，将=角瓶 置于摇床上，摇床转速为280r/min，29°C培养7化后接种于若干个S角瓶中的发酵培养 基中，将S角瓶置于摇床上，摇床转速为280r/min，29°C培养4化后，补入维生素化，使得 维生素化在发酵液中的终浓度为500ug/ml，继续培养72h，停止发酵，测定若干个S角瓶中 的发酵培养基发酵效价，挑选出一个=角瓶中发酵效价最高的一支菌株为最终产品。
[0010]25径基维生素高产菌株生产25径基维生素D3的发酵培养基中聚山梨醋-80 含量的筛选方法，将种子培养基装入3个250ml=角瓶中，每瓶30ml，灭菌后，从25径基 维生素化高产菌株的斜面挖块接入3个=角瓶种子培养基中，将=角瓶置于摇床上，摇床 转速为280r/min，29°C培养72h，将3个S角瓶中的种子液分别移入含有不同含量聚山 梨醋-80的若干个=角瓶中的发酵培养基中进行发酵试验，将=角瓶置于摇床上，摇床转 速为280r/min，29 °C培养4化后，补入维生素化，使得维生素化在发酵液中的终浓度为 500ug/ml，继续培养3天，停止发酵，测定发酵效价，确定一个S角瓶中的发酵效价最高的 发酵培养基，其聚山梨醋-80的含量为最佳值。
[0011] 所述的步骤（1)中所述分离培养基成分和含量为：葡萄糖15g/l，蛋白腺10g/l， 玉米浆3g/l，氯化钢4g/l，琼脂15旨/1，聚山梨醋-80 15g/l，PH7.0。
[0012] 所述的步骤（1)中所述斜面培养基成分和含量为：葡萄糖15g/l，蛋白腺10g/ 以玉米浆3g/l，氯化钢4g/l，琼脂15g/l，PH7.0。
[0013] 所述的种子培养基成分和含量为：蛋白腺15g/l，玉米浆15g/l，葡萄糖15g/l， 黄豆粉4肖/1，氯化钢5肖/1，憐酸二氨钟2肖/1，抑7.2。
[0014] 所述的含聚山梨醋-80量不同的发酵培养基，聚山梨醋-80含量分别为1-9g/L 中之一，其他成分和含量均为：蛋白腺15g/l，玉米浆15g/l，葡萄糖15g/l，黄豆粉4g/ 以氯化钢5g/l，憐酸二氨钟2g/l，倍他环糊精3g/l，pH7. 2。
[0015] 步骤（I)中所述诱变处理为将出发菌株自养假诺卡氏菌成熟斜面用生理盐水制 成单抱子悬液，经振荡，玻璃珠分散30min，无菌过滤收集单抱子悬液约IOml于无菌培养皿 中，使其抱子的终浓度达到120-130个/ml,紫外功率30W，灯距25cm照射30s。
[0016] 步骤（1)中所述诱变处理为将出发菌株自养假诺卡氏菌成熟斜面用抑7. 0的憐 酸钢缓冲液成单抱子悬液，经振荡，玻璃珠分散30min，无菌过滤收集单抱子悬液约10ml， 使其抱子的终浓度达到120-130个/ml,加入烧化剂甲基横酸乙醋EMS，终浓度为3%，振荡 处理30min，加入硫代硫酸钢终止反应，振荡20min。
[0017] 发酵培养基中聚山梨醋-80的含量为3 -8g/L。
[0018]针对随机选育正突变率低，工作量大，不易筛选到高产菌株的缺点，本发明提供了 一种筛选25径基维生素化高产菌株的方法，该方法在常规诱变选育的基础上，结合调控细 胞膜通透性的方法，能有效地提高获得正突变株的几率，为25径基维生素化发酵生产提供 优良菌种，从而提高25径基维生素化发酵生产水平。
[0019] 表面活性剂主要是通过影响细胞膜上脂质分子间和脂质分子与膜蛋白之间的相 互作用