一株产菊糖果糖转移酶的菌株及其生产菊糖果糖转移酶的方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及能够生产菊糖果糖转移酶的一种新的微生物及其培养发酵生产菊糖 果糖转移酶，并将该酶用于转化菊糖制备双果糖酢I的方法，属于食品生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 近年来，功能食品成为广大消费者关注的热点，其开发更是广大食品从业者研发 的焦点。而糖尿病、肥胖和屯、血管疾病人群的逐年增加和低龄化，使得低热量、具有更多功 能营养特性的功能性甜味剂成为关注的热点。
[0003] 双果糖酢I(Di化uctoseanhy化ide)是一种新型的非还原性双糖，在自然界中 少量存在于菊宦、菊芋等植物中，少量出现于蜂蜜、咖啡等的加工过程中。其相对甜度为薦 糖的52%，而热量值却只有薦糖的1/15 (0.263kcal/g);双果糖酢I对热和酸十分稳定， 在一般食品加工条件下几乎不会出现褐变或分解现象，能耐硬糖生产时的高溫熬煮而不褐 变。同时双果糖酢I还具有良好的功能特性，如在消化道不吸收，且不产生能量，可作为一 种甜味剂被用作减肥辅助治疗；作为一种增歧因子，可促进肠道微生物的生长，明显改善排 便、利尿功能；作为促进矿物质元素吸收的功能性糖，可使得化、MgJn、化等矿物质元素被 人体吸收利用的程度大大提高，增进骨骼生长。运些优点使其在食品工业中的应用有广阔 的前景。
[0004] 由于双果糖酢I在自然界的含量极低，天然提取分离成本高，不适宜工业化大生 产的要求，化学催化法有形成许多副产物和化学污染物等不利的因素，使得价格低廉，转化 率高的生物转化技术成为生产双果糖酢I的研究热点。
[0005]自1989年Seki首次从节杆菌属中发现了一种新型菊糖酶（inulase)，使用生物转 化法制备双果糖酢I的研究已经有20余年的历史。迄今为止，已发现几种微生物可W产 生此酶，主要集中在节杆菌属，包括^化raAac妃r邱| 义^化raAac妃r邱《69-5、 ArthrobacterglobiformisS14-3、ArthrobacterureafaciensA51-1、ArthrobacterjOasceftsa似-7,另外在链霉菌属中也发现了此酶，如5'的677.必(^7-之皮￥。
[0006] 本发明人深入调查和研究了现有技术并对各种高收率生产双果糖酢I的方法进 行了研究，最终我们筛选到一株能够产生菊糖果糖转移酶的新微生物，证明了通过此酶与 高浓度的菊糖反应能够得到高转化率的双果糖酢I，并通过浓缩、喷雾干燥、结晶的方法得 到了糖浆、粉末或晶体Ξ种形式的双果糖酢I。基于上述发现提出了本发明。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种新的微生物，它能够生产高酶活的菊糖果糖转移酶。
[0008] 本发明的另一个目的是提供一种该菊糖果糖转移酶与高浓度菊糖溶液反应的方 法，W得到高转化率的双果糖酢I。
[0009] 本发明的再一个目的是提供一种双果糖酢I提纯与精制的方法，W得到双果糖酢 I糖浆、粉末或晶体。
[0010] 本发明的技术方案，本发明提供一种由实验室保藏的巧rcesi/arareftsis SK39. 001，能够产生菊糖果糖转移酶的菌株，并利用该菊糖果糖转移酶转化菊糖生成双果 糖酢I。本发明采用的沉巧'jOio巧rcesi/arareftsisSK39. 001发酵生产的菊糖果糖转移酶， 酶活较高，能够将菊糖转化为双果糖酢I，且双果糖酢I转化率高达75%W上，副产物少，除 双果糖酢I和未转化的菊糖外，只有少量的低聚果糖。
[0011] 一株产菊糖果糖转移酶的菌株，其分类命名为链霉菌（沉 39. 001，已保藏于中国典型培养物保藏中屯、，保藏编号为CCTCCN0:M 2015352ο
[0012] 所述菌株发酵生产菊糖果糖转移酶的方法，步骤为： (1) 种子培养： 种子培养基：可溶性淀粉lOg/L酵母提取物2g/L，NaN〇30. 5g/l，ΚΗ2ΡΟ40. 5g/L，Μ拆O4· 7&0 0. 5g/l，KCl0. 5g/l，FeS〇4· 7&0lOmg/l，用去离子水配制； 种子培养条件：将（沉'邸拉巧rces0?rarensis)SK39. 001接入种子培养基中，于 25-30°C、160-240r/min振荡条件下培养 12-2地； (2) 发酵培养： 发酵培养基：菊糖lOg/L酵母提取物 2g/L，NaN〇30. 5g/l，KH2PO40. 5g/L，Μ拆〇4· 7&0 0. 5g/l，KC1 0. 5g/l，FeS〇4· 7&0lOmg/l，用去离子水配制； 发酵条件：在25-30°C、揽拌速度为200-50化pm、空气流量为5-30mV(L·h)的条件下 在发酵培养基中发酵12-84h得到生成菊糖果糖转移酶的发酵液； (3) 发酵后处理：通过离屯、法（即转速1000化pm，时间20min)除去步骤（2)所得发酵 液中的菌体，得到菊糖果糖转移酶粗酶液；将菊糖果糖转移酶粗酶液进一步超滤浓缩，即 用10邸a的超滤膜，转速3000-330化pm，时间30-60min，进行浓缩；用3倍浓缩液体积的 工业酒精沉淀蛋白质，离屯、（转速1000化pm，时间20min)和冷冻干燥（真空度0. 03Mbar，溫 度-55°C)得到菊糖果糖转移酶粗酶粉。
[0013] 制备得到的菊糖果糖转移酶转化菊糖生产双果糖酢I的方法，向质量浓度1%-50% 菊糖溶液中添加菊糖果糖转移酶催化转化； 转化反应条件为：底物菊糖浓度范围为1%-50%，酶对底物的用量为0.Ol-lOU/g，pH4. 0-8. 0,转化反应溫度为30-50°C，转化反应时间3-24h，得到含有双果糖酢I的酶反应液， 用于制备双果糖酢I糖浆、双果糖酢I粉末或双果糖酢I晶体。
[0014] 所述双果糖酢I糖浆的制备方法如下： (1) 脱色：在含有双果糖酢I的酶反应液中添加酶反应液固形物含量0. 2%-2%的活性 炭，在80°C下溫育30min，然后进行娃藻±过滤，取脱色液； (2) 浓缩：将脱色液真空蒸发浓缩至固形物含量为60%-95%，即得双果糖酢I糖浆。
[0015] 所述双果糖酢I粉末的制备方法如下： (1) 脱色：在含有双果糖酢I的酶反应液中添加酶反应液固形物含量0. 2%-2%的活性 炭，在80°C下溫育30min，然后进行娃藻±过滤，取脱色液； (2) 浓缩：将脱色液真空蒸发浓缩至固形物含量为20%-40%的浓缩液； (3) 喷雾干燥：将麦芽糊精与W固形物含量干基计的双果糖酢I浓缩液按照重量比1 : 1-5的比例混合，控制进风溫度170-180°C、出风溫度为70-80°C，喷雾干燥，得到含麦芽糊 精的双果糖酢I粉末。
[0016] 所述双果糖酢I晶体的制备方法如下： (1) 脱色：在含有双果糖酢I的酶反应液中添加酶反应液固形物含量0. 2%-2%的活性 炭，在80°C下溫育30min，然后进行娃藻±过滤，取脱色液； (2) 结晶：将脱色液浓缩至固形物含量为60%-95%的浓缩液，快速降溫至50°C，缓慢均 匀添加双果糖酢I晶种，向浓缩液中缓慢加入0. 2-2倍浓缩液体积的乙醇，通过12h的缓慢 降溫过程溫度降至l〇°C，得含双果糖酢I晶体的糖膏，用乙醇清洗去除晶体表面的杂质，离 屯、分离，真空干燥至恒重，得双果糖酢I晶体。
[0017] 检测双果糖酢I含量的方法：取酶反应液离屯、，上清液微孔滤膜过滤（0. 22μm)， 滤液上HPLC分析。HPLC条件：Suga巧akl，6. 5mmid*300mm巧型阳离子交换柱，纯水作流 动相，示差折光检测器，85°C柱溫，流速：0. 4mL/min，进样量：10μレ双果糖酢I标样浓度： 0. 5%〇
[0018] 本发明的有益效果：本发明筛选到一株能够产生菊糖果糖转移酶的新微生物 CCTCCNO:M2015352,证明了通过菊糖果糖转移酶与高浓度的菊糖反应能够得到高转化率 的双果糖酢I，并通过浓缩、喷雾干燥、结晶的方法得到了糖浆、粉末或晶体Ξ种形式的双果 糖酢I。
[0019] 生物材料样品保藏：一株用于微生物转化发酵生产菊糖果糖转移酶的菌株，其分 类命名为巧rcesi/arare