产醛酮还原酶菌株、醛酮还原酶基因、载体、工程菌及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种产醛酮还原酶菌株、醛酮还原酶基因、载体、工程菌构建及应用方法，所述醛酮还原酶基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.3和SEQ ID No.5中的一种，SEQ ID No.1、SEQ ID No.3所示醛酮还原酶基因来自菌株——乳酸克鲁维酵母XP1461，SEQ ID No.5所示醛酮还原酶基因来自菌株——拜耳接合酵母XP1462；本发明公开的3条来自K.lactis、Z.bailii的醛酮还原酶首次报道用于6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯生物催化合成，制得的样品6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯达到光学纯，几乎检测不到6-氰基-(3S,5R)-二羟基己酸叔丁酯的存在；得益于公开的醛酮还原酶的高差向选择性，产物提取收率高。
CCTCC NO：M 2014381
20140814
CCTCC NO：M 2014380
20140814
【专利说明】产醛酮还原酶菌株、醛酮还原酶基因、载体、工程菌及应用 (一）
【技术领域】
[0001] 本发明涉及醛酮还原酶产酶微生物、酶基因和构建这些基因的重组表达载 体以及酶醛酮还原酶重组菌，并开发醛酮还原酶重组菌在阿托伐他汀手性侧链6-氰 基_(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯生物催化合成方面的应用。 (二）
【背景技术】
[0002] 心脑血管疾病已经成为危害人类健康的头号杀手，预计到2020年，心血管疾病死 亡人数将占人类总死亡人数的36%。心脑血管疾病发病与人体内高胆固醇水平有密切关 系。阿托伐他汀能竞争性抑制肝脏内胆固醇合成的关键限速酶一3-羟基-3-甲基戊二酰 辅酶A还原酶的活性，降低内源性胆固醇的合成，是治疗高胆固醇血症和混合型高脂血症 的有效药物，具有起效快、降脂能力强、作用时间长和毒副作用小等优点，是全球首个年销 售额超过百亿美元的重镑炸弹药。
[0003] 6-氰基_(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯，是阿托伐他汀合成的重要手性中间体，也 是关键的药效基团。由于各国药监部门对药物手性纯度设置严苛的限制（e.e.值>99. 5%， d. e.值>99% )，6-氰基_(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯的合成技术成为阿托伐他汀合成的 关键核心技术。传统的6-氰基_(3R，5R)_二羟基己酸叔丁酯化学合成工艺从酮酸（酯） 出发，通过不对称合成构建手性中心，反应路线复杂，需要使用易燃易爆的硼烷、正丁基锂 等及深冷等特殊条件，导致产物d.e.值低、得率低、能耗大。而且，反应产生的硼化物废物 处理困难，需要经过繁琐的反复甲醇淬灭、真空蒸馏处理。酶催化反应具有优异的选择性、 反应条件温和等优点，一般在常温、常压及近中性条件下进行，把分解、异构化、外消旋化、 重排等不利副反应降到最低限度，生物催化技术具备提高过程原子经济性、实现过程绿色 环境友好的基本条件。因此，开发生物不对称还原6-氰基_(5R)_羟基-3-羰基己酸叔丁 酯合成6-氰基_(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯技术，具有巨大的经济效益和社会效益。 (三）
【发明内容】
[0004] 本发明目的是提供产立体选择性醛酮还原酶微生物乳酸克鲁维酵母 (Kluyvzzzeromyces Iactis)、拜耳接合酵母（Zygosaccharomyces bailii)，3 条来自 K. lactis、Z.bailii的醛酮还原酶基因和含有上述基因的重组载体及其转化得到的重组 菌，开发其在6-氰基-(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯生物催化合成方面的应用。
[0005] 本发明采用的技术方案是：
[0006] 本发明提供一种醛酮还原酶基因，所述醛酮还原酶基因的核苷酸序列为SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 5 中的一种。其中 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3 所示醛酮还 原酶基因来自菌株一乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis)XP1461，保藏于中国典型 培养物保藏中心，保藏日期为2014年8月14日，保藏编号为CCTCC Ν0:Μ 2014380,保藏地 址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。SEQ ID No. 5所示醛酮还原酶基因来自菌株一拜 耳接合酵母（Zygosaccharomyces bailii)XP1462,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏 日期为2014年8月14日，保藏编号为CCTCC M 2014381，保藏地址为中国武汉，武汉大学， 邮编 430072。
[0007] 本发明所述SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3所示的醛酮还原酶基因克隆自K. Iactis XP1461(保藏编号CCTCC M 2014380)，SEQ ID No. 5所示的醛酮还原酶基因克隆自 Z.bailii XP1462(保藏编号CCTCC M 2014381)。所述的醛酮还原酶基因可以从K. Iactis XP1461(CCTCC M 2014380)和Z.bailii XP1462(CCTCC M 2014381)基因组中分离获得，也 可以从该醛酮还原酶基因的重组载体中或者重组表达组中分离获得，也可以全人工合成获 得。
[0008] 本发明所述的醛酮还原酶基因之一的碱基序列如序列表中SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 5所示，分别命名为kakr、kxr和zbakr，全长分别为930bp、990bp和 939bp。其中，其编码序列（⑶S)分别为：从第一个碱基起至第930个碱基止，起始密码子为 ATG，终止密码子为TGA ;从第一个碱基起至第990个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码 子为TGA ;从第一个碱基起至第939个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。该3 条序列无内含子，其编码的蛋白质（即醛酮还原酶）氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2、 SEQ ID No. 4 和 SEQ ID No. 6 所示。
[0009] 由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO :1、SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 5所示 多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90%以上同源性，均属于本发明保护范围之列。 所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的 变体可以是等位变异体或非天然发生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异 体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多个核苷酸的 取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的氨基酸的功能。
[0010] 由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO :2、SEQ ID No. 4或SEQ ID No. 6 所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该 多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在95%以上，均属于本发明保护范围之 列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于突变体的 保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异 亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
[0011] 本发明还涉及所述醛酮还原酶基因构建的重组表达载体。本发明所述的重组表 达载体可以通过本领域常规方法将本发明的醛酮还原酶基因连接于各种表达载体上构建 而成。所述的载体可以为本领域常规的各种载体，如商品化质粒（大肠杆菌中合适的载体 有 pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pET20、pET32、pR印4、pHSl、pHS2、pMBL 等）、粘粒（PHZ132)、噬菌体或者病毒载体（反转录病毒载体，腺病毒载体）等。所述质粒 代表部分质粒，其他质粒为技术人员所熟知。本发明所述重组载体优选pET28a质粒。优选 地，可以通过下述方法制得本发明的重组表达载体：分别将以K. Iactis基因组DNA为模板， 通过上游引物（引物 I) :5'-CATATGACTACTCAAAAGTTCTTTACTT-3'，下游引物(引物 2)5'-￡￡ GGCCGCTCACTTCTGGGATTCAGAAT-3'进行PCR扩增所得到的醛酮还原酶基因产物（核苷酸序 列为SEQ ID N0:1);以K. Iactis基因组DNA为模板，通过上游引物（引物3) :5'_ AGATCT ATGACGTACTTAGCAGAAACAG-3'，下游引物（引物 4)5'- CTCGAGGATGAAAGTTGGGAATTCGTTG-3' 进行PCR扩增所得到的醛酮还原酶基因产物（核苷酸序列为SEQ ID NO :3);以Z.bailii 基因组DNA为模板，通过上游引物（引物5) :5' - AGATCTATGTCTTTCCATCAAGAATTCT-3'，下 游引物（引物6)5'- CTCGAGAGGCTTCTGAGCTTCCTCATCG-3'讲行PCR扩增所得到的醛酮还原 酶基因产物（核苷酸序列为SEQ ID N0:5)与pGEM-T Easy载体连接，所得重组载体pGEM-T Easy-kakr、pGEM_T Easy-kxr 和 pGEM-T Easy-zbakr 用限制性内切酶 Nde I 和 Not I 双酶 切，形成的醛酮还原酶基因粘性末端分别与表达载体pET28a经相同限制性内切酶双酶切 反应形成的互补的粘性末端用T4 DNA连接酶连接，生成含有本发明的醛酮还原酶基因片 段的重组表达载体 pET28a_kakr、pET28a_kxr 和 pET28a_zbakr。
[0012] 本发明提供一种由所述重组表达载体转化得到的重组基因工程菌。通过将本发 明的重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种 宿主微生物，只要能满足重组表达载体可稳定的自行复制，且所携带的醛酮还原酶能被有 效表达即可。本发明优选E. coli BL21(DE3)。将本发明前述的表达质粒pET28a-kakr、 pET28a-kxr和pET28a-zbakr通过常规转化方法，转化至Ε· co I i BL21 (DE3)中，g卩可得 本发明优选的基因工程菌株，即 E. Co I i BL21 (DE3) /pET28a-kakr、E. Co I i BL21 (DE3) / pET28a_kxr 和 Ε· coli BL21 (DE3)/pET28a_zbakr〇
[0013] 本发明涉及一种所述醛酮还原酶基因在制备重组醛酮还原酶中的应用，所述的应 用为：构建含有所述醛酮还原酶基因的重组载体，将重组载体转化至宿主中，优选E. coli BL21 (DE3)，获得的重组基因工程菌诱导培养，培养液分离，获得含重组醛酮还原酶的菌体 细胞。所述的诱导培养所用的培养基可为本领域任何可使菌体生长并产生本发明的醛酮还 原酶的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH 7.0。 培养方法和培养条件没有特殊的限制，培养方法和条件可以根据宿主类型和培养方法等因 素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要能使转化体能够生长并产生本发明所述 的醛酮还原酶即可。其他培养转化体具体操作可按本领域常规操作进行，优选下述方法： 将本发明涉及的重组菌接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养基光密度OD 6c?达到 0. 6?0. 8 (优选0. 6)时，在终浓度为I. 0?15. Og/L (优选9. Og/L)乳糖的诱导下，高效表 达本发明的重组醛酮还原酶。
[0014] 此外，本发明还提供一种所述醛酮还原酶在催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己 酸叔丁酯不对称还原中的应用，具体所述的应用为：以携带醛酮还原酶基因的工程菌经发 酵培养获得的菌体细胞或菌体细胞经超声破碎后的破碎混合液离心获得的上清液为催化 剂，以6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，以葡萄糖为辅助底物（以葡萄糖为 辅助底物时，在菌体葡萄糖脱氢酶催化作用下将菌体内源性氧化型NAD (P) +还原成NAD (P) H，NAD (P) H作为氢供体参与还原反应）或者添加外源性还原型NADH作为底物，以pH7. 0磷 酸钾缓冲液为反应介质构成反应体系，在30°C、200转/分钟条件下进行转化反应，反应完 全后，获得含6-氰基_(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯的转化液，转化液经固液分离后，将液 体用乙酸乙酯萃取、取乙酸乙酯层减压蒸馏，获得油状液体6-氰基_(3R，5R)-二羟基己酸 叔丁酯；所述底物的初始浓度为〇. 01?〇. lmol/L缓冲液（优选0. 05mol/L)，所述催化剂 的的用量以菌体细胞湿重计为50?300g/L缓冲液（优选200g/L)，所述葡萄糖的用量为 5?50g/L反应体系（优选5g/L)，所述NADH的用量为0· 02?0· lmol/L反应体系（优选 0. 022mol/L)。制备的样品6-氰基_(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯d. e.值大于99. 5%，萃取 收率94. 5wt%。本发明所述反应体系包括下列两种：（1)以携带醛酮还原酶基因的工程菌 经发酵培养获得的菌体细胞为催化剂，以6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物， 以葡萄糖为辅助底物，以pH7. O磷酸钾缓冲液为反应介质构成反应体系；（2)以携带醛酮还 原酶基因的工程菌经发酵培养获得的菌体细胞经超声破碎后的破碎混合液离心获得的上 清液为催化剂，以6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，以外源性还原型NADH 作为底物构成反应体系。
[0015] 进一步，所述催化剂为菌体细胞经超声破碎后的破碎混合液离心获得的上清液， 辅助底物为NADH时，所述底物的初始浓度为0. 02?0. lmol/L反应体系，所述催化剂的体 积用量以破碎前菌体细胞的湿重计为50?120g/L反应体系，所述NADH的用量为0. 02? 0. lmol/L反应体系；具体为：将含醛酮还原酶基因的工程菌经发酵培养获得的菌体细胞 用200mm〇l/L，pH7. 0磷酸钾缓冲液重悬，然后将重悬液超声破碎，取破碎混合液离心，取 上清液作为催化剂，以6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，以NADH为氢供 体构成反应体系，在30°C、200转/分钟条件下进行转化反应，反应完全后，获得含6-氰 基_(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯的转化液，转化液经固液分离后，将液体用乙酸乙酯萃取、 取乙酸乙酯层减压蒸馏，获得油状液体6-氰基_(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯；所述底物的 初始浓度为〇. 01?〇. lmol/L反应体系（优选0. 022mol/L)，所述催化剂的体积用量以破碎 前菌体细胞湿重计为50?120g/L反应体系（优选100g/L)，所述NADH的用量为0. 01? 0. lmol/L反应体系（优选0. 022mol/L)。本发明所述以NADH为氢供体是指直接以NADH作 为第二底物参与6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯还原反应。
[0016] 本发明中催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原得到光学纯的 6_氰基_(3R，5R)_二羟基己酸叔丁酯的生物催化剂，可以是将发酵液（培养物）固液分离 后得到的菌体细胞或者菌体裂解液（粗酶液），也可以是进一步纯化得到的醛酮还原酶。
[0017] 本发明所述生物催化剂按如下方法制备：（1)菌体细胞的制备：将含醛酮还原酶 的重组基因工程菌接种至含有终浓度50 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基，37°C培养12 小时，获得种子液；再将种子液以体积浓度1 %的接种量接种到新鲜的含有终浓度50 μ g/ mL卡那霉素的LB液体培养基中，37 °C培养至菌体浓度0D_0. 6?0. 8,然后加入终浓度为 9. 0g/L乳糖，28°C诱导培养12小时后，4°C、9000转/分钟离心10分钟，弃上清，沉淀用生理 盐水洗涤两次，4°C、9000转/分钟离心10分钟，收集菌体细胞；(2)超声破碎：将步骤（1) 收集的菌体细胞与200mmol/L、pH7. 0磷酸钾缓冲液混合，在功率400W条件下超声破碎30 分钟，获得破碎混合液，将破碎混合液离心，取上清液即为催化剂；所述缓冲液的体积用量 以菌体细胞重量计为10mL/g。
[0018] 与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明公开的3条来自 K. lactis、Z. bailii的醛酮还原酶首次报道用于6-氰基_(3R, 5R)-二轻基己酸叔丁醋生 物催化合成，制得的样品6-氰基_(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯达到光学纯，几乎检测不到 6_氰基_(3S，5R)-二羟基己酸叔丁酯的存在；得益于公开的醛酮还原酶的高差向选择性， 产物提取收率高。 (四）【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1为PCR扩增电泳图谱，其中，⑴为kakr基因 PCR扩增后电泳图；（II)为kxr 基因 PCR扩增后电泳图；（III)为zbakr基因 PCR扩增后电泳图。
[0020] 图2为pGEM-T Easy重组质粒物理图谱，其中，（I)为重组质粒pGEM-T Easy-kakr 物理图谱；（II)为重组质粒pGEM-T Easy-kxr物理图谱；（III)为重组质粒pGEM-T Easy-zbakr物理图谱。
[0021] 图3为pET28a重组表达质粒物理图谱，其中，（I)为重组质粒pET28a-kakr物理 图谱；（II)为重组质粒pET28a-kxr物理图谱；（III)为重组质粒pET28a-zbakr物理图谱。
[0022] 图4为重组pGEM-T Easy质粒转化子PCR鉴定图，其中，（a)为重组菌KAKR的PCR 电泳图；(b)为重组菌KXR的PCR电泳图；（c)为重组菌ZBAKR的PCR电泳图。
[0023] 图5为重组pET28a质粒转化子PCR鉴定图，其中，（I)为重组菌KAKR的PCR电泳 图；（II)为重组菌KXR的PCR电泳图；（III)为重组转菌ZBAKR的PCR电泳图。
[0024] 图6为重组工程菌醛酮还原酶SDS-PAGE电泳图，其中，⑴为BL21 (DE3) / pET28a-kakr 醛酮还原酶 SDS-PAGE 电泳图；（II)为 BL21(DE3)//pET28a-kxr 醛酮还原酶 SDS-PAGE 电泳图；（III)为 BL21 (DE3)//pET28a-zbakr 醛酮还原酶 SDS-PAGE 电泳图;1 :标 准蛋白质分子；2 :未诱导醛酮还原酶工程菌细胞破碎液；3 :乳糖诱导醛酮还原酶工程菌细 胞破碎液；4 :乳糖诱导醛酮还原酶工程菌细胞破碎液上清。 (五）【具体实施方式】
[0025] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0026] 实施例1产醛酮还原酶微生物筛选
[0027] 富集培养基（豆芽汁培养基）：新鲜豆芽汁（新鲜黄豆芽，按100g/L加水煮沸30 分钟，过滤取豆芽汁，补水至初始体积）100mL/L，葡萄糖50g/L，自然pH，250mL摇瓶分装，装 液量50mL，115°C灭菌30分钟。添加无菌6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯2g/L。 固体培养基：豆芽汁培养基，添加20g/L琼脂，自然pH。
[0028] 将采集于全国各地的土样用生理盐水按一定的比例分散后接种至富集培养基中， 在30°C、150转/分钟条件下，摇床振荡培养24小时。富集培养液逐级稀释、涂布到固体平 板培养基上30°C培养至形成可观察到的单菌落。挑取单菌落转接至无菌斜面，30°C培养2 天，斜面置于4°C冰箱保藏。
[0029] 将保藏在试管斜面中的菌株逐一接种到发酵培养基中，在30°C、150转/分钟条件 下培养48小时。分别移取20mL培养物，离心，收集菌体，并用50mM磷酸钾缓冲液（pH8. 0) 洗涤菌体2次。将菌体分散于10. OmL上述缓冲液中，添加6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸 叔丁酯，使其终浓度达到5. Og/L，添加葡萄糖，使其终浓度达到5. Og/L，35°C，200转/分钟 转化12小时，转化液经离心、0. 22 μ m微孔滤膜过滤，液相色谱分析醛酮还原酶活性和选择 性，最终筛选到两株菌，在上述反应条件下，产物得率和d.e.值分别为25. 6%和89. 7%， 以及30. 4%和92. 5%，记为菌株XP1461和菌株XP1462。
[0030] 检测方法：高效液相色谱法层顶底物与产物的浓度，检测条件：0DS-2C18柱 (4. 6X250mm，5 μπι)，流动相乙腈：水=1:3 (v/v)，柱温40°C，流速lmL/min，紫外检测波长 210_，进样量20以匕6-氰基-(35,51〇-二羟基己酸叔丁酯、6-氰基-(31?，51〇-二羟基己 酸叔丁酯、6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯保留时间分别为7. 4分钟、8. 1分钟、 12. 5分钟。
[0031] 表1:利用Vitek 2微生物自动鉴定系统分析菌种XP1461结果
[0032]
【权利要求】
1. 一种醛酮还原酶基因，其特征在于所述醛酮还原酶基因的核苷酸序列为SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 5 中的一种。
2. -种权利要求1所述醛酮还原酶基因编码的醛酮还原酶。
3. 如权利要求2所述的酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列为SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4 和 SEQ ID No. 6 中的一种。
4. 一种权利要求1所述醛酮还原酶基因构建的重组表达载体。
5. -种由权利要求4所述重组表达载体转化得到的重组基因工程菌。
6. -种权利要求2所述醛酮还原酶在催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯 不对称还原中的应用，其特征在于所述的应用为：以含醛酮还原酶基因的工程菌经发酵培 养获得的菌体细胞或菌体细胞经超声破碎后的破碎混合液离心获得的上清液为催化剂，以 6_氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，以葡萄糖或NADH为辅助底物，以pH7. 0磷 酸钾缓冲液为反应介质构成反应体系，在30°C、200转/分钟条件下进行转化反应，反应完 全后，获得含6-氰基-(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯的转化液，转化液经固液分离后，将液体 用乙酸乙酯萃取、取乙酸乙酯层减压蒸馏，获得油状液体6-氰基_(3R，5R)-二羟基己酸叔 丁酯；所述底物的初始浓度为〇. 01?〇. lmol/L反应体系，所述催化剂的用量以菌体细胞湿 重计为50?300g/L反应体系，所述葡萄糖的用量为5?50g/L反应体系，所述NADH用量 为0. 02?0. lmol/L反应体系。
7. 如权利要求6所述醛酮还原酶在催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对 称还原中的应用，其特征在于所述催化剂为菌体细胞经超声破碎后的破碎混合液离心获得 的上清液，辅助底物为NADH时，所述底物的初始浓度为0. 02?0. lmol/L反应体系，所述催 化剂的体积用量以破碎前菌体细胞的湿重计为50?120g/L反应体系，所述NADH的用量为 0. 02?0. lmol/L反应体系。
8. 如权利要求6所述的应用，其特征在于催化剂按如下方法制备：（1)菌体细胞的制 备：将含醛酮还原酶的重组基因工程菌接种至含有终浓度50 yg/mL卡那霉素的LB液体培 养基，37°C培养12小时，获得种子液；再将种子液以体积浓度1 %的接种量接种到新鲜的含 有终浓度50 y g/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37°C培养至菌体浓度0D6J). 6?0. 8,然 后加入终浓度为9. 0g/L乳糖，28°C诱导培养12小时后，4°C、9000转/分钟离心10分钟， 弃上清，沉淀用生理盐水洗涤两次，收集湿菌体；（2)超声破碎：将步骤（1)收集的湿菌体 与200mmol/L、pH7. 0磷酸钾缓冲液混合，在功率400W条件下超声破碎30分钟，获得破碎混 合液，将破碎混合液离心，取上清液即为催化剂；所述缓冲液的体积用量以湿菌体重量计为 10mL/g〇
9. 一种提供权利要求1所述SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3所示醛酮还原酶基因的菌株， 所述菌株为乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis)XP1461，保藏于中国典型培养物保藏 中心，保藏日期为2014年8月14日，保藏编号为CCTCC NO :M 2014380,保藏地址为中国武 汉武汉大学，邮编430072。
10. -种提供权利要求1所述SEQ ID No. 5所示醛酮还原酶基因的菌株，所述菌株为拜 耳接合酵母（Zygosaccharomyces bailii)XP1462,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏 日期为2014年8月14日，保藏编号为CCTCC NO :M 2014381，保藏地址为中国武汉武汉大 学，邮编430072。
【文档编号】C12P13/00GK104498510SQ201410641987
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年11月13日 优先权日:2014年11月13日
【发明者】郑裕国, 王亚军, 罗希, 刘小青 申请人:浙江工业大学