一种霜霉病高效生防菌株的筛选方法
【专利摘要】本发明提供了一种霜霉病高效生防菌株的筛选方法。本发明提供的霜霉病高效生防菌株的筛选方法，通过测定生防菌对游动孢子降解率来进行菌种筛选，较好地解决了传统方法筛选的生防菌株对霜霉病防治效果低的问题，通过对葡萄霜霉病和黄瓜霜霉病的田间防治试验表明，以游动孢子降解率为新筛选方法获得的LB 10.9、LB 7.1和LX 10.2对霜霉病的防效均好于以孢子囊萌发率为筛选方法（传统方法）获得的LX 7.3的防效。CGMCC NO．1047720150130
【专利说明】
一种霜霉病高效生防菌株的筛选方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体是一种霜霉病高效生防菌株的筛选方法。
【背景技术】
[0002] 霜霉病属于难以防治的植物病害，自1882年波尔多液发明至今，化学防控一直是 其防治的主要措施。近年来，随着绿色农业的蓬勃发展，微生物源农药以其资源丰富、生物 安全性高和环境友好等特点，成为当前的研究热点。
[0003] 传统的霜霉病生防菌的筛选方法有两种，一种是拮抗筛选，一般经过平板对峙培 养、温室育苗筛选和田间试验三步。但霜霉病至今不能在离体培养基上培养，人们常用与其 亲缘关系较近的疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian)代替筛选。菌株不同，活性不同， 替代法筛选出的菌株对霜霉病防治效果不高。另外一种是抑制筛选，通常先经过玻片法测 定孢子囊萌发情况来筛选生防菌，然后进行温室育苗筛选和田间试验。此种方法筛选出的 生防菌株较拮抗筛选法，理论上对霜霉病防治效果要高。因为它是针对霜霉病病原菌筛选 的。然而，孢子囊虽是起传染作用的重要器官，却不是霜霉病的直接浸染体，游动孢子才是 霜霉病菌的直接侵染体，筛选降解游动孢子的生防菌株，是筛选霜霉病高效生防菌株的有 效方法。
【发明内容】
[0004] 本发明针对传统方法筛选的生防菌株对霜霉病防治效果低的问题，提供一种霜霉 病高效生防菌株的筛选方法，本发明采用如下技术方案：
[0005] -种霜霉病高效生防菌株的筛选方法，包括以下步骤：
[0006] (1)孢子囊悬浮液的制备:取4°C条件下保存的采集不超过2天的霜霉病病叶，置于 培养皿中，于20~25°C的生化培养箱中保湿培养7d，待新的孢子囊产生后用毛刷将孢子囊 刷下，配成孢子囊悬浮液，备用；
[0007] (2)孢子囊萌发诱导液的制备:将4 °C条件下保存的采集不超过2天的葡萄新叶榨 汁，过100目筛后，再依次过0.45mi、0.22mi微孔滤膜，即获得孢子囊萌发诱导液，备用；
[0008] (3)游动孢子悬浮液的制备:在孢子囊悬浮液中加入孢子囊萌发诱导液，置于15~ 18°C的生化培养箱中培养10~12h，待孢子囊萌发出游动孢子后，配成游动孢子悬浮液，备 用；
[0009] (4)生防菌对游动孢子降解率的测定:在96孔培养盘中加入游动孢子悬浮液和生 防菌发酵液，置于15~18°C生化培养箱，黑暗培养5h后，于倒置显微镜下计游动孢子数量， 计算降解率，以游动孢子降解率为参考标准筛选菌株。
[0010] 作为优选，所述孢子囊悬浮液的制备过程中，将采集到的霜霉病病叶先在流动自 来水中冲洗，然后用润湿的脱脂棉包被叶柄，再将病叶背面朝上置于带有湿润滤纸的培养 皿中。
[0011] 作为优选，所述孢子囊悬浮液的制备过程中，待新的孢子囊产生后用毛刷将孢子 囊刷下，用蒸馏水配成终浓度为1 x 105cfu/mL孢子囊悬浮液备用。
[0012] 作为优选，所述孢子囊萌发诱导液的制备过程中，将葡萄新叶按1:5~10的比例加 入蒸馏水榨汁。
[0013] 作为优选，所述游动孢子悬浮液的制备过程中，在孢子囊悬浮液中加入体积分数1 ~5%的孢子囊萌发诱导液。
[0014] 作为优选，所述游动孢子悬浮液的制备过程中，待孢子囊悬浮液中的孢子囊萌发 出游动孢子后，用蒸馏水配成终浓度为1 X 105cfu/mL的游动孢子悬浮液。
[0015] 作为优选，所述生防菌对游动孢子降解率的测定过程中，在96孔培养盘中按体积 比1:1的比例加入游动孢子悬浮液和生防菌发酵液。
[0016] 作为优选，所述生防菌对游动孢子降解率的测定过程中，以游动孢子降解率超过 75 %作为菌株筛选的合格标准。
[0017] 本发明的有益效果是:本发明提供的一种霜霉病高效生防菌株的筛选方法，本发 明先通过孔盘共培养的方法，选择霜霉病病原菌游动孢子的降解菌，然后利用直接生物测 定法筛选菌株，有效地解决了传统方法筛选的生防菌株对霜霉病防治效果低的问题。本发 明方法针对性强，方法简单、效率高、成本低，避免了过多的试验所造成的浪费。通过对葡萄 霜霉病和黄瓜霜霉病的田间防治试验表明，以游动孢子降解率为新筛选方法获得的LB 10.9、LB 7.1和LX 10.2对霜霉病的防效均好于以孢子囊萌发率为筛选方法(传统方法)获 得的LX 7.3的防效。
【具体实施方式】
[0018] 为能清楚说明本发明的技术特点，下面通过【具体实施方式】对本发明的方案进行阐 述。以下实施例是对本发明的进一步说明，但本发明并不局限于此。
[0019] 实施例一
[0020] 霜霉病高效生防菌株的筛选：
[0021] 1.1霜霉病病原菌的制备
[0022] 1.1.1孢子囊悬浮液的制备
[0023] 取4°C保存条件下采集不超过2天的霜霉病病叶，于流动自来水中冲洗，用润湿的 脱脂棉包被叶柄，将病叶背面朝上置于带有湿润滤纸的培养皿，于22°C的生化培养箱中保 湿培养7d，待新的孢子囊产生。用无菌毛刷将孢子囊刷下，用蒸馏水配成终浓度为IX 10 5cfu/mL孢子囊悬浮液，备用。
[0024] 1.1.2孢子囊萌发诱导液的制备
[0025]将4°C保存条件下采集不超过2天的葡萄新叶按1:5~10的比例加入蒸馏水榨汁， 过100目筛后，再依次过0.45mi、0.22mi微孔滤膜，即获得孢子囊萌发诱导液。
[0026] 1.1.3游动孢子悬浮液的制备
[0027] 将孢子囊悬浮液，加入体积分数1~5%的诱导液，置于15~18°C的生化培养箱中 培养12h，待孢子囊萌发出游动孢子，用蒸馏水配成终浓度为lX10 5cfu/mL游动孢子悬浮 液，备用。
[0028] 1.2孔盘观察法检测孢子囊萌发率(传统方法）
[0029] 采用传统的孢子囊萌发抑制法筛选霜霉病高效生防菌，在96孔培养板上，每孔加 生防菌发酵液40此、孢子囊悬浮液40此，蒸馏水和波尔多液为对照。每组处理重复3次，置于 15~18°C生化培养箱，黑暗培养24h后，于倒置显微镜下观察孢子萌发情况，计算孢子囊萌 发率。萌发率（％ )=(已萌发孢子囊数/总孢子囊数）X 100%。试验结果见表1。
[0030]表1孢子囊萌发抑制法筛选霜霉病高效生防菌(传统方法）
[0032] 由表1可知，供试的50株生防菌中，有11株对霜霉病孢子囊萌发抑制作用高于波尔 多液，其中LX 7.3抑制作用最强，孢子囊萌发率为8.11%。
[0033] 1.3孔盘观察法检测游动孢子降解率(新方法）
[0034] 用本发明的游动孢子降解法筛选霜霉病高效生防菌，在96孔培养板上，每孔加生 防菌发酵液40此、新制备的游动孢子悬浮液40此，蒸馏水为对照。每组处理重复3次，置于15 ~18°C生化培养箱，黑暗培养5h后，于倒置显微镜下计游动孢子数量，计算降解率。降解率 (% )=(处理后游动孢子数-处理前游动孢子数)/处理前游动孢子数X 100%。结果见表2。
[0035] 表2游动孢子降解法筛选霜霉病高效生防菌(新方法）
[0037]由表2可知，供试的50株生防菌中，有3株对游动孢子降解率超过75%以上，符合筛 选标准，筛选出的3株生防菌分别为:1^10.9、1^7.1、1^10.2，其中1^10.9降解作用最 强，降解率达90.58%。筛选出的LB 10.9,经鉴定为蜡样芽孢杆菌，Bacillus cereus，命名 为BCJB01，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是： CGMCC N0.10477，保藏日期为2015年1月30日。
[0038] 实施例二
[0039] 不同筛选方法所得菌株对霜霉病的防治效果试验。
[0040] (1)1^10.9、1^7.1、1^10.2和1^7.3悬浮剂对葡萄霜霉病田间试验
[0041] 试验在山东省科学院生物中心葡萄园内进行，品种为泽山一号和夏黑。
[0042] 试验按农业部药检所田间试验准则设计，共11个处理:LB 10.9、LB 7.1、LX 10.2 和LX 7.3悬浮剂用清水分别稀释成50倍和100倍或50倍和20倍，66.5%霜霉威盐酸盐水剂 1000倍液，50 %烯酰吗啉可湿性粉剂2000倍，清水对照。采用喷雾法施药，在下午16:00后进 行，每处理10株，3次重复，随机区组设计。每小区随机调查10个当年抽生新蔓，自上而下调 查10片叶，记录各级病叶数。叶片分级标准同叶盘法。在田间有零星发病时开始施药，间隔7 天用药1次，连续用药3次。在末次药后3天、7天调查药后病情指数。试验期间平均温度26°C， 降水量96~426.4mm。
[0043]病情指数=2(病级叶数X该级代表值)/调查总叶数X发病最高级
[0044]防效（％ ) = [1 -（对照区药前病指X处理区药后病指)/(对照区药后病指X处理 区药前病指）]X100。
[0045] 在药后连续晴天的情况下，LB 10.9、LB 7.1、LX 10.2和LX 7.3悬浮剂对葡萄霜霉 病田间防治效果见表3。
[0046] 表3 1^10.9、1^7.1、1^10.2和1^7.3悬浮剂对葡萄霜霉病田间防效
[0048] 注:每周施药一次，连续三次，最后一次用药后连续一周未降雨;葡萄品种:泽山一 号。
[0049] 试验结果显示，在药后连续晴天的情况下，50倍的LB 10.9、LB 7.1、LX 10.2和LX 7.3悬浮剂，在末次药后3天的防治效果均在75%以上，在末次药后7天的防治效果分别为 84.05%、81.63%、80.92%和73.30%。其中，新筛选方法获得的1^10.9、1^7.1和1^(10.2 50倍悬浮剂的防效均高于对照药剂霜霉威和烯酰吗啉。而LX 7.3的防效低于对照药剂霜霉 威，且随着药后处理时间的延长，防效下降。
[0050] 在药后连续阴雨天的情况下，1^10.9、1^7.1、1^10.2和1^7.3悬浮剂对葡萄 霜霉病田间防效见表4。
[0051] 表4 1^10.9、1^7.1、1^10.2和1^7.3悬浮剂对葡萄霜霉病田间防效
[0053] 注:施药后连续降雨，雨后补喷药剂;葡萄品种:夏黑。
[0054]由表4可知，在药后连续阴雨天的情况下，50倍的LB 10.9、LB 7.1、LX 10.2和LX 7.3悬浮剂在末次药后7天的防治效果分别为58.30%、55.84%、57.70%和29.08%，其中LB 10.9和LX 10.2的防治效果略高于对照药剂烯酰吗啉。
[0055] (2)1^10.9、1^7.1、1^10.2和1^7.3悬浮剂对黄瓜霜霉病温室试验
[0056]试验在山东省科学院生物中心温室内进行，品种为玉玺。
[0057]在黄瓜幼苗生长至2~3片真叶时，用喷雾器将黄瓜霜霉病孢子囊悬浮液对植株进 行全株喷雾接种，用保鲜膜保湿24h，在发病初期喷施50倍LB 10.9、LB 7.1、LX 10.2和LX 7.3悬浮剂稀释液，隔6天再喷1次，共喷3次，记录病情指数和治疗效果。以50%烯酰吗啉可 湿性粉剂2000倍为药剂对照，清水为空白对照。
[0058]病情指数=2 (病级叶数X该级代表值)/调查总叶数X发病最高级。
[0059]防治效果=[(对照病级指数-处理病级指数)/对照病级指数]X 100%。
[0060] LB 10.9、LB 7.1、LX 10.2和LX 7.3悬浮剂对黄瓜霜霉病温室防效见表5。
[0061] 表5 1^10.9、1^7.1、1^10.2和1^7.3悬浮剂对黄瓜霜霉病温室防效
[0063] 由表5可知，在药后处理7天时，50倍的LB 10.9、LB 7.1、LX 10.2和LX7.3悬浮剂对 黄瓜霜霉病的防治效果分别为70.73%、66.49 %、62.06%和48.47 %。其中，LB 10.9的防治 效果与对照药剂烯酰吗啉相当。
[0064] 1^10.9、1^7.1、1^10.2和1^7.3对葡萄霜霉病和黄瓜霜霉病的防治试验表明， 以游动孢子降解率为新筛选方法获得的LB 10.9、LB 7.1和LX 10.2对霜霉病的防效均好于 以孢子囊萌发率为筛选方法(传统方法)获得的LX 7.3的防效。因此，本发明提供的一种霜 霉病高效生防菌株的筛选方法，较好地解决了传统方法筛选的生防菌株对霜霉病防治效果 低的问题。
【主权项】
1. 一种霜霉病高效生防菌株的筛选方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 孢子囊悬浮液的制备:取4°C条件下保存的采集不超过2天的霜霉病病叶，置于培养 皿中，于20~25°C的生化培养箱中保湿培养7 d，待新的孢子囊产生后用毛刷将孢子囊刷 下，配成孢子囊悬浮液，备用； (2) 孢子囊萌发诱导液的制备:将4°C条件下保存的采集不超过2天的葡萄新叶榨汁，过 100目筛后，再依次过0.45 μπι、0.22 μπι微孔滤膜，即获得孢子囊萌发诱导液，备用； (3) 游动孢子悬浮液的制备:在孢子囊悬浮液中加入孢子囊萌发诱导液，置于15~18°C 的生化培养箱中培养10~12h，待孢子囊萌发出游动孢子后，配成游动孢子悬浮液，备用； (4) 生防菌对游动孢子降解率的测定:在96孔培养盘中加入游动孢子悬浮液和生防菌 发酵液，置于15~18°C生化培养箱，黑暗培养5 h后，于倒置显微镜下计游动孢子数量，计算 降解率，以游动孢子降解率为参考标准筛选菌株。2. 如权利要求1所述的一种霜霉病高效生防菌株的筛选方法，其特征在于:所述孢子囊 悬浮液的制备过程中，将采集到的霜霉病病叶先在流动自来水中冲洗，然后用润湿的脱脂 棉包被叶柄，再将病叶背面朝上置于带有湿润滤纸的培养皿中。3. 如权利要求1所述的一种霜霉病高效生防菌株的筛选方法，其特征在于:所述孢子囊 悬浮液的制备过程中，待新的孢子囊产生后用毛刷将孢子囊刷下，用蒸馏水配成终浓度为1 X105 cfu /mL的孢子囊悬浮液备用。4. 如权利要求1所述的一种霜霉病高效生防菌株的筛选方法，其特征在于:所述孢子囊 萌发诱导液的制备过程中，将葡萄新叶按1:5~10的比例加入蒸馏水榨汁。5. 如权利要求3或4所述的一种霜霉病高效生防菌株的筛选方法，其特征在于:所述游 动孢子悬浮液的制备过程中，在孢子囊悬浮液中加入体积分数1~5%的孢子囊萌发诱导液。6. 如权利要求1所述的一种霜霉病高效生防菌株的筛选方法，其特征在于:所述游动孢 子悬浮液的制备过程中，待孢子囊悬浮液中的孢子囊萌发出游动孢子后，用蒸馏水配成终 浓度为IX 1〇5 cfu /mL的游动孢子悬浮液。7. 如权利要求6所述的一种霜霉病高效生防菌株的筛选方法，其特征在于:所述生防菌 对游动孢子降解率的测定过程中，在96孔培养盘中按体积比1:1的比例加入游动孢子悬浮 液和生防菌发酵液。8. 如权利要求1所述的一种霜霉病高效生防菌株的筛选方法，其特征在于:所述生防菌 对游动孢子降解率的测定过程中，以游动孢子降解率超过75%作为菌株筛选的合格标准。
【文档编号】C12N1/00GK105820953SQ201610210220
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年4月6日
【发明人】李纪顺, 王贻莲, 谢雪迎, 扈进冬, 杨合同, 陈凯, 魏艳丽
【申请人】山东省科学院生物研究所