一种酵母融合子的制备及谷胱苷肽高产菌株的筛选方法
【专利摘要】本发明提供一种酵母融合子的制备及谷胱苷肽高产菌株的筛选方法：分别制备多形汉逊酵母和粟酒裂殖酵母原生质体；将原生质体进行融合，得到融合处理细胞；对融合处理细胞进行耐高温、乙醇以及钼酸钠耐受性筛选，得谷胱苷肽高产菌株。本发明可高效筛得产谷胱苷肽的融合子，筛选得到的融合子具有耐高温、生长速度快、遗传稳定、谷胱苷肽高产等优点，为谷胱苷肽的大规模生产提供了具有应用价值的菌株。
【专利说明】
一种酵母融合子的制备及谷胱苷肽高产菌株的筛选方法
技术领域
[0001] 本发明属于应用微生物领域，具体涉及一种酵母融合子的制备及从酵母融合子中 筛选谷胱苷肽高产菌株的方法。
【背景技术】
[0002] 谷胱苷肽(Glutathi〇ne，GSH)是一种由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成的活性三 肽，几乎存在于生物体的所有细胞中。由于半胱氨酸上所具有的活性基团巯基可与重金属 等毒素相结合，使其具有整合解毒作用，同时还具有抗氧化作用，从而可延缓衰老，即GSH具 有广谱解毒作用。此外，GSH对于免疫系统也有一定作用，可有效维持免疫系统功能，增强免 疫力。因此，GSH广泛运用于医药、保健食品及化妆品等领域。
[0003] 目前，国内GSH的市场需求量日益增多，但我国GSH几乎完全依赖进口。GSH的生产 方法有化学合成法、萃取法、酶法和发酵法。其中，发酵法因其成本低、易分离、绿色环保等 特点，已成为GSH工业化生产中的重要方法。国外对于微生物发酵生产GSH的研究较多，而国 内用于生产GSH的菌株发酵水平较低。用于发酵GSH最常用的菌株为酵母菌，其中GSH产量较 高的为汉逊酵母属、裂殖酵母属、酿酒酵母属和假丝酵母属。
[0004] 中国专利"多形汉逊酵母突变菌株及其在谷胱甘肽生物合成中的应用"（公开号 CN103060210A，【公开日】：2013·4.24)公开的多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)DL_18S 一种GSH产量较高的酵母突变菌株，是以多形汉逊酵母DL-1为出发菌株，通过低能离子注入 技术处理所得的突变菌株。多形汉逊酵母DL-1菌株具有安全性高、培养成本低、耐高温、生 长速度快且易高密度发酵等优点，而作为DL-1的突变菌株DL-18不仅具有DL-1的所有优势， 与之相比，更大的区别在于其GSH产量较DL-1增加了 1.56倍，这样增加了GSH生产效率，从而 大幅降低了 GSH的生产成本。但是，为实现工业化生产需要，该菌株的GSH产量和耐乙醇能力 仍需进一步提高，以实现高效生产GSH的目的，而仅通过诱变方法实现其GSH产量和耐乙醇 能力的提尚有一定难度。
[0005] 此外，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyce spombe)是一种通过产孢子和分裂繁 殖的单细胞生物，最初是从东非粟啤酒中分离出来的，其不仅遗传清晰，操作方便，也具备 一定的产GSH的能力。尽管粟酒裂殖酵母的GSH产量低于多形汉逊酵母，但具较强的耐乙醇 能力。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种酵母融合子的制备及谷胱苷肽高产菌株的筛选方法。 所制备并筛选得到的酵母融合子具有耐高温、生长速度快且高产谷胱苷肽特点，从而提高 了生产效率，降低了生产成本。
[0007] 为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
[0008] 1)以多形汉逊酵母和粟酒裂殖酵母为出发菌株，分别制备原生质体；
[0009] 2)将多形汉逊酵母原生质体和粟酒裂殖酵母原生质体进行融合，得到融合处理细 胞；
[0010] 3)对融合处理细胞进行初步培养后利用48~53°C高温培养对初步培养得到的菌 株进行初筛，对初筛后保留的菌株进行乙醇以及钼酸钠耐受性复筛，得谷胱苷肽高产菌株。
[0011] 所述步骤1)具体包括以下步骤：
[0012] 1.1)取对应出发菌株对数期菌液离心，弃上清液，用PBS缓冲液洗涤2~4次后收集 菌体；
[0013] 1.2)预处理：在步骤1.1)得到的菌体中加入预处理液(对数期菌液0.5~1倍体 积），摇匀后于25~35°C水浴保温5~lOmin，然后离心，弃上清液，用roS缓冲液洗涤2~4次 后收集囷体；
[0014] 1.3)去除细胞壁:在步骤1.2)得到的菌体中加入2.0~3.0 %蜗牛酶液(对数期菌 液0.5~1倍体积），摇匀后于25~40°C水浴保温30~60min，使菌体细胞转变为原生质体，然 后离心，弃上清液，用PBS缓冲液洗涤原生质体2~4次，再用高渗缓冲液(对数期菌液0.5~1 倍体积)悬浮，得对应出发菌株的原生质体悬液。
[0015] 所述预处理液的制备方法为：将12~23mL 0.2mol/L NaH2P〇4水溶液、1~4mL 0 · 2mol/LNa2HP〇4水溶液、0 · 01 ~0 · 03mL0 · lmo 1/L EDTA以及0 · 01 ~0 · 03mL巯基乙醇混合； [0016] 所述2.0~3.0%蜗牛酶液的制备方法为：将2.5~3. Omg蜗牛酶溶于100mL PBS缓 冲液。
[0017]所述步骤2)具体包括以下步骤：
[0018] 2.1)将多形汉逊酵母原生质体和粟酒裂殖酵母原生质体分别紫外照射1~3min， 然后黑暗中保存15~20min;
[0019] 2.2)经过步骤2.1)后，将多形汉逊酵母原生质体和粟酒裂殖酵母原生质体于高渗 缓冲液中混合，然后离心收集细胞，向收集的细胞中加入PEG-CaCl2缓冲液(对数期菌液0.5 ~1倍体积），摇匀后于25~35°C水浴保温10~20min，然后离心，弃上清液，用高渗缓冲液洗 涤2~4次后收集细胞，得融合处理细胞。
[0020] 所述紫外照射的方法为:将多形汉逊酵母原生质体和粟酒裂殖酵母原生质体的悬 液分别涂布在空白培养皿中，然后用紫外灯进行照射，紫外灯照射功率为15~30W，照射距 离为30~50cm。
[0021] 所述PEG-CaCh缓冲液的制备方法为:将6~8g PEG6_、0.8~l.Og CaCl2和30~50 yL巯基乙醇溶于20mL PBS缓冲液。
[0022]所述步骤3)具体包括以下步骤：
[0023] 3.1)初步培养:将融合处理细胞悬浮于高渗缓冲液(对数期菌液0.5~1倍体积） 中，然后涂布于固体高渗培养基上，于28~37°C培养36~60h后挑选50~100株长势较好的 单菌落，得候选菌株；
[0024] 3.2)高温筛选:将步骤3.1)中得到的候选菌株接种于固体YPD培养基上后于48°C 培养36~60h，将生长出的单菌落作为用于复筛的菌株；
[0025] 3.3)将步骤3.2)中得到的用于复筛的菌株接种于乙醇选择固体培养基中后于28 ~37°C培养36~60h，将生长出的单菌落转接在钼酸钠选择固体培养基中，并于28~37°C培 养36~60h，生长出的单菌落即谷胱苷肽高产菌株;所述乙醇选择固体培养基为额外添加有 4~6%乙醇的固体YPD培养基，钼酸钠选择固体培养基为额外添加有2.5~3mmol/L钼酸钠 的固体YTO培养基。
[0026] 所述高渗缓冲液的制备方法为:将5.2~5.5g KC1溶于100mL PB缓冲液。
[0027] 所述多形汉逊酵母选自多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)菌株DL-18;粟酒 裂殖酵母选自粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyce spombe)菌株(S.pombe 2.1794)。
[0028] 本发明的有益效果体现在：
[0029] 本发明首先制备出多形汉逊酵母和粟酒裂殖酵母的融合子，然后将耐高温特性以 及钼酸钠和乙醇耐受作为筛选依据，通过高温筛选得到耐高温菌株，再通过耐钼酸钠和乙 醇复筛得GSH高产菌株。本发明可高效筛得GSH高产的融合子，筛选得到的融合子具有耐高 温、生长速度快、遗传稳定、GSH高产等优点，为GSH的大规模生产提供了具有应用价值的菌 株。
【附图说明】
[0030] 图1为72#菌株的连续8代培养GSH产量结果。
【具体实施方式】
[0031]下面结合附图和实施例对本发明做详细说明。
[0032]( - )技术路线以及出发菌株、培养基、试剂
[0033]本发明将多形汉逊酵母菌株和粟酒裂殖酵母菌株作为出发菌株(亲本），利用细胞 融合技术整合两种亲本酵母菌株的优势性能，实现提高融合子的优势性能，进而提高GSH的 生产效率。
[0034]本发明涉及的菌株：
[0035] 多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)DL_18,由
【申请人】本人于中国专利"多形汉 逊酵母突变菌株及其在谷胱甘肽生物合成中的应用"（公开号CN103060210A，【公开日】： 2013.4.24)中公开;粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyce spombe)菌株(S.pombe 2.1794)， 购自中国科学院微生物研究所。
[0036]本发明涉及的培养基：
[0037] ①液体Yro培养基:酵母浸粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，pH自然。
[0038] ②固体Yro培养基:上述液体Yro培养基中另加入琼脂粉2〇g/L。
[0039] ③乙醇选择固体培养基:额外添加有4%乙醇的固体Yro培养基（添加体积数参照 液体YH)培养基体积）。
[0040] ④钼酸钠选择固体培养基:额外添加有2.5mmol/L钼酸钠的固体Yro培养基。
[0041 ]⑤固体高渗培养基:酵母浸粉l〇g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L，以 及KC1 40g/L。
[0042]本发明涉及的主要试剂：
[0043]① PBS缓冲液，制备方法：14.6g甘露醇溶于100mL PB缓冲液。
[0044] ② 1?缓冲液，制备方法:将0.2mol/L NaH2P〇4水溶液87.7mL与0.2mol/L NaH2P〇4水 溶液12.3mL混合。
[0045] ②预处理液，制备方法：将0.2mol/L NaH2P〇4 17.54mL，0.2mol/L Na2HP〇4 2.46mL，0. lmol/L EDTA 0.02mL，以及0.02mL巯基乙醇混合。与现有的预处理液相比，可以 提高细胞融合率。
[0046]③2.5%蜗牛酶液，制备方法:将2.5mg蜗牛酶(生工生物工程上海（股份)有限公 司，5000U)溶于100mL PBS缓冲液。
[0047]⑤高渗缓冲液的制备方法:将5.2g KC1溶于100mL PB缓冲液。
[0048] ⑥PEG-CaCl2缓冲液，制备方法：将8g roG6Q()()，0.9g CaCl2和40yL巯基乙醇溶于 20mL PBS缓冲液。
[0049] (二)具体步骤
[0050] 1、原生质体的制备(除1.1外，两亲本原生质体制备方法是一致的）
[0051 ] 1.1)菌种培养:制备粟酒裂殖酵母对数期菌液，参考中国专利"一种酵母融合子的 制备及快速筛选方法(公开号丄价050630124，【公开日】2015.11.18);
[0052] 将多形汉逊酵母DL-18种子液转接到液体YH)培养基中，于38°C、140r/min恒温摇 床培养18h，得到多形汉逊酵母DL-18对数期菌液。种子液制备参考中国专利"多形汉逊酵母 突变菌株及其在谷胱甘肽生物合成中的应用"（公开号：CN1 030602 10A，【公开日】： 2013.4.24)。
[0053] 1.2)收集细胞:分别取上述对数期菌液lmL于离心管中，6000r/min离心10min，弃 上清液，用PBS缓冲液洗涤2次，收集菌体。
[0054] 1.3)预处理：加入lmL预处理液于上述1.2)得到的菌体中，摇匀，30°C水浴处理 lOmin，6000r/min离心5min，弃上清液，用PBS缓冲液洗涤2次，收集菌体。
[0055] 1.4)去除细胞壁:加入lmL 2.5 %蜗牛酶液于上述1.3)得到的菌体中，摇匀，35 °C 水浴锅内保温lh，镜检(80%以上的菌体细胞转变为原生质体），4000r/min离心10min，用 PBS缓冲液洗涤原生质体3次，除去酶液，再加入lmL高渗缓冲液得原生质体悬液。
[0056] 2、原生质体的融合
[0057] 2.1)将两亲本原生质体悬液分别均匀涂布于空白培养皿中，用紫外灯照射（紫外 灯照射功率为20W，照射距离为50cm，照射的作用是保证筛选率）2min，黑暗中保存20min， 3000r/min离心10min，再将离心得到的细胞分别用0.5mL高渗缓冲液悬浮，得两亲本原生质 体细胞悬液。
[0058] 2.2)将步骤2.1)得到的两亲本原生质体细胞悬液混合，3000r/min离心10min，得 细胞沉淀。向细胞沉淀中加入lmL PEG-CaCl2缓冲液，震荡摇匀，30°C恒温水浴处理20min。 4000r/min离心5min，收集细胞。用高渗缓冲液洗涤2次，收集细胞，即得融合处理细胞。 [0059] 3、目标菌株的筛选
[0060] 3.1)初步筛选:在步骤2.2)中得到的融合处理细胞中加入lmL高渗缓冲液得悬液， 将悬液涂布于固体高渗培养基上，于37°C恒温培养48h后在固体高渗培养基上随机挑选100 株生长较快、长势较好的单菌落(100株菌）。
[0061] 3.2)高温筛选:将步骤3.1)中得到的100株菌，连同作为阳性对照和阴性对照的多 形汉逊酵母DL-18和粟酒裂殖酵母（出发菌株），在无菌条件下，分别在固体YH)培养基中，48 °C恒温划线培养48h，筛得可耐高温的菌株。结果，此100株菌中仅有45株菌能够在48 °C的环 境下正常生长。对照组显示，在48 °C的环境下，多形汉逊酵母DL-18可以正常生长，而粟酒裂 殖酵母却无法正常生长。综上说明，在48°C的环境下，可正常生长的45株菌为融合子或多形 汉逊酵母。
[0062] 3.3)乙醇耐受性筛选和钼酸钠耐受性筛选:将步骤3.2)中得到的45株菌，连同作 为阳性对照的多形汉逊酵母DL-18和作为阴性对照的粟酒裂殖酵母，接种于乙醇选择固体 培养基中，37 °C恒温培养48h后，将正常生长菌落转接在钼酸钠选择固体培养基中，37 °C恒 温培养48h。结果，45株菌中仅有3株菌正常生长。对照组显示，乙醇选择固体培养基上，多形 汉逊酵母DL-18无法正常生长，而粟酒裂殖酵母正常生长;钼酸钠选择固体培养基上，多形 汉逊酵母DL-18和粟酒裂殖酵母均生长较差。综上说明，可正常生长的3株菌为目标融合子， 其编号分别为35#、67#和72#。
[0063](三)发明效果说明
[0064] 1、利用DTNB[ 5，5 ' -二硫双-(2-硝基苯甲酸）]-谷胱甘肽还原酶循环法（简称DTNB 法)检测GSH的含量
[0065]将步骤3.3)得到的3株目标融合子，连同作为阳性对照的多形汉逊酵母DL-18和作 为阴性对照的粟酒裂殖酵母，分别接种于液体Yro培养基中，37°C发酵培养72h。取新鲜发酵 液5mL，7000r/min离心10min，上清液用于胞外GSH的测定，沉淀酵母细胞用于胞内GSH的测 定，二者之和为GSH的总产量。胞外测定为取上清液0.5mL，加入1.5mL 0.06 %NaOH，0.5mL 0.03 %甲醛，摇匀，静置2min，加入2.5mL DTNB分析液，摇匀，25 °C水浴5min，测412nm吸光 度。胞内测定是用蒸馏水洗涤新鲜酵母两次，离心，弃上清，测湿重，加入50%乙醇(细胞湿 重：50 % 乙醇=lg: 7mL)，震摇50min，离心，取上清0 · 5mL，加入1 · 5mL 0 · 06 %NaOH，0 · 5mL 0.03 %甲醛，摇匀，静置2min，加入2.5mL DTNB分析液，摇匀，25 °C水浴5min，测412nm吸光 度。结果表明，采用DTNB法测得35#、67#和72#融合子的GSH的总产量分别为454.7mg/L、 451.6mg/L、449.5mg/L，参见表 1。
[0066] 表1 DTNB法测得GSH产量
[0067]
[0068] 2、高产菌株遗传稳定性
[0069] 将筛选得到的35#、67#和72#融合子，分别接种到液体YPD培养基中，37°C，130r/ min，恒温培养，48h传一代，连续传8代，分别对每一代进行GSH产量的检测。72#菌株结果如 图1所示，35#，67#和72#菌株的GSH产量下降大致在5%之内，可见筛选得到的高产融合子具 有良好的遗传稳定性。
[0070] 3、方法重复性
[0071] 经过多次的重复实验(从出发菌株开始进行融合子制备以及筛选），每次均可以得 到3~5株目标融合子，GSH产量均得到提高，且具有遗传稳定性。
【主权项】
1. 一种酵母融合子的制备及谷胱苷肽高产菌株的筛选方法，其特征在于:包括以下步 骤： 1) 以多形汉逊酵母和粟酒裂殖酵母为出发菌株，分别制备原生质体； 2) 将多形汉逊酵母原生质体和粟酒裂殖酵母原生质体进行融合，得到融合处理细胞； 3) 对融合处理细胞进行初步培养后利用48~53°C高温培养对初步培养得到的菌株进 行初筛，对初筛后保留的菌株进行乙醇以及钼酸钠耐受性复筛，得谷胱苷肽高产菌株。2. 根据权利要求1所述一种酵母融合子的制备及谷胱苷肽高产菌株的筛选方法，其特 征在于:所述步骤1)具体包括以下步骤： 1.1) 取对应出发菌株对数期菌液离心，弃上清液，用PBS缓冲液洗涤2~4次后收集菌 体； 1.2) 预处理:在步骤1.1)得到的菌体中加入预处理液，摇匀后于25~35°C水浴保温5~ lOmin，然后离心，弃上清液，用PBS缓冲液洗涤2~4次后收集菌体； 1.3) 去除细胞壁:在步骤1.2)得到的菌体中加入2.0~3.0 %蜗牛酶液，摇匀后于25~ 40°C水浴保温30~60min，使菌体细胞转变为原生质体，然后离心，弃上清液，用PBS缓冲液 洗涤原生质体2~4次，再用高渗缓冲液悬浮，得对应出发菌株的原生质体悬液。3. 根据权利要求2所述一种酵母融合子的制备及谷胱苷肽高产菌株的筛选方法，其特 征在于：所述预处理液的制备方法为：将12~23mL0.2mol/L NaH2P〇4水溶液、1~4mL 0.2mol/L Na2HP〇4水溶液、0.01 ~0.03mL O.lmol/L EDTA以及0.01 ~0.03mL巯基乙醇混合； 所述2.0~3.0 %蜗牛酶液的制备方法为:将2.5~3. Omg蜗牛酶溶于100mL PBS缓冲液。4. 根据权利要求1所述一种酵母融合子的制备及谷胱苷肽高产菌株的筛选方法，其特 征在于:所述步骤2)具体包括以下步骤： 2.1) 将多形汉逊酵母原生质体和粟酒裂殖酵母原生质体分别紫外照射1~3min，然后 黑暗中保存15~20min; 2.2) 经过步骤2.1)后，将多形汉逊酵母原生质体和粟酒裂殖酵母原生质体于高渗缓冲 液中混合，然后离心收集细胞，向收集的细胞中加入PEG-CaCl 2缓冲液，摇匀后于25~35°C 水浴保温10~20min，然后离心，弃上清液，用高渗缓冲液洗涤2~4次后收集细胞，得融合处 理细胞。5. 根据权利要求4所述一种酵母融合子的制备及谷胱苷肽高产菌株的筛选方法，其特 征在于:所述紫外照射的方法为:将多形汉逊酵母原生质体和粟酒裂殖酵母原生质体的悬 液分别涂布在空白培养皿中，然后用紫外灯进行照射，紫外灯照射功率为15~30W，照射距 离为30~50cm。6. 根据权利要求4所述一种酵母融合子的制备及谷胱苷肽高产菌株的筛选方法，其特 征在于:所述PEG-CaCl2缓冲液的制备方法为:将6~8g PEG6_、0.8~1.0g CaCl2和30~50μ L巯基乙醇溶于20mL PBS缓冲液。7. 根据权利要求1所述一种酵母融合子的制备及谷胱苷肽高产菌株的筛选方法，其特 征在于:所述步骤3)具体包括以下步骤： 3.1) 初步培养:将融合处理细胞悬浮于高渗缓冲液中，然后涂布于固体高渗培养基上， 于28~37 °C培养36~60h后挑选50~100株长势较好的单菌落，得候选菌株； 3.2) 高温筛选:将步骤3.1)中得到的候选菌株接种于固体YPD培养基上后于48°C培养 36~60h，将生长出的单菌落作为用于复筛的菌株； 3.3)将步骤3.2)中得到的用于复筛的菌株接种于乙醇选择固体培养基中后于28~37 °C培养36~60h，将生长出的单菌落转接在钼酸钠选择固体培养基中，并于28~37°C培养36 ~60h，生长出的单菌落即谷胱苷肽高产菌株;所述乙醇选择固体培养基为额外添加有4~ 6%乙醇的固体YH)培养基，钼酸钠选择固体培养基为额外添加有2.5~3mmol/L钼酸钠的固 体YH)培养基。8. 根据权利要求2、4或7所述一种酵母融合子的制备及谷胱苷肽高产菌株的筛选方法， 其特征在于:所述高渗缓冲液的制备方法为:将5.2~5.5g KC1溶于lOOmL PB缓冲液。9. 根据权利要求1所述一种酵母融合子的制备及谷胱苷肽高产菌株的筛选方法，其特 征在于:所述多形汉逊酵母选自多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)菌株DL-18。
【文档编号】C12N15/01GK105838706SQ201610340694
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】钱卫东, 谢海艳, 吴启航
【申请人】陕西科技大学