一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株及构建及发酵方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术与应用和发酵工程领域，具体地涉及一种生产核黄素的 大肠杆菌菌株及构建方法及发酵技术。
【背景技术】
[0002] 核黄素，又称维生素 B2,是一种黄色的天然水溶性B族维生素。其分子式为 C17H2QO6N4,分子量为376，是人体必需的13种维生素之一。核黄素是机体内许多酶系统的重 要辅基一黄素腺嘌呤二核甘酸(FAD)与黄素单核甘酸(FMN)的合成的前体物质。作为黄素蛋 白的辅酶参与传递氢的有关代谢，在呼吸和生物氧化中起着重要的作用，是生命活动中不 可缺少的维生素，是维持人和动物机体正常物质代谢所必须的营养物质。
[0003] 核黄素已经广泛用于饲料、食品和医药领域。核黄素能促进蛋白质、脂肪、碳水化 合物的代谢，具有维护皮肤和粘膜的生理功能。若机体缺乏核黄素，就会影响生物氧化作 用，引起物质代谢紊乱，出现一系列病症，严重时会引起死亡。它作为常用临床药物，用于辅 助治疗口角炎、眼角膜炎、白内障、眼角膜及口角血管增生等多种疾病。
[0004] 核黄素主要生产方法为化学半合成法和微生物发酵法，其中，半合成法生产核黄 素以D-核糖为原料，纯度较高，但得率只有60%左右，原料浪费较大，而微生物发酵法生产 核黄素则具有生产工艺简单、原料廉价、对环境无污染等优点，且只需要一步，目前已成为 核黄素生产的主要方法。
[0005] 用于核黄素发酵生产的菌株主要有酵母和基因工程菌两大类。1940年，利用阿舒 假囊酵母(Eremothecium ashbyii)发酵生产核黄素首次获得了成功，产量为500微克/毫 升；1946年，利用棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)也实现了在发酵液中积累少量的核黄素； 1947年，以碎麦芽或乳清为原料，丙酮丁醇梭状杆菌(Clostridium acetobutylicum)发酵 法被首次应用于商业化生产核黄素。利用真菌进行核黄素生产存在着诸如发酵周期过长、 原料成分配比复杂、需加入不饱和脂肪酸来促进核黄素的产量等缺点。随着基因工程技术 的发展，枯草芽孢杆菌(B · subti 1 is)和产氨棒状杆菌(Corynebactia aminogensis)等产核 黄素工程菌相继构建成功，这些工程菌具有发酵周期短(2~3天）、原料要求简单、产量高等 优点，在核黄素的微生物发酵生产中显示了强大的生命力。特别是相继构建成功的 Bacillus subtilis等产核黄素工程菌，最高报道在三天时间内可达到20~27g/L。
[0006] 目前生产上应用的产核黄素枯草芽孢杆菌多为通过多轮理化诱变之后筛选到的， 由于随机诱变引入突变点的不确定性，这些生产菌株往往具有比较复杂的遗传背景，使得 通过代谢工程进一步合理改进这些工业菌株面临着较大的挑战和困难。同时，大量未知突 变的存在也使得对进一步合理改进的解释和评估变得更为复杂了。另外，由于诱变的随机 性，这些高产菌株在逐渐积累和目标产品高产相关的正突变的过程中也不可避免的积累了 一些不利突变点以及一些与目标表型无关的突变点。同野生菌株相比，它们大都在菌体生 长速度、底物利用种类、对不利环境的耐受性或遗传稳定性等方面存在缺陷。由于和这些不 良性状相关的基因型通常非常复杂，通过代谢工程方法消除这些不良性状也面临着很大的 困难。
[0007] 大肠杆菌作为一种重要的模式菌株，对其生理生化特性及遗传背景已经有了比较 深入的了解，相关的分子生物学方法和基因操作技术都比较成熟，有利于通过代谢工程及 合成生物学的合理设计来改进菌种。
[0008] 经检索，目前未见有使用代谢工程同时改造大肠杆菌pfkA、edd和eda基因，并且应 用发酵法生产核黄素的报道。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株。
[0010] 本发明的第二个目的是提供一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株的构建方法。
[0011] 本发明的第三个目的是提供一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株的发酵培养基。
[0012] 本发明的第四个目的是提供一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株的补料培养 基。
[0013] 本发明的第五个目的是提供一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株的发酵方法。
[0014] 本发明的第六个目的是提供一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株的用途。
[0015] 本发明的技术方案概述如下：
[0016] 一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的构建方法，包括如下步骤：
[0017] (1)获得 rib-int 段：
[0018] 以SEQIDNo·4所示rib-F和以SEQIDNo·5所示rib-R为引物，以p20C_EC10为模 板，通过PCR的方法，得到以SEQ ID No. 1所示rib-int片段；
[0019] (2)构建 pLSOl 质粒：
[0020] 以SEQ ID Νο·6所示Cat-F和以SEQ ID Νο·7所示Cat-R为引物，以pCas9为模板，通 过PCR扩增，得到氯霉素乙酰转移酶基因，将氯霉素乙酰转移酶基因命名为Cat基因，通过 CEPC组装技术，将Cat基因和来自于pTKRed质粒上的pSClOl复制子组装成质粒pRB 01;将步 骤（1)获得的rib-int片段通过酶切连接的方法，连接到pRB 01质粒上面，得到质粒命名为 pLR 01；
[0021] (3)构建EC-rib 01 菌株：
[0022] 将步骤(2)获得的pLR 01质粒转入大肠杆菌E.coli MG1655,得到菌株EC-Rib 01;
[0023] (4)构建EC-Rib 〇2菌株：
[0024]敲除步骤(3)所获得的菌株EC-Rib 01基因组的糖酵解途径中的pfkA基因和ED途 径中的edd基因及eda基因，得到菌株命名为EC-Rib 02。
[0025] 上述方法构建的一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02。
[0026] 一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的发酵培养基，以每1L计含有： 葡萄糖5_30g，酵母抽提物l-15g，硫酸铵0.5-5g，硫酸镁0.05-1〖，磷酸氢二钠1_10〖，磷酸二 氢钾1-1(^，尿素1-1(^，梓檬酸铁胺10-10011^，氯化| 1510-10011^，硫酸锌0.01-0.111^，氯化猛 0.01-0. lmg，硼酸0.01-0 · lmg，氯化钴0.01-0 · lmg，硫酸铜0.01-0 · lmg，氯化镍0.01-0 · lmg， 钼酸钠0.01-0. lmg，余量为水。
[0027] 一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的补料培养基，以每1L计含有： 葡萄糖500_800g，酵母抽提物5-20g，硫酸铵l-10g，硫酸镁0. l-5g，磷酸氢二钠2-5g，磷酸二 氢钾2-158，柠檬酸铁胺10-10011^，氯化钙10-10011^，硫酸锌0.01-0.111^，氯化锰0.01-0· lmg，硼酸0.01-0. lmg，氯化钴0.01-0. lmg，硫酸铜0.01-0. lmg，氯化镍0.01-0. lmg，钼酸 钠0.01-0. lmg，余量为水。
[0028] 一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的发酵方法，包括如下述步骤：
[0029] (1)活化菌株：将高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02在LB固体培养基中划 线，37°C培养10_20h，使菌株复壮；
[0030] (2)种子液的培养:将步骤（1)获得的活化菌接种到LB液体培养基中，32-37°C， 180-240rpm培养10-20h，然后将所得菌液按照体积比为1%-10%的接种量接种到一种用于 高产核黄素大肠杆菌工程菌株的发酵培养基中，32-37°C，180-240rpm培养10-20h，得到种 子液；
[0031] (3)发酵罐发酵:将步骤(2)所获得的种子液按照体积比为的比例接种到 装有2-3L-种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株的发酵培养基的5L发酵罐中，加入氯霉 素，使浓度为5_40ug/L，在35-37°C，pH=6.5-7.3，搅拌转速300-800rpm的条件下发酵，当培 养基中葡萄糖浓度降到l_2g/L以下时，采用连续补料的方式补充一种用于高产核黄素大肠 杆菌工程菌株EC-Rib 02的补料培养基;补料速度为0.1-0.5ml/min，当溶氧水平降至10% 以下时，增加发酵罐的压力至〇. 02-0.1 MPa;当发酵液中的核黄素浓度不再增加时，停止发 酵。
[0032]发酵参数的测定以及记录:在发酵过程中，每2_8h取一次样，分别测定发酵液中的 菌体浓度，发酵液中残糖浓度以及发酵液中核黄素浓度，并记录。
[0033] 一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02发酵生产核黄素的用途。
[0034]本发明的优点：
[0035]本发明的一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02核黄素产量达到10.47g/ L，是