一种维吉尼亚链霉菌ibl14产青霉素重组菌株的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物医药领域，确切地说是一种维吉尼亚链霉菌IBL14产青霉素重组 菌株的构建方法。
【背景技术】
[0002] 青霉素是英国人Alexander Fleming 1928年意外发现地一种毒性低、疗效高的抗 生素(许钟巧.（2005)发现青霉素.健康博览，29)。1939年，Fleming将历时10年培养的菌种 提供给牛津大学澳大利亚病理学家弗洛里（Howard Florey)和英国生物化学家钱恩 化arnest化ain)J940年，他们完成了制备青霉素结晶体和动物实验(林荫.（2007)青霉素 的辉煌往事.科学24小时，40-42)。1941年，第二次世界大战爆发，美国政府下达了大规模 量产青霉素，W供战时之需的艰巨任务，当时的辉瑞公司采用其特有的深罐发酵技术完成 了任务，成为了世界上首个量产青霉素的公司（许钟巧.（2005)发现青霉素.健康博览，29)。 从发现到量产历时14年，临床首选于G+球菌所致的感染。
[0003] β-内酷胺抗生素是具有四元内酷胺环的一大类抗生素，主要代表有青霉素和头抱 菌素。青霉素具有与细菌细胞壁肤聚糖单体中D-丙氨酷-D-丙氨酸相似的结构，与其竞争转 肤酶，阻碍肤聚糖的形成，造成细胞壁的缺损，进而起到杀菌作用(于海军.（2009)β-内酷胺 类抗生素作用机制及头抱菌素发展.石家庄职业技术学院学报.21,12-16)。
[0004] β-内酷胺酶是一类破坏β-内酷胺环抗生素酶的总称。它使β-内酷胺环水解开环生 成青霉素嚷挫酸，该酶功能的缺失可使得维吉尼亚链霉菌IBL14中青霉素得到积累，同时β-内酷胺酶和青霉素酷胺酶水解基因和头抱菌素代谢支路中的异青霉素-Ν异构酶基因的缺 失使得维吉尼亚链霉菌IBL14中青霉素的产量得到进一步的提高。
[0005] 众所周知，当前青霉素生产的主要菌株是真菌（如：产黄青霉Penicillium chrysogenum和点青霉化nicillium nota化m)，由细菌维吉尼亚链霉菌生产青霉素未见报 道。
[0006] 近年来，基于CRISPR-Cas系统发展而来的DNA编辑新技术，成功地应用于细胞染色 体中基因组编辑与改造，在医药、食品、农业等领域中显示出了巨大的潜力（Doudna， J.A.and Charpentier,E.(2014)The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346)。但到目前为止，广泛应用的CRISPR-Cas系统均为CRISPR-Cas II型系统。
[0007] 维吉尼亚链霉菌IBkl4(Streptomyces virginiae IBL14)是本实验室自行分离 纯化得到的一株能降解多种酱体化合物的放线菌。对菌株IBkl4全基因组测序和数据库分 析发现，菌株IBkl4中存在CRISPR-Cas I-SV14B型系统。应用维吉尼亚链霉菌IBkl4自身 的化S I-SV14B型系统对其生产青霉素的相关基因进行编辑，得到生产青霉素重组菌株未 见报道。此外，该方法的建立对其他抗生素的生产也具有指导意义。
【发明内容】
[0008] 本发明要解决的技术问题是提供一种维吉尼亚链霉菌IBL14产青霉素重组菌株的 构建方法，通过祀向基因与基因编辑模板的设计与质粒构建及祀向基因与基因编辑模板重 组质粒在链霉菌中的转化操作，对染色体中与产青霉素相关的基因进行编辑。本发明通过 敲除青霉素水解酶、青霉素酷胺酶及异青霉素-N异构酶的基因，从而实现提高青霉素产量 之目的。
[0009] 采用如下技术方案：
[0010] -种维吉尼亚链霉菌IBL14产青霉素重组菌株的构建方法，其特征在于:包括W下 步骤；
[0011] (1)根据维吉尼亚链霉菌IBL14基因组测序数据，确定β-内酷胺酶、青霉素酷胺酶 及异青霉素-Ν异构酶Ξ个祀向基因的DNA序列；
[001引（2)使用Pfu DNA聚合酶通过PCR反应分别扩增得到末端带削良制性内切酶识别切 割位点的，且具有overlap PCR互补序列的祀向基因上、下同源臂的PCR片段；
[0013] (3)利用overlap PCR反应将上、下两个同源臂结合构建编辑基因模板；
[0014] (4)直接合成首、尾分别包含启动子J23119和RNA终止子的祀向基因片段；
[001引（5)利刷良制性酶切位点上的粘性末端和连接酶将步骤(3)、步骤(4)获得的DNA片 段连接到地C1139上得到基因编辑质粒；
[0016] (6)在含链霉菌的高渗溶液中添加溶菌酶制备维吉尼亚链霉菌IBL14原生质体；
[0017] (7)将步骤巧）中得到基因编辑质粒转化到维吉尼亚链霉菌IBL14原生质体中得到 基因编辑后的重组子；
[0018] (8)对重组子染色体进行PCR和基因测序分析，确证重组子为基因编辑后的目的重 组菌株，并根据抑菌圈实验结果筛选抗性能力强的目的重组菌株。
[0019] 所述的一种维吉尼亚链霉菌IBL14产青霉素重组菌株的构建方法，其特征在于:维 吉尼亚链霉菌IBL14染色体中β-内酷胺酶基因及产青霉素基因具有如表1所描述的核巧酸 序列，其青霉素合成途径中的异青霉素-Ν异构酶的功能缺失导致异青霉素-Ν不能转化为青 霉素 Ν，β-内酷胺酶和青霉素酷胺酶的功能缺失导致青霉素不能分别转化为青霉酸和6氨基 青霉烧酸，进而共同导致青霉素的积累。
[0020] 所述的一种维吉尼亚链霉菌IBL14产青霉素重组菌株的构建方法，其特征在于:所 述的构建青霉素重组菌株是应用维吉尼亚链霉菌IBL14中自身的CRISPR-化S I-SV14B型系 统对维吉尼亚链霉菌IBL14中主要影响青霉素生产的β-内酷胺酶基因、青霉素酷胺酶基因 及异青霉素 -Ν异构酶基因进行敲除、插入、无痕点突变及任意组合。
[0021] 所述的一种维吉尼亚链霉菌IBL14产青霉素重组菌株的构建方法，其特征在于:该 方法构建所得到的维吉尼亚链霉菌IBL14重组菌株可直接用于青霉素及其衍生物生产。
[0022] 一种维吉尼亚链霉菌IBL14产青霉素重组菌株的构建方法，其特征在于:维吉尼亚 链霉菌IBL14染色体中含有水解青霉素的β-内酷胺酶(β-lactamase)基因和产青霉素基因 簇、及因此而建立的一种产青霉素重组菌株的构建方法。本发明目的通过W下技术方案来 实现：
[0023] 所述的维吉尼亚链霉菌IBL14染色体中水解青霉素的基因和产青霉素基因簇具有 如表1所描述的核巧酸序列、且酶生产青霉素过程具有如附图1所示的代谢途径。
[0024] 有益效果：
[00巧]本发明首创了维吉尼亚链霉菌生产青霉素的途径;提供了CRISPR-CAS I-SV14B型 系统在链霉菌抗生素生产中的应用；为CRISPR-CAS I-SV14B型系统在其它抗生素生产菌株 研究中提供了新的方法和技术选择。应用维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas I-SV14B 型基因编辑系统对链霉菌遗传基因进行编辑可方便、快速、高效地改变生物体的遗传特征。 该基因编辑的方法可应用于生物制药、食品、农业及其它生物应用领域中。
[0026] 说明书附图
[0027] 图1维吉尼亚链霉菌IBL14青霉素代谢途径;异青霉素 -N异构酶/EC 5.1.1.17的功 能缺失导致异青霉素 -N不能转化为青霉素 N(penicillin N)，β-内酷胺酶/EC3.5.2.6的功 能缺失导致青霉素不能转化为青霉酸(penicilloic acid)，青霉素酷胺酶/EC3.5.1.11的 功能缺失导致青霉素不能转化为6氨基青霉烧酸
[002引 （6-aminopenicillanic acid)，进而共同导致青霉素(penicillin)的积累；注:红 色虚线代表被敲除基因；
[0029] 图2抑菌圈抗性检测，其中A表明野生型I化14对大肠杆菌D册α无抑制;B表明敲除 后的重组子对大肠杆菌Μ15α有抑制。
【具体实施方式】
[0030] 为了更充分理解本发明的技术内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作 进一步介绍和说明，旨在更好的解释本发明的内容，W下实施例不限制本发明的保护范围。 此外，在所列实施例中如无特别说明均采用如下材料：
[003。 1)菌种
[0032] 宿主为Str邱tom