β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程的技术领域，具体说是一种β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法。
【背景技术】
[0002] β-胡萝卜素分子式为C4QH55,是合成维生素 Α的前体物质，是一种抗氧化剂，具有解 毒作用，是维护人体健康不可缺少的营养，在抗癌、预防心血管疾病、白内障及抗氧化上具 有显著的功能，并进而防止老化和衰老引起的多种退化性疾病。
[0003] 目前生产β_胡萝卜素的方法主要有植物提取法，化学合成法，微生物发酵法。植物 提取法是指从胡萝卜等富含胡萝卜素的植物中提取胡萝卜素，化学合成法是以化学原料 化学法合成胡萝卜素。微生物发酵法是指以三孢布拉氏霉，杜氏海藻，酵母等微生物发酵 生产β-胡萝卜素。其中，以三孢布拉氏霉发酵生产β-胡萝卜素最具工业应用前景。
[0004] 三孢布拉氏霉属于霜霉目，白锈科，拉丁名是Blakeselea trispora，有性无性繁 殖，有(+)()两种接合型，即正负两种菌株，单独的(+)或（）菌发酵产β-胡萝卜素的能力很低， 低于45!^/1。（+)、（）菌株在PDA平板上形成白色菌落，没有明显的产色素能力。
[0005] 正负菌株按不同比例混合后发酵，会产生较多的β-胡萝卜素。其中，正负菌株按1:4 混合后产量最高，达到了 350mg/L。
[0006] 三孢布拉氏霉在平板上生长呈蔓延状，菌丝生长快，较难挑取纯菌落。在培养基中 添加0.05%的0P乳化剂，限制菌丝蔓延，获得较规则的菌落，便于挑取得到较纯菌株。
[0007] US7252965B2公开了一种利用六十细胞仪来筛选β-胡萝卜素高产菌种的方法。将 孢子悬液经紫外线照射后，用流式细胞仪来处理诱变后的孢子液。通过分析孢子产生的特 定荧光强弱，来判断其产β-胡萝卜素能力的大小。荧光越强，生产能力越强。利用这种方法， 筛选到了 一株高产菌株，产量达到9g/L。
[0008] CN104805167A公开了一种生产β-胡萝卜素的方法及其基因工程菌。其中包括以下 步骤:培养大肠杆菌基因工程菌，从发酵液中获得β-胡萝卜素，所述的大肠杆菌基因工程菌 是含有外源的含四个胡萝卜素合成基因的表达载体的大肠杆菌，该四个胡萝卜素合成基 因分别是：crtE、crtI、crtB和crtY，并且，所述的大肠杆菌基因工程菌还含有含四个ΜΕΡ途 径基因的表达载体，该四个MEP途径基因分别是:dxs、i d i、i spD和i spF。本发明过表达MEP途 径中的4个酶，构建不同强度启动子的ΜΕΡ途径，从而提高β-胡萝卜素的产量。
[0009] CN101096355-种从胡萝卜中提取天然β-胡萝卜素的方法，公开了一种从新鲜胡萝卜 中提取天然β-胡萝卜素的工艺。所述的方法是新鲜胡萝卜经过绞汁以后，倒入高压均质机中 均质，均质后的胡萝卜浓汁中加入沉淀剂CaC12 · 2Η20和稳定剂氨水/乙醇，经过离心，弃去 上清液，得到橙红色沉淀;将沉淀经过冷冻干燥机冷冻干燥，得到粉末状干燥的沉淀，在沉 淀中加入有机溶剂石油醚萃取其中的β-胡萝卜素，之后旋转蒸发浓缩，回收有机溶剂，得到 胡萝卜素油状物。所提得的胡萝卜素纯度达90%，提取量达180mg/100g，提取率可达80% 以上。该法具有工艺新颖，操作简单，成本低等特点，对研究开发从新鲜胡萝卜中提取天然β-胡萝卜素具有很高的参考价值。
[0010] CN1558953公开了三孢布拉霉的β-胡萝卜素的生物合成基因，其编码番茄红素环 化酶/八氢番茄红素合酶（carRP)和八氢番茄红素脱氢酶（carBhcarRP基因，其特征在于 DNA序列SEQ ID N0:1，编码氨基酸序列SEQ IDN0:3,其具有番茄红素环化酶/八氢番茄红素 合酶活性。carB基因，其特征在于DNA序列SEQ ID N0:2,编码氨基酸序列SEQ ID N0:4,其具 有八氢番茄红素脱氢酶活性。本发明还涉及（i)构建表达附加拷贝的所述基因的质粒的方 法和（ii)在所述基因的启动子控制下表达异源基因的方法。
[0011] CN103951600A-种提取盐藻中β-胡萝卜素的方法，公开了一种提取盐藻中的β-胡 萝卜素的方法，包括步骤有：（1)将盐藻泥或盐藻粉与蒸馏水以质量比1:5的比例充分混合， 以盐酸调节pH值至5-6.5;(2)将蛋白酶与上述盐藻液按质量比1:33.3~54.5混合后充分溶 解，保温、钝化；（3)将提取液经离心后取沉淀；（4)将沉淀与植物油以质量比1:5的比例混合 后加热、保持、静置冷却，过滤得油溶液。本发明方法采用添加少量的蛋白酶即可以起到破 坏细胞膜的作用，操作简便，节省了成本，适合于大规模工业化生产，同时省去了提纯后需 要再用油悬浮的工艺，本方法环境友好，可大规模推广使用。
[0012]上述方法中，植物法提取具有消耗原材料多，成本高，受原料影响较大等缺点。化 学合成法会合成对人体有害的中间产物，且不易分离。因此，微生物发酵法具有更广阔的应 用前景。而三孢布拉氏霉具有菌体生长快，生长条件要求低，胡萝卜素含量较高等优点，最 具前景。三孢布拉氏霉因其菌种的特殊性，用基因工程技术改造菌株难度较大，因此，较好 的改造方法还是选用诱变筛选的方法。一般的筛选方法盲目性较大，原理模糊，筛选工作量 大，效率低。
【发明内容】
[0013 ]本发明要解决的技术问题是提供一种β_胡萝卜素高产菌株的筛选方法。
[0014] 本发明为解决公知技术中存在的技术问题所采取的技术方案是： 本发明的胡萝卜素高产菌株的筛选方法，在PDA培养基中添加三孢酸，生成筛选培养 基;将三孢布拉氏霉的菌株制备为孢子悬液，并对孢子悬液进行紫外诱变;将诱变后的孢子 于筛选培养基中培养并形成菌落，挑取颜色深于出发菌株的菌落即为目的菌落。
[0015] 本发明还可以采用以下技术措施： 按筛选培养基质量的〇. 05%向筛选培养基中加入0P乳化剂。
[0016] PDA培养基内加入的三孢酸为三孢酸粗提物溶液，其制备过程为:将三孢布拉霉出 发菌株的正负菌株按1:4比例混合，在发酵培养基中发酵6天，得到发酵液;取100ML发酵液 并用稀盐酸调至pH2.0,然后7000r/min，离心10min后，留取上清溶液;在上述上清溶液中， 加入等体积氯仿，震荡萃取，分液，保留氯仿层；向氯仿层中加入相同体积的4%NaHC0 3溶液 萃取，留取NaHC03层;再将上述溶液的pH用稀盐酸调至2.0，加入相同体积氯仿，充分震荡， 萃取;将氯仿层旋转蒸干，得到三孢酸粗提物;三孢酸粗提物溶于100ML蒸馏水中，-20°C保 藏。
[0017] 发酵培养基中按质量百分比包括以下组分：玉米淀粉3.0%，黄豆饼粉2.0%， KH2PO4 0.25%，MgS〇4.7H20 0.02%，，豆油 3.0%，工业玉米浆 2.0%，VBi0.005%，柠檬酸三钠 0.3%，曲拉通100 0.1%，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚0.05%卬!1值自然。
[0018] 按PDA培养基质量的1%向PDA培养基内添加三孢酸粗提物溶液。
[0019] 按PDA培养基质量的2%向筛选培养基中添加琼脂粉，并于121°C灭菌20min。
[0020] PDA培养基的制备方法为，将土豆去皮，切成丁状，称取200g加入适量水中，煮沸 20min，用8层滤布过滤取清液，定容至1L，加入20g葡萄糖，琼脂粉20g，加热融化后，分装至 试管中，每只试管装液6-8mL，121°C灭菌20min后，即得PDA培养基。
[0021 ]将保藏的三孢布拉霉正负菌株取出，挑取少量菌体，涂于PDA培养中，27°C培养6-8 天，待孢子成熟后，保藏于4°C ;将正负菌孢子用无菌生理盐水洗下，用血球计数板计数后， 稀释至106个/mL;正负菌株按照1:4的比例，相对发酵培养基体积10%的比例接种于100mL发 酵培养基中，27 °C，220r/min，6天，获得菌体及发酵液;制备孢子液，取5mL孢子液于放有转 子的平板中，将平板置于磁力搅拌器上，转动中紫外照射4min，取O.lmL的处理后孢子液涂 布于筛选培养基上，生长2-4天，挑取目的菌落。
[0022] 本发明具有的优点和积极效果是： 本发明的胡萝卜素高产菌株的筛选方法中，在PDA培养基中添加三孢酸，刺激菌体生 产胡萝卜素，从而使菌落在筛选培养基上形成黄色菌落。经过诱变处理后的菌体，会因为 生产β-胡萝卜素能力不同而形成颜色深浅不一的菌落。菌落的黄色越深，代表其生产β-胡萝 卜素能力越强。从黄色较深的菌落中挑选菌落为高产胡萝卜素菌株，目的性强，可以大大提 高筛选效率，减少筛选所用时间及工作量。
【具体实施方式】
[0023] 以下通过实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
[0024]本发明的β_胡萝卜素高产菌株的筛选方法，在PDA培养基中添加三