一种双菌混合发酵生产l-鸟氨酸的方法

一种双菌混合发酵生产l-鸟氨酸的方法
【专利摘要】一种基于微生物发酵法在L?鸟氨酸的生产中的应用，属于生物技术领域。以重组菌B.subtilis 168/pMA5?argI作为精氨酸酶来源菌株和L?精氨酸高产菌株C.crenatum SYPA 5?5进行双菌混合发酵法以葡萄糖为底物生产L?鸟氨酸。对B.subtilis 168/pMA5?argI的转接时间和转接量进行优化，在2.5L C.crenatum SYPA5?5发酵液中，B.subtilis 168/pMA5?argI的最佳转接时间为72h，C.crenatum SYPA5?5和B.subtilis 168/pMA5?argI的菌种转接比例为1:500～530，在5?L发酵罐中发酵96h后L?鸟氨酸的积累量达到32.4g/L。在此过程中，高浓度L?精氨酸被转化成L?鸟氨酸，可解除L?精氨酸合成的反馈抑制作用，从而促进L?精氨酸合成量的提高。而L?精氨酸又被转化成L?鸟氨酸，可进一步提高L?鸟氨酸的产量。
【专利说明】
一种双菌混合发酵生产L-鸟氨酸的方法
技术领域
[0001]本发明涉及到含精氨酸酶基因的重组枯草芽孢杆菌和高产L-精氨酸钝齿棒杆菌混合发酵，应用于L-鸟氨酸的生产，属于生物工程领域。
技术背景
[0002]L-精氨酸酶(E.C.3.5.3.1)是尿素循环中的一种关键酶，其催化L-精氨酸形成L-鸟氨酸和尿素，精氨酸酶广泛存在于各种动植物和微生物体内，来源于Bacillus brevis,Bacillus subtil is和Baci I Ius thuringiensis等微生物的精氨酸酶已经获得较好的研究。
[0003]钝齿棒杆菌C.crenatumSYPA5-5是通过筛选及层级诱变获得的一株高产L-精氨酸菌株，其发酵产L-精氨酸的水平达到36.lg/L，通过进一步的代谢工程改造和发酵工艺优化，L-精氨酸的发酵水平可达50.1-56.3g/L。
[0004]鸟氨酸是一种碱性氨基酸，易溶于水和乙醇，微溶于乙醚等有机溶剂。鸟氨酸接受二分子NH4+和一分子C02形成一分子L-精氨酸。L-精氨酸亦可以在精氨酸酶的作用下被水解成鸟氨酸和尿素。
[0005]L-鸟氨酸是一种重要的非蛋白质氨基酸，是人体内尿素循环的重要中间代谢产物，因此其对肝脏的解毒功能具有重要的保障作用。L-鸟氨酸能够刺激体内生长激素的分泌，促进蛋白质的合成以及糖类和脂质的分解代谢作用。L-鸟氨酸和其他氨基酸一起制成的复方氨基酸有很好的保肝护肝以及激发病态下肝脏的活力的作用。联合使用L-鸟氨酸和苯乙酸能有效治疗肝性脑病，特别是对于鸟氨酸循环障碍的患者，L-鸟氨酸能通过促进谷氨酰胺的合成和排泄来稳定的降低患者血氨浓度。鸟氨酸α-酮戊二酸盐是很好的临床营养剂，促进外科创伤病人的恢复，改善慢性营养不良，改善免疫功能。同时鸟氨酸和苹果酸盐和柠檬酸盐合用能够改善食品和饮料的口味，减少苦味。在欧洲、美国以及日本，L-鸟氨酸都是作为膳食药物来销售的。
[0006]工业上L-鸟氨酸的合成包括化学合成法、微生物发酵法和L-精氨酸水解法。化学合成作为早期L-鸟氨酸的生产方法，一般以丙烯醛、氰化氢、氨气、C02为原料合成L-鸟氨酸。但效果并不是很理想，主要表现在于合成的步骤繁琐，产物得率低，而且得到的产物是L-鸟氨酸和D-鸟氨酸的混合物，为后期的分离纯化带来很大的困难。同时化学法合成L-鸟氨酸由于其环境的危害性，越来越不被现代工业所接受。生物合成法相对化学合成法具有生产成本较低，环境污染小等优点而受到重视。微生物发酵生产L-鸟氨酸主要是通过诱变或者基因工程的方法获得L-鸟氨酸高产菌株，以较为便宜的葡萄糖甚至是淀粉等最为初始原料合成L-鸟氨酸。在这方面日本起步较早，上世纪五六十年代就开始鸟氨酸生产的研究，主要以诱变筛选为主。1957年kinoshita等首先报道了利用谷氨酸棒状杆菌的瓜氨酸或精氨酸的突变株发酵生产鸟氨酸。此后，okumurahe Shibuya等人在这方面也做了大量的工作总结出了具有精氨酸缺陷型及精氨酸氧肟酸盐抗性的谷氨酸棒杆菌以及具有精氨酸和瓜氨酸，以及霉酚酸抗性等标记的柠檬酸节杆菌突变株用于工业生产中。国内陈宁、刘树庆等人在1999年开始研究鸟氨酸的生产，并以谷氨酸棒杆菌为出发菌株，通过硫酸二乙酯和紫外线诱变定向选育出一种鸟氨酸生产菌，并通过发酵优化使得鸟氨酸产量达到9.85g/L。近几年，随着代谢工程技术的兴起，通过代谢工程改造的方法，鸟氨酸的发酵生产取得一定的进展，其中，中山大学蒋玲艳等人以谷氨酸棒杆菌为出发菌株，通过表达异源的谷氨酸脱氢酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶，增加代谢流中NADPH的含量，使得L-鸟氨酸产量得到提高，最终到14.8g/L，而后蒋又通过代谢进化和代谢工程的方法，最后得到鸟氨酸的产量为24.lg/L。通过发酵法进行鸟氨酸生产可以利用较简单的碳源，如葡萄糖等，成本非常低廉，适合于工业的发展，但发酵周期一般都相对较长，而且发酵的产量较低对于后期分离需要较高的技术需求。
[0007]L-精氨酸水解法生产L-鸟氨酸包括，碱水解法和酶水解法，特别是酶水解，由于其反应效率高，产物转专一性高而受到越来越多的重视。近几年，国内有人开始尝试以精氨酸为底物进行酶转化法生产L-鸟氨酸。北京化工大学徐焘，通过筛选得到一株精氨酸酶活力较高的苏云金芽孢杆菌，以此细胞作为生物催化剂，以L-精氨酸为底物进行L-鸟氨酸生产，并最终得到43.57g/L L-鸟氨酸。而后张涛等人提取苏云金芽孢杆菌的精氨酸酶，以精氨酸为底物，精氨酸酶纯酶作催化剂，并最终得到72.lg/L的精氨酸酶。宋伟等人构建表达外源精氨酸酶的E.coli BL21，并以重组细胞为催化剂，L-精氨酸为底物，最终得到112.3g/L的L-鸟氨酸
[0008]本发明通过将来源于Bacilluscereus的精氨酸酶基因argl成功在枯草芽孢杆菌中进行高效表达，以重组菌B.subtilis 168/pMA5-argI作为精氨酸酶来源菌株和L-精氨酸高产菌株C.crenatum SYPA 5_5进行双菌混合发酵法以葡萄糖为底物，实现L-鸟氨酸的高效生产。

【发明内容】

[0009]本发明的主要研究内容:本发明以高产L-精氨酸菌株C.crenatum SYPA5-5和高效转化L-精氨酸菌株B.subtilis 168/pMA5-argI为基础，进行双菌混合发酵法生产L-鸟氨酸。对其菌种比例等条件进行优化，在C.crenatum SYPA5-5先单独发酵72h后，以
B.subtilis 168/pMA5-argI 和C.crenatum SYPA5-5 的生物量 1: 500-530 的比例转接
B.subtilis 168/pMA5-argI细胞培养液为最佳。在5-L发酵罐中发酵96h后L-鸟氨酸的产量达到32.4g X L—1，L-精氨酸的含量仅为0.3g X L—1，实现了以葡萄糖为底物混菌发酵法生产L-鸟氨酸。
[0010]本发明采取的技术方案:
[0011 ] B.subtilis 168/pMA5_argI具有高效转化L-精氨酸的能力，且pMA5质粒的Hpa II启动子是一种组成型启动子，不需要诱导剂诱导。因此以重组菌B.subtilis 168/pMA5-argl作为精氨酸酶来源菌株和L-精氨酸高产菌株C.crenatum SYPA 5_5进行混菌发酵，实现以葡萄糖为底物一步法生产L-鸟氨酸。
[0012]1.双菌混合发酵生产L-鸟氨酸的初步研究
[0013]将C.crenatumSYPA 5-5转接LBG活化后，转接到种子培养基中培养，获得二级种子，并以10%的接种量转接5-L发酵罐中，装液量2.5L。在发酵60h时添加200mL OD6qq为5.2至5.5左右的B.subtilis 168/pMA5-argI重组菌培养液(即生物量比例为1:125左右)。发酵96h后测定发酵液中L-精氨酸和L-鸟氨酸的含量。
[0014]结果表明，由于B.subtilis 168/pMA5-argI具有高效转化L-精氨酸的能力，其将L-精氨酸转化成L-鸟氨酸的速率相较于C.crenatum SYPA5-5通过L-鸟氨酸多步合成L-精氨酸的效率高很多，因此发酵液中L-精氨酸的积累量较少，而基本被转化成L-鸟氨酸。
[0015]2.B.subtilis 168/pMA5_argI添加时间对L-鸟氨酸生产的影响
[0016]由于枯草芽孢杆菌的生长速率比钝齿棒杆菌的生长速率快，因此在混菌发酵中
C.crenatum SYPA5-5的生长竞争力较弱。因此B.subtilis 168/pMA5_argI接入发酵液中的时间对L-鸟氨酸的产量具有很大的影响。
[0017]C.crenatum SYPA 5-5转接LBG培养基活化后，转接到250mL摇瓶，其中装液量25mL ο 分别研究在发酵过程中的 Oh、12h、24h、36h、48h、60h、72h、和 84h 中加入 I OOOyL，ODboo为5.2左右的重组菌B.subtilis 168/pMA5_argI (即此时B.subtilis 168/pMA5_argI和
C.crenatum SYPA 5-5的生物量比例为1: 250左右)。研究不同时间段内接入B.subtilis168/pMA5-argI对L-鸟氨酸产量的影响。
[0018]3.双菌株添加比例对L-鸟氨酸生产的影响
[0019]在双菌混合发酵中，若是B.subtilis 168/pMA5-argI的转接量太少，则其不能完全转化发酵液中积累的L-精氨酸，但是若其转接量过大，则其迅速生长，消耗培养基中的葡萄糖和其他营养成分，影响C.crenatum SYPA5-5生产L-鸟氨酸。在250mL摇瓶中，装液量为25mL分别在C.crenatum SYPA 5-5发酵72h后转接 100yL、200yL、500yL、100yL和2000yL的细胞OD6QQ为5.2-5.5左右的B.subtilis 168/pMA5_argI培养液，即此时C.crenatum SYPA5-5和B.subtilis 168/pMA5_argI菌株的生物量比例分别为1:2500、1:1250、1:500、1:250、1:125，研究其对L-鸟氨酸产量的影响。
[0020]4.5-L发酵罐中混菌发酵法生产L-鸟氨酸
[0021 ]根据混菌发酵中B.subtilis 168/pMA5_argI的转接时间和转接量进行优化的结果。在5-L发酵罐中进一步对混菌发酵生产L-鸟氨酸进行研究。在C.crenatum SYPA 5_5发酵7211后，转接5011^(006()()?5.2-5.5)的8.8111^1118 168/pMA5_argI 进行混菌发酵(B.subtilis 168/pMA5-argI 和 SYPA5-5 的生物量比值约为 1:500-530)。发酵9611后测定发酵液中的L-鸟氨酸、L-精氨酸含量，生物量和残糖等。
[0022]用高效液相色谱法测定转化液中L-鸟氨酸和L-精氨酸的含量。
[0023]氨基酸分析色谱条件
[0024](a)色谱柱:安捷伦色谱柱TC-C18 250*4.6*5
[0025](b)柱温:40°C
[0026](C)流动相:A相:称取8.0克结晶乙酸钠于1000毫升烧杯中，加入1000毫升水搅拌至所有结晶水溶解，再加入225微升三乙胺，搅拌并滴加5 %的醋酸，将PH调到7.20 ± 0.05;加入5毫升四氢呋喃，混合后备用。
[0027]B相:称取12.0克结晶乙酸钠于800毫升烧杯中；加入400毫升水搅拌至所有结晶溶解;滴加5 %醋酸将pH调到7.20 ± 0.05;将此溶液加入800毫升乙腈和800毫升甲醇，混合后备用。
[0028](d)检测器:紫外检测器338nm
[0029]本发明的优点和积极效果是:
[0030]pMA5质粒的Hpa I I启动子是一种组成型启动子，不需要诱导剂诱导，B.subtilisl68/pMA5_argI具有高效转化L-精氨酸生产L-鸟氨酸的能力，C.crenatum SYPA5-5具有高效合成L-精氨酸的能力，可实现一步法以葡萄糖为底物发酵生产L-鸟氨酸，在5-L发酵罐中发酵96h后L-鸟氨酸的积累量达到32.4g/L。此法具有底物价格低廉且发酵过程不需诱导等优点。
【具体实施方式】
[0031]实施例1:将C.crenatumSYPA 5-5转接LBG活化后，转接到种子培养基中培养，获得二级种子，并以10 %的接种量转接5-L发酵罐中，装液量2.5L，控制发酵罐温度为30 V，发酵罐搅拌转速600r/min，pH 7.0。在发酵60h时添加200mL OD6qq为5.2至5.5左右的B.subtilis 168/pMA5-argI重组菌培养液(即生物量比例为1:125左右)。发酵9611后测定发酵液中L-精氨酸和L-鸟氨酸的含量。
[0032]种子培养基(g/L):葡萄糖，60;酵母粉，1;(NH4) 2 S04，2; KH2PO4,2.7； K2HP04,0.5；MgSO4.7Η20，0.2。
[0033]发酵培养基(g/L):葡萄糖，120;(NH4)2S04，20，酵母粉，8 ； KH2PO4,27； K2HP04,0.5；MnSO4.H20,0.5；MgSO4.7Η20，0.2。
[0034]由于B.subtilis 168/pMA5-argI生长速率快，且具有高效转化L-鸟氨酸的特性，所以在向C.crenatum SYPA5-5发酵液中转接B.subtilis 168/^]\^5-&找1培养液1211后，发酵液中前期发酵积累的L-精氨酸迅速被转化成L-鸟氨酸。同时，由于此前报道中提到发酵过程中精氨酸合成途径受到发酵液中高浓度的产物L-精氨酸的反馈抑制，在此混菌发酵中，高浓度L-精氨酸被转化成L-鸟氨酸，因此在一定程度上解除L-精氨酸对其合成途径的反馈抑制作用，从而促进L-精氨酸产量的提高。而L-精氨酸又被转化成L-鸟氨酸，进一步提高L-鸟氨酸的产量。
[0035]另一方面，由于L-鸟氨酸同时又是L-精氨酸合成途径中的中间代谢物。在L-精氨酸合成途径中L-鸟氨酸被转化成L-瓜氨酸，最终形成L-精氨酸。本次实验结果表明，由于B.subtilis 168/pMA5-argI具有高效转化L-精氨酸的能力，其将L-精氨酸转化成L-鸟氨酸的速率相较于C.crenatum SYPA5-5通过L-鸟氨酸多步合成L-精氨酸的效率高很多，因此发酵液中L-精氨酸的积累量较少，而基本被转化成L-鸟氨酸。当72h后再转接B.subtilis168/pMA5-argI，发酵液中的L-鸟氨酸的积累量达到最高，为26.8g.L一、
[0036]在5-L发酵罐中进一步对混菌发酵生产L-鸟氨酸进行研究。在C.crenatum SYPA
5-5发酵7211后，转接5011^(006()()?5.2-5.5)的8.8111^丨1丨8 168/pMA5_argI 进行混菌发酵(B.subtilis 168/pMA5-argI 和 SYPA5-5 的生物量比值约为 1:500-530)。发酵9611后测定发酵液中的L-鸟氨酸、L-精氨酸含量，生物量和残糖等。
[0037]结果表明，在发酵的前72h，C.crenatum SYPA 5-5的细胞OD6Qo达到57.6，残糖为66.4g.L—1左右。此时发酵液中共累积到L-精氨酸29.6g.L—1，L_鸟氨酸的含量仅为0.5g.L—1。在此时转接B.subtilis 168/pMA5-argI 12h后，L-精氨酸的含量迅速降到1.2g.L—1，以此同时L-鸟氨酸的含量则达到27.Sg.L—1。发酵液中残糖剩下降到36.2g.L—S细胞OD6(X)则达到63.5，继续发酵12h后(发酵96h)，发酵液中累积L-鸟氨酸32.4g.L—S而L-精氨酸的含量仅有0.3g.L—I混菌的细胞OD6qq也达到69.8，发酵液中葡萄糖基本消耗完。
【主权项】
1.一种以葡萄糖为底物双菌混合发酵生产L-鸟氨酸的方法，其特征在于，在发酵Oh时在发酵培养基中接种C.crenatum SYPA 5_5以葡萄糖为底物发酵合成L-精氨酸，随后在发酵体系中接种重组菌B.subtilis 168/pMA5_argI转化L-精氨酸合成L-鸟氨酸。2.权利要求1所述的重组菌B.subtil is 168/pMA5_argI接种时间优选发酵开始后的.72h.3.权利要求1所述的C.crenatum SYPA5-5和B.subtilis 168/pMA5_argI两种菌株接种比例优选1:500?530。4.权利要求1所需的发酵条件，其特征在于，首先将在种子培养基中培养好的C.crenatum SYPA5-5以10%的转接量转接至5_L发酵罐中，控制发酵罐温度为30°C，发酵罐搅拌转速600r/min,pH 7.0；种子培养基(g/L):葡萄糖，60;酵母粉，10; (NH4)2SO4，2;KH2PO4，.2.7；K2HP04,0.5；MgSO4.7H20,0.2；发酵培养基(g/L):葡萄糖,120； (NH4)2SO4^O,酵母粉，8；KH2PO4,27；K2HP04,0.5；MnSO4.H20,0.5；MgS04.7Η20，0.2。
【文档编号】C12P13/10GK105950697SQ201610574795
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月20日
【发明人】饶志明, 徐美娟, 王梅洲, 杨套伟, 张显
【申请人】江南大学