一株l-鸟氨酸合成菌的构建及其应用方法
【专利摘要】本发明敲除钝齿棒杆菌(Corynebacteriumcrenatum)SYPA5-5中编码鸟氨酸乙酰转移酶(Ornithinecarbamoyltransferase，OTC)的argF基因，对获得的重组菌株进行发酵产L-鸟氨酸的研究，属于生物【技术领域】。首先，构建argF基因内缺失片段(△argF)，连接至pK18mobsacB中获得重组质粒pK18mobsacB△argF，将其电转入SYPA5-5中，经两次同源重组，筛选获得重组菌株SYPA5-5△argF。其次，考察不同营养条件对重组菌株生长及L-鸟氨酸积累的影响，发现添加0.3g/LL-精氨酸可满足SYPA5-5△argF的生长及L-鸟氨酸积累所需，利用糖质原料，发酵96h，L-鸟氨酸产量可达21.5g/L，糖酸转化效率为0.17g(L-ornithine)/g(glucose)。
【专利说明】一株L-鸟氨酸合成菌的构建及其应用方法
【技术领域】
[0001]敲除纯齿棒杆菌iCorynebacteriumcrenatundSWkf^中编码鸟氨酸乙酸转移酶(Ornithine carbamoyl transferase, 0TC)的基因，并对获得的重组菌株进行发酵产L-鸟氨酸的研究，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]L-鸟氨酸(L-ornithine)为非蛋白质氨基酸，是尿素循环的重要中间代谢产物，因具有重要的生理功能而广泛应用于食品、医药及化工领域。微生物发酵法有节能环保、易提取分离等优点，具有重要的工业化应用价值。
[0003]实现微生物发酵法生产氨基酸的关键在于高产菌株的选育。代谢工程作为理性育种的技术手段被广泛应用于工业微生物的改造。目前，该技术已应用于L-鸟氨酸高产菌株的构建。Lee YJ 等构建的大肠杆菌 W3110 ( AargF AargR Apro^ Δ speV, ParaB-ar^-214)在添加谷氨酸的条件下发酵，可积累13.2 mg/g (dry cell weight) L-鸟氨酸；Jiang LY等构建的谷氨酸棒杆菌ATCC13032 ( Δ argV Δ argR ΔproV> Δ spe^)，经生长偶联的菌株驯养后，可积累17.2 g/L L-鸟氨酸。但上述L-鸟氨酸生产菌株仍存在产量不高或携带外源质粒等问题，限制了其工业化应用。
[0004]纯齿棒杆菌SYPA5-5是本研究室经过多级诱变筛选获得的一株L-精氨酸高产菌株，利用葡萄糖为碳源，摇瓶发酵96 h可积累约30 g/L L-精氨酸。L-精氨酸的生物合成是以L-谷氨酸为前体，先通过5步酶促反应生成L-鸟氨酸；再经鸟氨酸氨甲酰转移酶( Ornithine carbamoyltransferase,0TC)将L-鸟氨酸转化为L-瓜氨酸；最后，在精胺琥拍酸合成酶(Argininosuccinate synthase, ASS)和精胺琥拍酸裂解酶(Argininosuccinase,ASL)催化下合成L-精氨酸。前期研究表明，SYPA5-5发酵生产L-精氨酸的过程中，中间代谢物L-鸟氨酸的积累量较低。本研究以SYPA5-5为出发菌株，敲除其编码鸟氨酸氨甲酰转移酶的基因阻断L-鸟氨酸进一步合成L-精氨酸的途径，构建了能够积累L-鸟氨酸的重组菌株SYPA5-5 Λ ar^F，并研究了其发酵性能，为实现采用糖质原料直接发酵生产上述氨基酸奠定了基础。
【发明内容】
[0005]本发明提供合成L-鸟氨酸的钝齿棒杆菌iCorynebacterium crena turn)SYPA5-5 的构建及发酵生产L-鸟氨酸的方法。该菌株是利用SYPA5-5为出发菌株，以自杀质粒pK18mohsacB对其基因进行敲除后获得,在添加300 mM L-精氨酸条件下，利用糖质原料发酵96 h，积累21.5 g/L L-鸟氨酸，该菌株已经保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存号为CGMCCN0.8637，保存日期为2013年12月25日。本发明提供的方法属于基金项目:国家863资助项目(N0.2012AA022102)的研究内容。具体发明方案如下:
1.重组菌株SYPA5-5 Δ argV的构建以SYPA5-5基因组DNA为模板，分别以F1/F2、F3/F4为引物，扩增argF上、下游片段，通过crossover PCR扩增获得基因内缺失片段(Λ ar^F)。将获得的Λ 连入pK18mohsacB质粒得到重组质粒pK18mohsacB arg?。将重组质粒电转化入SYPA5-5感受态细胞中，经两次同源重组，对获取的转化子，提取基因组，进行PCR扩增并送至上海生工测序。
[0006]引物序列如下:
【权利要求】
1.构建一株利用糖质原料发酵大量积累L-鸟氨酸的菌株的方法，其特征为:出发菌株分类命名为纯齿棒杆菌iCorynebacterium crenaturn) SYPA5-5 I^arg?,已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株保存号为CGMCC N0.8637，保存日期为2013年12月25日。
2.权利要求1中所述的方法，其特征为:利用高产L-精氨酸的钝齿棒杆菌{Corynebac teri um crena turn) SYPA5-5为出发菌株，以pK18mohsacB质粒对其编码鸟氨酸乙酰转移酶(Ornithine carbamoyl transferase, OTC)的a/yF基因进行敲除,筛选获得的重组菌株可积累L-鸟氨酸。
3.利用糖质原料发酵大量积累L-鸟氨酸的方法，其特征为: (1)种子活化:将斜面保存的菌种划线于肉汤斜面中，30°C静置培养24h ;肉汤培养基组分(g/L):葡萄糖20;蛋白胨10;牛肉膏10 ;酵母粉5 ;NaCl 5 ;琼脂粉20 ;pH 7.0~7.2 ;121 V高压蒸汽灭菌20 min ； (2)摇瓶种子:将活化后的种子，挑取一环接种于摇瓶种子培养基中，30°C120 rpm往复式摇床培养12-16 h，至OD562nm约为15 ;种子培养基组分(g/L):葡萄糖30 ;玉米浆20 ；(NH4)2SO4 20 ；KH2PO41 ；MgS04.7H20 0.5 ;尿素 1.5 ；ρΗ 7.0 ~7.2 ；121 °C 高压蒸汽灭菌 20m in ； (3)摇瓶发酵:将液体种子按5%的接种量接种至发酵培养基，30°C120 rpm往复式摇床培养96 h,发酵至24 h补加50 g/L葡萄糖；摇瓶发酵培养基组分(g/L):葡萄糖(分消)100 ;酵母粉 10 ； (NH4)2SO4 50 ；KH2PO41.5 ；MgS04.7H20 0.5 ；FeS04.7H20 0.02 ；MnSO4.H2O0.02;生物素 8 XlO-5 ;L-组氨酸 5Χ10-4 ;CaC03 30 ；pH 7.0 ~7.2; 115 °C高压蒸汽灭菌 7min。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征为:添加适量L-精氨酸以有利于菌体的生长及L-鸟氨酸的积累。
【文档编号】C12N1/21GK104031933SQ201410191782
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年5月8日 优先权日:2014年5月8日
【发明者】许正宏, 窦文芳, 史劲松, 赵芹芹, 罗玉常, 张晓梅, 耿燕, 刘雪 申请人:江南大学