通过发酵过量生产γ-谷氨酰半胱氨酸和该二肽的衍生物的微生物和方法

通过发酵过量生产γ-谷氨酰半胱氨酸和该二肽的衍生物的微生物和方法
【专利摘要】本发明涉及通过发酵过量生产γ-谷氨酰半胱氨酸和该二肽的衍生物的微生物和方法。具体地，本发明涉及能够过量生产γ-谷氨酰半胱氨酸及其衍生物双-γ-谷氨酰胱氨酸和γ-谷氨酰胱氨酸的原核微生物菌株，其可以由母株制备，其中，相对于所述母株，所述菌株具有降低的细胞谷胱甘肽合成酶活性，并且具有细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性，相比于具有相似降低的细胞谷胱甘肽合成酶活性的菌株，所述菌株具有的细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性更大地提高。
【专利说明】通过发酵过量生产Y-谷氨酰半胱氨酸和该二肽的衍生物的微生物和方法

【技术领域】
[0001]本发明涉及适于过量生产Y-谷氨酰半胱氨酸UGC)和该二肽的衍生物Y-谷氨酰胱氨酸和双-Y -谷氨酰胱氨酸的原核微生物菌株，以及用于制备这些化合物的方法。

【背景技术】
[0002]Y -谷氨酰半胱氨酸是通过连接氨基酸L-半胱氨酸和L-谷氨酸而形成于原核和真核生物细胞中的二肽。
[0003]双-Y-谷氨酰胱氨酸是通过两分子的Y-谷氨酰半胱氨酸的氧化形成的二硫化物。该反应是可逆的，这意味着，通过还原(例如酶法或化学法)，双-Y-谷氨酰胱氨酸可以转化回Y-谷氨酰半胱氨酸。
[0004]Y-谷氨酰胱氨酸是通过一分子的Y-谷氨酸半胱氨酸和一分子的L-半胱氨酸的氧化形成的二硫化物。该反应是可逆的，这意味着，通过还原(例如化学法)，Y-谷氨酰胱氨酸可以转化回Y -谷氨酰半胱氨酸和L-半胱氨酸。
[0005]巯基化合物Y-谷氨酰半胱氨酸在很多生物中作为谷胱甘肽的前体。谷胱甘肽生物合成的第一步是通过ATP-依赖性酶Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶连接L-半胱氨酸的α-氨基和L-谷氨酸的Y-羧基之间的Y-肽键。此外，由于酶Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶被谷胱甘肽抑制，该反应是谷胱甘肽生物合成的限速步骤。谷胱甘肽生物合成的第二步是L-甘氨酸和Y-谷氨酰半胱氨酸反应以产生谷胱甘肽，其中L-甘氨酸通过α-肽键和Y-谷氨酰半胱氨酸的半胱氨酰官能团连接。该ATP-依赖性的反应也同样由酶谷胱甘肽合成酶催化。
[0006]由于其抗氧化的特性，谷胱甘肽在细胞中起关键作用，并且作为还原剂、辅底物、辅因子参与很多细胞过程。然而，也已知存在谷胱甘肽缺陷的生物，其中所述谷胱甘肽前体Y-谷氨酰半胱氨酸发挥谷胱甘肽的生物学作用。已知的实例是诸如盐生盐杆菌(Halobacterium halobium)(Sundquist and Fahey, 1989, J.B1l.Chem.264:719-725)的典型嗜盐古细菌。
[0007]此外，在文献中描述了各种菌种的不同谷胱甘肽缺陷微生物菌株，如酿酒酵母(Grant et al., 1997, Mol.B1l.Cell.8:1699-1707) > 集胞藻(Synechocystis sp.)(Cameron and Pakrasi, 2011, Plant Signal.Behav.6:89-92)或大肠杆菌(Fuchs andWarner, 1975，J.Bacter1l.124:140-148)。这些菌株在相应的编码谷胱甘肽合成酶的基因中具有突变或缺失(例如，大肠杆菌和集胞藻的gshB或者啤酒酵母的gsh2)。通过谷胱甘肽合成酶活性的改变或缺失，这些菌株不再能或仅能在一定程度上合成谷胱甘肽。因此细胞Y-谷氨酰半胱氨酸水平提高。由于增强的形成和提高的浓度的现存Y-谷氨酰半胱氨酸承担了很多谷胱甘肽特异性功能，这些突变菌株是有生存能力的。然而，相比对应的野生型菌株，这些菌株的特征在于对活性氧和重金属离子的增加的敏感度，使得其生长部分被损害(Cameron and Pakrasi, 201 !Plant Signal.Behav.6:89-92 ；Helbig et al., 2008, J.Bacter1l.190:5439-5454)。
[0008]活性氧、重金属离子和外源化合物(xenob1tic)的解毒频繁发生在许多生物中，也在人类中，尤其通过谷胱甘肽的方式(Grant et al.，Mol.B1l.Cell.8:1699-1707)。此外，较低的谷胱甘肽水平通常是诸如自闭症、帕金森病、囊性纤维病、HIV、癌症或精神分裂症的各种疾病的症状和/或基础(Wu et al.，2004，J.Nutr.134:489-492)。因此，对维持恒定的细胞内谷胱甘肽水平甚至提高其水平存在相当大的关注。Y-谷氨酰半胱氨酸已被成功测试作为用于提高细胞谷胱甘肽水平的有前景的物质(Anderson and Meister, 1983，P.N.A.S.80:707-711)。
[0009]W02006102722描述了用于制备Y _谷氨酰半胱氨酸的酶促法，这是基于半胱氨酸衍生物和Y-谷氨酰半胱氨酸供体的反应，通过固定的Y-谷氨酰半胱氨酸转肽酶。
[0010]微生物Y-谷氨酰半胱氨酸生产者主要是诸如酿酒酵母或产朊假丝酵母的酵母菌目中的真菌菌株，但这主要用于谷胱甘肽的生产。这类菌株在如W02010116833A1、US7371557B2、和 US2005074835A1 中公开。除此之外，在 EP2251417A1、US7569360B2、US2004214308AUUS2003124684AUUS7410790B2 和 EP1489173B1 中描述了具有用于 Y-谷氨酰半胱氨酸生产的异常高能力的相同目中的其他真菌菌株。作为通常的特征，这些真菌菌株具有降低的谷胱甘肽合成酶活性，此外还有各种菌株特异性的特征，如浅蓝菌素或亚硝基胍耐受性或泛酸营养缺陷。
[0011]此外，US2005042328A1描述了在具有降低的谷胱甘肽合成酶活性和提高的gshl表达(gshl编码Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶)的产朊假丝酵母菌株中Y-谷氨酰半胱氨酸的细胞内富集。
[0012]真菌Y-GC的生产系统的缺点是相对较低的Y-谷氨酰半胱氨酸的产量以及Y-谷氨酰半胱氨酸在细胞内累积，这使得作为Y-谷氨酰半胱氨酸可能生产(workup)的真菌细胞的干扰成为必要。
[0013]在US20100203592A1中描述了作为Y -谷氨酰半胱氨酸的原核生产者的各种大肠杆菌菌株，其全部具有提高的gshA表达。此外，相比对应的母株，这些菌株具有正常或提高的谷胱甘肽合成酶活性。相比真菌系统，分泌至培养基的Y-谷氨酰半胱氨酸可以和这些菌株在一起。这些菌株的最大产量是262mg/l，对于建立经济的方法而言，这是不够的。
[0014]能够过量生产有前景的生物活性化合物Y-谷氨酰半胱氨酸及其衍生物双Y-谷氨酰胱氨酸和Y-谷氨酰胱氨酸的微生物菌株，及此外允许这些化合物以g/ι的规模分泌至培养基的微生物菌株还不存在。


【发明内容】

[0015]因此，本发明的目的是提供能过量生产Y -谷氨酰半胱氨酸及其衍生物双-Y -谷氨酰胱氨酸和Y-谷氨酰胱氨酸的微生物菌株，此外，其使这些化合物能够在培养基中细胞外累积。
[0016]通过原核微生物菌株达到了该目的，该原核微生物可以由母株制备，并且与母株相比具有降低的细胞谷胱甘肽合成酶活性，并具有细胞Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性，相对于具有相似降低的谷胱甘肽合成酶活性的菌株，该活性极大提高。
[0017]根据本发明菌株中的谷胱甘肽合成酶活性优选降低至所述活性最高为相应野生型菌株的谷胱甘肽合成酶活性的50%。
[0018]在其谷胱甘肽合成酶活性改变之前，优选地是具有野生型的谷胱甘肽合成酶的最高25%活性的原核微生物菌株。菌株的降低的谷胱甘肽合成酶活性特别优选地理解为在此菌株中不存在谷胱甘肽合成酶活性。
[0019]根据本发明菌株中的Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性优选地高于具有相似降低的谷胱甘肽合成酶活性的菌株大约至少5倍。
[0020]特别优选的是根据本发明的微生物菌株，其中谷胱甘肽合成酶活性和Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性二者如上所述已改变。
[0021]DNA 的同一度由网站 http: //blast, ncb1.nlm.nih.gov/ 上的基于 Blastn 算法的“核苷酸比对(nucleotide blast)”程序确定。使用默认参数作为算法参数用于两个或更多核苷酸序列的比对(阵列，alignment)。默认常用参数是:最大靶序列=100 ;短查询串(short queries)= “ 自动调整参数用于短输入序列(Automatically adjust parametersfor short input sequences) ”;期望阈值=10 ;字长(word size) = 28 ;用于短输入序列的自调整参数(Automatically adjust parameters for short input sequences) =0。相应默认打分参数是:匹配/不匹配分数=I至2 ;空位罚分(GAp Costs)=线性。
[0022]网址 http: //blast, ncb1.nlm.nih.gov/ 上的“蛋白质比对(protein blast)” 程序用于蛋白序列的对比。该程序是基于blastp算法。用于两个或更多蛋白序列的匹配，默认参数用作算法参数。默认常用参数是:最大靶序列=100;短串查询=“用于短输入序列的自动调节参数”；期望阈值=10 ;字长=3 ;用于短输入序列的自调整参数=O。默认打分参数是:模板=BL0SUM62 ;空位罚分=存在:11扩展:1 ;组成调节(Composit1naladjustments)=常规组成打分模板调节(Condit1nal composit1nal score templateadjustment)。
[0023]具有Y-谷氨酰半胱氨酸的生物合成途径的全部原核微生物菌株可以通过发酵培养，原则上适于作为母株以产生根据本发明的微生物菌株。这类微生物可以属于细菌(前述真细菌)或古生细菌(前述古细菌)。
[0024]这些生物优选地是细菌的系统发生类群的代表。特别优选地是肠杆菌科的生物，具体地是大肠杆菌(Escherichia coli)和菠萝泛菌(Pantoea ananatis)。
[0025]如实施例9所述，Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶活性是在Y -谷氨酰半胱氨酸随时间形成的基础上测定的。
[0026]谷胱甘肽合成酶活性是利用丙酮酸激酶偶联酶检测试验、通过ADP的形成速率确定的。其中L-甘氨酸和L-Y-谷氨酰-L-α-氨基丁酸作为底物反应(Kim et al.，2003，J.B1chem.Mol.B1l.36:326-331)。
[0027]用于产生根据本发明的微生物的适宜母株优选地是原核微生物菌株，其具有用于
Y -谷氨酰半胱氨酸的生物合成途径并且，此外对比相应的母株，其具有提高的L-半胱氨酸生物合成能力。用于L-半胱氨酸生物合成的提高的能力利于Y -谷氨酰半胱氨酸的合成，由于为了 Y-谷氨酰半胱氨酸的高产量，不应限制提供足量的作为Y-谷氨酰半胱氨酸前体的L-半胱氨酸。对比相应的野生型、母株或未改变的菌株，“提高的L-半胱氨酸合成能力”根据本发明理解为微生物菌株产生更多L-半胱氨酸或其衍生物L-胱氨酸和噻唑烷的能力。这通常表现为培养基中L-半胱氨酸、L-胱氨酸和/或噻唑烷的富集。因此目前为本领域技术人员所知，提高的L-半胱氨酸生物合成能力是，如果在相关微生物菌株的发酵期间或结束时，在培养基中可检测到至少0.5g/l的“总半胱氨酸”(L-半胱氨酸+L-胱氨酸+噻唑烷)。
[0028]公开了用于产生根据本发明的具有提高的L-半胱氨酸生物合成能力的微生物的可能母株，如在 US20040038352A1、US20090053778、EP1528108A1、EP2345667A2 或EP2138585 中。
[0029]此外，由现有技术可知的基因或这些基因的变体(等位基因)致使其用于过量生产氨基酸L-半胱氨酸和/或L-丝氨酸或O-乙酰丝氨酸的前体:
[0030]-serA 等位基因，如在 EP0620853B1、EP1496111B1 和 EP0931833A2 中描述的:
[0031 ] 这些serA等位基因编码3_磷酸甘油酸脱氢酶，其受到由L-丝氨酸降低的反馈抑制的影响。以此方式，3-羟基丙酮酸的形成与细胞的丝氨酸水平很大程度上被解偶联，这允许更好的朝向L-半胱氨酸的物质流。
[0032]-cysE 等位基因，如 W09715673 ;Nakamori S.et al., 1998, Env.Microb1l64:1607-1611 或 Takagi H.et al., FEBS Lett.452: 323-327 中描述的:
[0033]这些cysE等位基因编码受到由L-半胱氨酸降低的反馈抑制的影响的丝氨酸-O-乙酰基转移酶。以这种方式，O-乙酰基丝氨酸和L-半胱氨酸的合成与细胞中的L-半胱氨酸水平很大程度上解偶联。
[0034]-外排基因(effluxgene)，如在 EP885962A1 中描述的:
[0035]在EP885962A1中所述的orf306在一段时间内被多次引用。所述基因的DNA序列被称为orf306或orf299、ydeD和eamA，目前保藏在登录号NC_004431或NC_007779下。orf306 (orf299、eamA或ydeD)编码外排系统,适于消除抗生素和其他有毒物质并引起L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙酰丝氨酸和/或噻唑烷衍生物的过量生产(Ohtsu 1.etal.，2010，J.B1l.Chem.285 ； 17479 - 17489 ；EP885962 和 EP1233067B1)。
[0036]-cysB，如在 DE19949579C1 中描述的:
[0037]cysB基因编码半胱氨酸代谢的中央调节子，并其决定性作用，除其它之外，在提供用于半胱氨酸生物合成的硫化物中。
[0038]根据本发明的微生物菌株也优选地表达一种或多种上述基因或等位基因。特别优选地是利用上述cysE或serA和orf306的等位基因中的一种。在这种情况下，cysE或serA等位基因以及orf306基因可以在根据本发明的微生物菌株中单独或组合表达。根据本发明的微生物菌株特别优选具有遗传改变，其作为本发明存在于实施例中，具体地，作为本发明，表征于表4中。
[0039]本发明的微生物菌株可以利用标准的分子生物学技术产生。
[0040]Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GshA)细胞活性可以提高，如，通过提高gshA基因或gshA同源基因的拷贝数或利用致使gshA基因或gshA同源基因表达量提高的合适启动子。
[0041]大肠杆菌的gshA基因编码Y -谷氨酰半胱氨酸合成蛋白(GshA)酶。gshA基因特征在于序列SEQ ID N0.1。GshA基因产物(GshA)特征在于SEQ ID N0.2。在本发明的上下文中，gshA同源基因相比SEQ ID N0.1，具有大于30%的序列同一性。gshA同源基因相比SEQ ID N0.1，特别优选地具有大于70%的序列同一性。
[0042]GshA同源基因是与序列SEQ ID N0.2具有序列同一性大于30%的蛋白质。GshA同源基因特别优选地与SEQ ID N0.2具有序列同一性大于70%。
[0043]在微生物中gshA基因或gshA同源基因拷贝数的提高可以利用本领域技术人员所知的方法进行。因此gshA或gshA同源基因，如可以克隆至具有多个拷贝数每细胞的质粒载体中(例如，大肠杆菌的 pBR322、pBR 衍生物、pBluescript、pUC18、pUC19、pACYC184 和PACYC184衍生物)，并可以引入微生物。可替代地，gshA基因或gshA同源基因可以重复地整合入微生物菌株的染色体。利用温和噬菌体、整合型质粒或通过同源重组的整合的已知系统可以用作整合方法(Hamilton et al., 1989, J.Bacter1l.171:4617-4622 ；Datsenkoand Wanner, 2000, P.N.A.S.97:6640-6645)。
[0044]优选地是在启动子的控制下通过将gshA或gshA同源基因克隆至质粒载体，提高拷贝数。特别优选地是通过将gshA或gshA同源基因克隆至诸如pACYC184-LH(根据布达佩斯条约，于1995年8月18日保藏在德国微生物保藏中心，马斯徹罗德道Ib D-38124不伦瑞克，编号DSM10172)的pACYC衍生物中，提高大肠杆菌中的拷贝数。
[0045]提高拷贝数理解为优选地提高约10倍。
[0046]如利用覆盖全部基因的特定引物，通过聚合酶链反应(PCR)的特异性扩增，将gshA基因或gshA同源基因克隆至质粒载体，并且随后与质粒DNA片段进行连接。
[0047]基因的天然启动子和/或操纵子区可作为质粒编码基因表达的控制区。
[0048]gshA或gshA同源基因的表达率也可通过其他启动子来提高。相关的启动子系统如在大肠杆菌中的gapA基因的组成性GAPDH启动子或为本领域技术人员所知的可诱导 lac、tac、trc 、lambda、ara 或 tet 启动子(Markides S.C., 1996, Microb1l.Rev.60:512-538)。这类构建体以质粒或染色体自身已知的方式构建。
[0049]进一步，通过翻译起始信号可获得提高的细胞GshA活性，如核糖体结合位点或各自构建体上的优化序列中存在的Shine Dalgarno序列，或根据“密码子使用”将稀有密码子置换为常用密码子。
[0050]细胞GshA活性的提高也可以在于将突变(替代、插入、或核糖核苷酸的缺失)引入gshA基因或gshA同源基因的读码框，这使得GshA或GshA同源基因的特异性活性提高。将gshA基因的非常见起始密码子TTG置换为例如常见启动密码子ATG，不仅致使gshA表达量的提高，而且致使大肠杆菌中GshA的细胞活性提高(Kwak et al.，1998，J.B1chem.Mol.B1l.31:254-257)。
[0051]gshA的定点突变，在蛋白水平上包括494位的丙氨酸置换为缬氨酸或亮氨酸(A494V或A494L)或在495位置换为苏氨酸(S495T)，也致使在大肠杆菌中细胞GshA活性的提高(Kwak et al., 1998, J.B1chem.Mol.B1l.31:254-257)。这类等位基因优选地是根据本发明的gshA同源基因。
[0052]由现有技术可知用于在微生物菌株中降低谷胱甘肽合成酶活性的方法，细胞谷胱甘肽合成酶活性可以降低，例如，在于将突变(替换、插入或缺失单个或多个核糖核苷酸)引入gshB基因或gshB同源基因的读码框，其可致使GshB或GshB同源基因特异性活性降低。用于产生该gshB等位基因的方法为本领域技术人员所知。如可以利用gshB野生型基因的DNA作为起始材料，通过非特异性或定点突变，制备gshB基因的等位基因。如在Kato等(1988, J.B1l.Chem.263:11646-11651)中描述了这类等位基因的实例，相比野生型酶而言，该等位基因编码具有降低的GshB活性的GshB变体。
[0053]在gshB基因或gshB基因的启动子区的非特异性突变，例如可以通过化学试剂，如，除了其它，亚硝基胍、乙基甲磺酸和/或通过物理方法和/或通过在特定条件下的PCR反应产生。已知用于在DNA片段的特定位点引入突变的方法。例如，DNA片段中一个或多个碱基，其包括gshB基因及其启动子区，可以利用合适的寡核苷作为引物，通过PCR进行置换。此外，可以通过基因合成，制备整个gshB基因或新的gshB等位基因。
[0054]gshB等位基因通常最初在体外产生，并且随后插进入细胞的染色体，由此最初存在的gshB野生型基因被替换并且最终产生gshB变异菌株。gshB等位基因而不是gshB野生型基因通过已知的标准方法能插入宿主细胞的染色体中。这可通过在Link等的方法(1997，J.Bacter1l.179:6228-37)经同源重组机制用于将染色体突变引入至基因。如通过根据 Datsenko 和 Wanner (2000, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.97:6640-5)描述的方法的Λ-Red重组酶系统，整个gshB基因或其部分的染色体的缺失是可以的。通过Pl噬菌体或结合的方法，gshB等位基因也可从具有gsh突变的菌株中转移至gshB野生型菌株，其中染色体的gshB野生型基因被相应的gshB等位基因替换。
[0055]此外，细胞的谷胱甘肽合成酶活性也可降低，因为需要至少一个用于表达调控的元件(element)(如启动子、增强子、核糖体结合位点)通过单个或多个核苷的替换、插入或缺失而突变。
[0056]大肠杆菌的gshB基因编码谷胱甘肽合成酶。gshB基因的特征在于SEQ ID N0.3。GshB基因产物(GshB)特征在于SEQ ID N0.4。
[0057]在本发明的上下文中，gshB同源基因与SEQ ID N0.3具有的序列同一性大于30%。特别优选地是，与SEQ ID N0.3具有的序列同一性大于70%。GshB同源基因是与SEQID N0.4具有序列同一性大于30%的蛋白质。特别优选地GshB同源基因与SEQ ID N0.4具有的序列同一性大于70%。
[0058]本发明进一步涉及用于过量生产Y-谷氨酰半胱氨酸(YGC)和该二肽的衍生物
Y-谷氨酰半胱氨酸和双-Y -谷氨酰胱氨酸的方法，其中根据本发明的微生物菌株在发酵培养基中培养，从培养基中除去细胞并且从培养基中纯化得到所需产物。
[0059]根据本发明方法所需的微生物在生物反应器中(发酵罐)通过本领域技术人员已知的常规发酵方法，基于工业规模培养(发酵)。
[0060]发酵优选在常规生物反应器中进行，如搅拌槽、泡沫柱式发酵罐或者气升式发酵罐。特别优选的是搅拌釜发酵罐。本发明中的工业规模可以理解为至少2升的发酵罐尺寸。优选的是具有体积大于5升的发酵罐，特别优选地是具有体积大于50升的发酵罐。
[0061]用于生产Y-谷氨酰半胱氨酸的细胞在有氧的生长条件下培养，其中发酵过程中氧含量调节至最高50%的饱和度。培养基中氧饱和度通过气体供应和搅拌速度自动调节。
[0062]优选的是糖、糖醇、有机酸或含糖植物水解产物作为碳源。根据本发明方法，特别优选的是利用葡萄糖、果糖、乳糖、丙三醇或包含两种或更多种这类化合物的混合物作为碳源。
[0063]碳源优选地加入至培养基，使得在发酵罐中碳源的含量在生产期不超过10g/l。优选的最大浓度是2g/l。
[0064] 根据本发明的方法，优选地利用氨、铵或蛋白水解物作为氮源。当利用氨作为用于稳定PH值的修正方法时，通常在发酵期间加入该氮源。
[0065]可以加入磷、氯、钠、镁、氮、钾、钙、铁元素的盐以及痕量即μ M浓度的元素钥、硼、钴、镁、锌和镍元素的盐作为进一步的培养基增补物。
[0066]此外，有机酸(如醋酸、柠檬酸)、氨基酸(例如L-谷氨酸、L-半胱氨酸)和维生素(例如，Β1、Β6)可以加入培养基。
[0067]L-谷氨酸在这种情况下，可以直接用作酸或以其盐的形式，如谷氨酸钾或谷氨酸钠，单独或作为混合物使用。优选的是利用谷氨酸钾。
[0068]使用的复合营养源可以是酵母提取物、玉米浸液、大豆粉或麦芽提取物。
[0069]嗜温微生物如大肠杆菌的培养温度优选地是15至45°C，特别优选地是30至37。。。
[0070]本发明的发酵方法的生产期始于Y-谷氨酰半胱氨酸、双-Y-谷氨酰胱氨酸或Y-谷氨酰胱氨酸可以首先在培养液(培养肉汤，culture broth)中检测到的时间点。这个阶段通常始于经预培养的生产发酵罐接种后的约8-12小时。
[0071]根据在分批或补料分批过程中描述的方法，微生物在培养时间至少48小时后，高效地分泌Y-谷氨酰半胱氨酸和化合物Y-谷氨酰胱氨酸及衍生于其的化合物双-Y-谷氨酰胱氨酸至发酵培养基中。
[0072]在本发明的上下文中，Y-谷氨酰胱氨酸的过量生产优选地理解为，相对于相应的野生型、母株或未改变的菌株，微生物菌株产生更多Y-谷氨酰半胱氨酸或其衍生物Y-谷氨酰胱氨酸和双-Y-谷氨酰胱氨酸的能力。这通常表现为Y-谷氨酰半胱氨酸、Y-谷氨酰胱氨酸和/或双-Y-谷氨酰胱氨酸在培养基中的富集。存在Y-谷氨酰半胱氨酸的过量生产，因此，如果在相关微生物菌株中的发酵结束时，可在培养液中检测到最少0.2g/l的“总Y -谷氨酰半胱氨酸”(Y -谷氨酰半胱氨酸+ Y-谷氨酰胱氨酸+双-Y -谷氨酰胱氨酸)产量。培养基中“总Y-谷氨酰半胱氨酸”的产量优选地在3至23g/l的范围内，正如在表3和表4中列出的本发明的微生物可获得的。关于建立经济的方法特别优选地是，在培养基中范围在10至23g/l的“总Y-谷氨酰半胱氨酸”产量。

【专利附图】

【附图说明】
[0073]图1示出了质粒pACYC184-LH的限制和功能图谱。
[0074]图2示出了 pgshAp-gshA?的限制和功能图谱。
[0075]图3示出了 ptufB的限制和功能图谱。
[0076]图4示出了 ptufBp_gshAATG的限制和功能图谱。
[0077]图5示出了 pgshAATG_serA2040的限制和功能图谱。
[0078]图6示出了 ppgshAATG_cysE14的限制和功能图谱。
[0079]图7示出了 pgshAATG-cysE14-serA2040的限制和功能图谱。
[0080]图8示出了 pgshAATG-serA2040_orf306的限制和功能图谱。
[0081]图9示出了 pgshAATG-cysE14_orf306的限制和功能图谱。
[0082]图10 不出了 pgshAATG-cysE14-serA2040_orf306 的限制和功能图谱。
[0083]图11示出了 A)未处理的(氧化的)样品和B)使用DTT处理的(还原的)样品的HPLC色谱图。

【具体实施方式】
[0084]下列实施例用于进一步说明本发明:
[0085]实施例1:在大肠杆菌菌株W3110(ATCC27325)中基因gshB缺失(谷胱甘肽合成酶失活)。
[0086]根据由 Datsenko 和 Wanner((Datsenko and Wanner, 2000,P.N.A.S.97:6640-6645)研发的“ Λ -Red方法”，将大肠杆菌中编码酶谷胱甘肽合成酶(GshB)的基因gshB在大肠杆菌菌株W3110(ATCC27325)中删除。编码卡那霉素耐性标记(kanR)的 DNA 片段利用引物 gshB-del-for (SEQ ID N0.5)和 gshB-del-rev (SEQ ID N0.6)扩增。
[0087]引物gshB-del-for编码由30个核苷组成的序列(其与gshB基因的5’-端同源)和包括20个核苷的序列(与在质粒pKD13(大肠杆菌遗传库存中心(Coli Genetic StockCenter, CGSC)编号7633)上编码一个或两个FRT位点(FLP的识别靶标)的DNA序列互补)。引物gshB-del-rev编码由30个核苷组成的序列(与gshB基因的3’-端同源)和包括20个核苷的序列(与在质粒pKD13上编码第二 FRT位点的DNA序列互补)。
[0088]如US5972663A的实施例2描述的，扩增的PCR产物通过电穿孔到大肠杆菌菌株W3110(ATCC27325)的方法转化。在包含50mg/l的卡那霉素的LB琼脂板上挑选转化的gshB-缺陷细胞。标记基因(卡那霉素耐性，kanR)从FLP重组酶上移除，FLP重组酶在质粒pCP20(CGSC编号7629)上编码。由于温度敏感性“复制起点”(ori)，质粒pCP20可在通过在43°C培养的大肠杆菌的转化之后再次移除。以这种方式产生的大肠杆菌gshB缺失菌株称为 W3110 Λ gshB。
[0089]实施例2:扩增具有其自身启动子的gshA基因
[0090]已知在大肠杆菌中的gshA基因的启动子序列(Watanabe et al., 1986, NucleicAcids Res.14:4393-4400)。编码大肠杆菌的gshA基因和gshA启动子(gshAp)的DNA片段通过PCR扩增。编码gshA基因的启动子序列的DNA片段利用引物gshAp-gshA-for (SEQID N0.7)和 gshAp-gshA-rev (SEQ ID N0.8)扩增。大肠杆菌菌株 W3110 (ATCC27325)的染色体DNA作为模板用于PCR反应。
[0091]大约1.9kb大小的PCR片段通过琼脂糖凝胶电泳纯化并按照厂商的说明书，利用“QIA 快速凝胶提取试剂盒(QIAquick Gel Extract1n Kit) ” (Qiagen GmbH, Hi I den, D)从琼脂糖凝胶分离。纯化的PCR片段利用限制性酶XbaI消化并在_20°C下存储。
[0092]实施例3:gshA基因的扩增和突变
[0093]A、gshA基因的扩增
[0094]通过PCR扩增大肠杆菌的gshA基因。大肠杆菌菌株W3110(ATCC27325)的染色体DNA作为模板用于PCR反应。Taq聚合酶(Qiagen GmbH)用于扩增，其在PCR产物各自的3’ -端连接另外的腺嘌呤。在gshA扩增期间，非常见起始密码子TTG通过利用合适的引物，被起始密码子 ATG 替换。寡核苷 gshA-0E-for (SEQ ID N0.9)和 gshA-OE-rev (SEQ IDN0.10)作为特异性引物。
[0095]产生的1.6kb大小的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳纯化并利用“QIA快速凝胶提取试剂盒”(Qiagen GmbH)从琼脂糖凝胶分离。扩增和纯化的PCR产物和载体pCR2.1-T0P0(Life Technologies,Life Technologies GmbH,Darmstadt,D)的连接根据厂商的说明书(Life Technologies GmbH),利用 “TΟΡΟ? TA Cloning? Kit with PCR?!
2.1 TOPO?”通过“TA克隆”进行。
[0096]连接混合物转化进入“DH5 a ?-TlR大肠杆菌细胞”(Life Technologies)，在这些细胞中增殖并且，随后分离质粒，质粒的序列通过测序确定。产生的具有期望序列的构建体称为 pCR2.1-gshA。
[0097]B、gshA基因的突变发生
[0098]对于gshA的再克隆(recloning),在gshA基因中的两个干扰限制位点EcoRI和BglII最初通过定向突变的方法移除。诱变反应根据厂商的说明书，利用“GeneTailor?定点诱变系统”(Life Technologies GmbH)进行。对第一种突变，质粒pCR2.Ι-gshA作为模板。诱变引物 gshA-EcoRImut-for (SEQ ID N0.11)和 gshA-EcoRImut-rev (SEQ ID N0.12)用于移除在gshA基因中的EcoRI酶切位点。在EcoRI酶切位点上进行的gshA基因的诱变之后，诱变反应的部分再次转化到来自Life Technologies的“DH5 a ?_T1R大肠杆菌细胞”中并在这些细胞中增殖。制备质粒后，分离质粒的DNA序列通过测序确定。产生的在gshA基因中有正确DNA序列而不带有EcoRI酶切位点的构建体称为pCR2.l-gShA_mutl。
[0099]进行相似的方法用于移除pCR2.l-gshA_mutl的gshA基因中BglII酶切位点，只有诱变引物 gshA-Bglllmut-for (SEQ ID N0.13)和 gshA-Bglllmut-rev (SEQ ID N0.14)用于诱变反应。
[0100]第二诱变反应的部分再次转化到“DH5 a ?-TlR大肠杆菌细胞”中(LifeTechnologies GmbH),在这些细胞中增殖,并且随后再次制备质粒，分离质粒的DNA序列通过测序确定。产生的在gshA基因中有正确DNA序列而不带有EcoRI和BglII酶切位点的构建体称为 pCR2.l_gshA_mut2。
[0101]实施例4:扩增编码tufB启动子(PtufB)的DNA片段
[0102]为了有效转录(过表达)gshA基因，使用tRNA-tufB操纵子的激活区(Lee etal.，1981，Cell25:251-258)。在大肠杆菌中的该操纵子编码结构基因thrU、tyrU、glyT和thrT,并且也编码“蛋白链延长因子(Elongat1n Factor)EF-Tu”(TufB)蛋白。所需的启动子序列利用寡核苷 tufBp-for (SEQ ID N0.15)和 tufBp-rev(SEQ ID N0.16)扩增。大肠杆菌菌株W3110 (ATCC27325)的基因组DNA可再次作为模板。DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳纯化并利用“QIA快速凝胶提取试剂盒”(Qiagen GmbH)从琼脂糖凝胶分离。纯化的PCR片段利用限制性酶XbaI消化并在_20°C下存储。
[0103]实施例5:用于gshA过表达的质粒的构建体(gshA质粒)
[0104]质粒pACYC184-LH作为基础质粒用于根据本发明的质粒的构建。图1示出了质粒PACYC184-LH的限制和功能图谱。除了 XbaI识别序列，质粒pACYC184_LH利用下列限制性位点也编码多聚接头区:
[0105]Notl-Ncol-Scal-Nsil-Mlul-Pacl-Notl。
[0106]A、具有其自身启动子的gshA基因的克隆
[0107]最初，描述于实施例2并且利用其自身启动子和稀有起始密码子TTG编码gshA基因的利用XbaI消化的PCR产物，被克隆至pACYC184-LH的XbaI酶切位点。连接混合物转化到“DH5 a ?-TlR大肠杆菌细胞”(Life Technologies GmbH)，在这些细胞中增殖并且，分离质粒的DNA序列通过测序确定。产生的构建体称为pgshAp-gshA?(见图2)。
[0108]B、turf B启动子的克隆
[0109]PCR产物利用XbaI消化，描述于实施例4，并且编码turfB启动子(turfBp)，也将其克隆至PACYC184-LH的XbaI酶切位点。连接混合物转化到“DH5 a ?-TlR大肠杆菌细胞”(Life Technologies),在这些细胞中增殖并且,分离质粒的序列通过测序确定。产生的构建体称为pACYC184-tufBp。
[0110]C、tufB启动子的优化
[0111]质粒PACYC184-tufBp作为模板在天然tufB启动子的DNA序列上进行总共3次优化(诱变)。通过“GeneTailor?定点诱变系统”(Life Technologies GmbH),优化核糖体结合位点(RBS)、tufB启动子的-10区和-35区，以便其最终编码这些原核启动子元件(见表1)的相应的共有性序列。
[0112]表1:RBS的DNA序列的比较，具有上述相应共有序列的tufB启动子的-10区和-35区。变异的核苷以粗体强调。
[0113]
元件在tufB启动子中共有序歹Li_

RBS V -ACTTGG - 3’_5’ -AGGAGG - 3’

-1 0 区-5，-TAGAAT _ 3，5? -TATAAT _ 3，

-35 区丨5，-TTGCAT - 3， 丨5，-TTGACA - 3，
[0114]使用诱变引物tufBp-RBSopt-for(SEQ ID N0.17)和 tufBp-RBSopt-rev (SEQ IDN0.18)，通过定点诱变质粒pACYC184-tufBp上的tufB启动子优化RBS。
[0115]利用“GeneTailor? 定点诱变系统”(Life Technologies)，在 tufB 启动子的 RBS上进行诱变反应之后，诱变反应的部分再次转化到“DH5aTM-TlR大肠杆菌细胞”中(LifeTechnologiesGmbH),在这些细胞中增殖,制备质粒后，分离质粒的DNA序列通过测序确定。产生的具有正确的DNA序列以及优化的RBS序列的构建体称为PACYClS^tufBp-RBStjpttj
[0116]仅当引物tufBp-10Qpt-for(SEQ ID N0.19)和 tufBp-10_-rev (SEQ ID N0.20)用于诱变时，使用相似的方法以优化(诱变)基于pACYC184-tufBp-RBSopt的-10区。
[0117]形成的并通过利用优化的RBS和-10区测序检测的质粒称为pACYC184-tufBp (RBS-10)
[0118]质粒pACYC184-tufBp (RBS-10) opt 再次作为模板利用引物 tufBp-35_-for (SEQ IDN0.21)和 tufBp-35Qpt-rev (SEQ ID N0.22)用于-35 区的诱变。
[0119]形成的并通过利用优化的RBS、_10区和-35区的测序检测的质粒称为ptufBp。产生的质粒PtufBp的限制和功能图谱如图3所示。
[0120]D、在ptufBp的优化tufB启动子后，克隆具有优化的起始密码子的gshA基因
[0121]具有起始密码子ATG的诱变gshA基因描述于实施例3，利用酶EcoRI和BglII，通过限制性酶切，从质粒PCR2.l-gshA_mut2中移除，并利用EcoRI和Bglll，再次克隆至载体ptufBpο
[0122]产生的构建体ptufBp-gshAATG (见图4)转化到“DH5 a ?_T1R大肠杆菌细胞”(LifeTechnologies)，在这些细胞中增殖，并且分离质粒的DNA序列，质粒的序列通过测序确定。
[0123]实施例6:利用serA和/或cysE等位基因以及orf306 ( = orf299、ydeD或eamA)延长gshA表达质粒ptufBp-gshAATG
[0124]为研究提高的L-半胱氨酸合成酶对Y-谷氨酰半胱氨酸产量的影响，利用serA和 / 或 cysE 等位基因以及 orf306 ( = orf299、eamA 或 ydeD)延长质粒 ptufBp-gshAATG。
[0125]A、利用serA等位基因延长质粒ptufBp-gshAATG
[0126]为延长具有特定serA等位基因的质粒ptufBp-gshAATG, serA基因最初利用其天然启动子通过PCR扩增。大肠杆菌菌株W3110(ATCC27325)的染色体DNA作为模板用于PCR反应。寡核苷 serA-Nco1-for(SEQ ID.N0.23)和 serA-Sac1-rev (SEQ ID N0.24)用于 PCR反应。
[0127]包括其自身启动子的扩增的serA基因随后利用酶NcoI和SacI消化，随后在琼脂糖凝胶上纯化，利用NcoI和SacI酶切连接至ptufBp-gshAATG载体。
[0128]连接混合物转化到“DH5a?-TlR大肠杆菌细胞”(Life Technologies GmbH)中，在这些细胞中增殖，并且分离质粒的DNA序列通过测序确定。在天然启动子的控制下具有serA的来自该克隆的gshA质粒称为ptufBp-gshAATG_serA。进行如EP1496111B1中实施例2的过程，以产生编码对L-丝氨酸具有反馈耐受的SerA变体的各种serA等位基因，除了作为模板的质粒ptufBp-gshAATG-serA用于改变在pFL209处的密码子349和/或372。来自具有不同serA等位基因的诱变的gshA质粒称为ptufBp-gshAATG_serA...,此处...对应于各自的serA等位基因序号(见图5ptufBp-gshAATG_serA2040)。
[0129]B、延伸具有cysE等位基因的质粒ptufBp-gshAATG
[0130]为延伸具有特定cysE等位基因的质粒ptufBp-gshAATG，W09715673的实施例6公开的质粒pACYC184/cysE…中的一种(表7)最初利用NsiI和NcoI酶解消化。在天然cysE启动子的控制下编码特定的cysE等位基因的各自约1.0kb大小的片段在琼脂糖凝胶上纯化，随后连接至利用NcoI和SacI线性化的ptufBp-gshAATe载体。来自该克隆的具有不同的cysE等位基因的gshA质粒称为ptufBp-gshAATG_cysE...,此处...对应于各自cysE等位基因的序号(见图 6ptufBp-gshAATG-cysE14)。
[0131]C、利用cysE等位基因延伸质粒ptufBp-gshAATG_ser
[0132]为延伸具有特定cySE等位基因的质粒？丨肛81)181^;^-86^丨，109715673的实施例6公开的质粒pACYC184/cysE…中的一种(表7)最初利用SacI和NsiI酶解消化。对应的约1.0kb大小的片段在琼脂糖凝胶上纯化，随后连接至利用SacI和NsiI线性化的ptufBp-gshAATG-serA…载体。来自具有不同cysE和serA等位基因的变异的gshA质粒称为
ptufBp-gshAATG-cysE----serA…，此处...对应于各自的serA等位基因序号(见图7ptufBp
-gshAATG-cysE14-serA2040)。
[0133] D、利用 orf306 延伸质粒 ptufBp-gshAATG-serA...、ptufBp-gshAATG_cysE…和ptufBp-gshAATG-cysE----serA...。
[0134]利用orf306 延伸相应的质粒 ptufBp-gshAATG, ptufBp-gshAATG_serA…、
ptufBp-gshAATG-cysE...和 ptufBp-gshAATG_cysE----serA…，EP885962B1 实施例 2 中公开的质粒pACYC184/cysEIV-GAPDH-0RF306最初利用NsiI和PacI消化。编码O-乙酰丝氨酸/半胱氨酸输出蛋白(EamA、YdeD)的约1.2kb大小的片段在琼脂糖凝胶上纯化，随后连接至利用 NsiI 和 PacI 线性化的 ptufBp-ptufBp-gshAATG-serA...、gshAATG_cysE…或
ptufBp-gshAATG-cysE----serA…载体之一。在GAPDH启动子控制下来自该具有orf306的克隆的 gshA 质粒称为 ptufBp-gshAATG_serA----orf306、ptufBp-gshAATG-cysE----orf306 和ptufBp-gshAATG_cysE…serA----orf306,此处...对应于各自的cysE或serA等位基因序号
(见图 8ptufBp-gshAATG-serA2040_orf306、图 9ptufBp-gshAATG-cysE14_orf306、以及图1OptufBp-gshAATG-cysE14-serA2040-orf306)。
[0135]实施例7:大肠杆菌菌株W3110(ATCC27325)和W3110 Λ gshB的转化
[0136]如已在实施例1中描述的，质粒pACYC184-LH作为阴性对照，将gshA表达质粒 pgshAp-gshATTG、ptufBp-gshAATG> ptufBp-gshAATG-serA2040> ptufBp-gshAATG-cysE14>ptufBp-gshAATG-cysE14-serA2040> ptufBp-gshAATG-serA2040-orf306>ptufBp-gshAATG-cysE14-orf306 和 ptufBp-gshAATG-cysE14-serA2040_orf306 通过电穿孔法转化到大肠杆菌株菌W3110(ATCC27325)以及W3110 Λ gshB中。在包含15mg/l四环素的LB琼脂糖平板上进行带质粒细胞的筛选。
[0137]实施例8: Y -谷氨酰半胱氨酸及其衍生物的分析
[0138]术语“总Y-谷氨酰半胱氨酸”包括Y-谷氨酰半胱氨酸以及由其形成的氧化产物双-Y-谷氨酰胱氨酸和Y-谷氨酰胱氨酸，三者在发酵期间形成并积累在上清液中。“总
Y-谷氨酰半胱氨酸”的浓度通过HPLC分析测定。
[0139]A、样品的预处理
[0140]为测量发酵罐的样品，微生物最初通过离心步骤以及随后的发酵液除菌过滤而除去。
[0141]为了精确测定“总Y-谷氨酰半胱氨酸浓度”，样品中待测定的Y-谷氨酰半胱氨酸衍生物在二硫苏糖醇(DTT)摩尔过量下进行还原，在室温22°C保持I小时。由于DDT的还原作用仅在中性至碱性PH条件下充分发挥，样品的pH，如果必要，利用浓缩的含水氢氧化钾溶液(KOH)预先调至pH>7.0。
[0142]B、HPLC 分析
[0143]在利用去离子水制备相应的稀释液后，在20 °C利用Synergi 4 μ mHydro-RP250x4.6mm 柱进行 HPLC 分析(Phenomenex Ltd., Aschaffenburg, D)。使用 0.5%(v/v)磷酸㈧和乙腈⑶作为洗脱液。
[0144]使用下列HPLC法用于从无细胞和还原物混合物中分离Y -谷氨酰半胱氨酸。
[0145].流速=0.5ml/min
[0146]?在 200nm 使用二极管阵列检测器(d1de array detector, DAD)检测
[0147].在 100% A 下等度(isocratically)进行分离
[0148]每次操作后通过利用100% B的润洗步骤清洁柱。
[0149]使用来自Sigma Aldrich GmbH(Steinheim, D)的还原性Y-谷氨酰半胱氨酸作为参照物，用于确定Y-谷氨酰半胱氨酸的滞留时间和待测样品的最终浓度。“总Y-谷氨酰半胱氨酸”的浓度由在色谱图的峰面积计算。
[0150]实施例9: Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的确定
[0151]为确定Y -谷氨酰胺半胱氨活性合成酶的活性，在补充有15g/l葡萄糖、5mg/l维生素 B1 和 15mg/l 四环素的 30ml 的 SMl 培养基(12g/l K2HPO4,3g/1 KH2PO4,5g/1 (NH4)2SO4'0.3g/l MgS04x7H20、0.015g/l CaCl2x2H20、0.002g/l FeS04x7H20、lg/1 柠檬酸三钠 x2H20、0.lg/1 NaCl ；lml/l 由 0.15g/l Na2Mo04x2H20、2.5g/l H3B03、0.7g/l CoC12x6H20、0.25g/1CuS04x5H20U.6g/l MnCl2x4H20、0.3g/l ZnS04x7H20 组成的微量元素溶液)中，接种 2ml 表2列出的菌株的过夜培养基。基于在600nm(0D_)的最初光密度0.025，整个30ml批料在30°C及135rpm下持续16小时。
[0152]随后细胞通过离心收集，冲洗并在2ml的缓冲液(10mM Tris-HCl pH 8.2)中重悬。细胞通过弗氏压碎器(French Press) (Spectronic Instruments, Inc.Rochester, NY, USA)在124106千帕压力下破裂。通过在30000g下离心澄清粗提物并且基于Y-谷氨酰半胱氨酸随时间的形成测定Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性。Y-谷氨酰半胱氨酸形成测试下的反应混合物由以下各项组成:
[0153]10mM Tris-HCl pH8.2 ; 1mM 葡萄糖酸钾；10mM L-半胱氨酸；20mM MgCl2 ；150mMKCl ；20mM ATP和0.25至4mg/ml粗提蛋白。来自Y -半胱氨酸和葡萄糖酸钾的ATP-依赖性形成的Y-谷氨酰半胱氨酸由另外的粗提蛋白引发。反应混合物的等分(20μ I至50μ I)在至少2小时的时间内移除。随后在70°C保持5分钟，Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性在样品(等分)中失活，并且形成的Y-谷氨酰半胱氨酸的内含物通过HPLC测定(见实施例8)。Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶的单位对应酶的数量，所述酶在25°C下，每分钟形成I微摩尔Y-谷氨酰半胱氨酸。
[0154]表2:具有质粒-编码的gshA过表达的研究gshB缺失菌株的Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶活性
[0155]

【权利要求】
1.一种能够过量生产Y-谷氨酰半胱氨酸、双-Y-谷氨酰胱氨酸和Y-谷氨酰胱氨酸的原核微生物菌株，由母株制备，其中，相对于所述母株，所述菌株具有降低的细胞谷胱甘肽合成酶活性，并且具有细胞Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性，相比于具有相似降低的细胞谷胱甘肽合成酶活性的菌株，所述菌株具有的所述细胞Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性更大地提闻。
2.根据权利要求1所述的微生物菌株，其中，根据本发明所述的菌株中所述谷胱甘肽合成酶活性降低以使所述活性最高是相应野生型菌株的谷胱甘肽合成酶活性的50%。
3.根据权利要求1或2所述的微生物菌株，其中，所述细胞Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性高于具有相似降低的细胞谷胱甘肽合成酶活性的菌株至少约5倍。
4.根据权利要求1或2所述的微生物菌株，其中，所述母株是大肠杆菌(Escherichiacoli)或菠萝泛菌(Pantoea ananatis)菌株的成员。
5.根据权利要求1或2所述的微生物菌株，其中，相对于相应母株，所述母株是具有Y-谷氨酰半胱氨酸生物合成途径以及提高的L-半胱氨酸生物合成能力的微生物菌株。
6.根据权利要求1或2所述的微生物菌株，其中，通过提高gshA基因或gshA同源基因的拷贝数或通过使用致使gshA表达增加的启动子，达到升高的所述Y-谷氨酰半胱氨合成酶活性。
7.根据权利要求1或2所述的微生物菌株，其中，通过在启动子控制下克隆至质粒载体来提高gshA或gshA同 源基因的拷贝数。
8.根据权利要求1或2所述的微生物菌株，其中，GshA具有以下蛋白序列:在第494位的氨基酸丙氨酸已被置换为缬氨酸或亮氨酸(A494V或A494L)，或者在第495位的氨基酸丝氨酸已被置换为苏氨酸(S495T)。
9.根据权利要求1或2所述的微生物菌株，其中，所述gshA基因的天然起始密码子TTG已被ATG替换。
10.一种用于过量生产Y-谷氨酰半胱氨酸(YGC)以及该二肽的衍生物Y-谷氨酰胱氨酸和双-Y-谷氨酰胱氨酸的方法，其中，在发酵培养基中培养根据权利要求1至9中任一项所述的微生物菌株，从所述培养基中除去细胞，并从所述培养基中纯化所需产物。
【文档编号】C12R1/01GK104164381SQ201410191775
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年5月7日 优先权日:2013年5月17日
【发明者】马塞尔·托恩, 托马斯·施勒泽尔 申请人:瓦克化学股份公司