导入异源代谢途径的产1-丙醇微生物及使用所述微生物生产1-丙醇的方法
【专利摘要】本发明涉及导入异源代谢途径的产1-丙醇微生物及使用所述微生物生产1-丙醇的方法。所述产1-丙醇微生物中导入了1-丙醇生产的代谢途径并抑制了副产物乳酸的生成。更确切的说，是在大肠杆菌中高效表达了乙醇脱氢酶(Alcohol?dehydrogenase)的基因adhE2，编码甲基丙二酰辅酶A异构酶(Methylmalonyl-CoA?epimerase)的基因epi，编码甲基丙二酰辅酶A变位酶的基因Sbm，编码甲基丙二酰辅酶A脱羧酶的基因ygfG和编码乙醛脱氢酶2的基因mhpF。这些基因是被构建于带有T1启动子，含有抗生素抗性的表达质粒上。将构建好的质粒转入大肠杆菌微生物中，结果得到了可以利用葡萄糖生产1-丙醇的生产菌株，但是同时得到了大量的副产物乳酸，通过抑制副产物的产生，使本发明的1-丙醇生产方法更为有效。
【专利说明】导入异源代谢途径的产1-丙醇微生物及使用所述微生物生产1-丙醇的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及导入1-丙醇代谢途径的产1-丙醇微生物及使用所述微生物有效生产1-丙醇的方法，更确切的说，本发明涉及导入1-丙醇代谢途径和抑制其副产物乳酸生产的微生物，以及使其高效生产1-丙醇的方法。
【背景技术】
[0002]1-丙醇在医药工业中常用于生产丙磺舒(Probenecid),红霉素(Erythrocin),丙基戍酸钠(Sodium valproate), 2，5 —吡唳二甲酸二丙酯(2, 5-Pyridinedicarboxylicacid dipropyl phthalate)等药物，由于其具有淡淡的香味,也可用于制造洗发水,润肤乳，和指甲油等化妆品和护肤品，1-丙醇还可用作植物油天然橡胶和树脂，某些合成树脂，聚乙烯缩丁醛，乙基纤维素等的溶剂，在工业上，还常在苯胺印刷术中用于制造油墨的溶剂。工业上主要用来合成乙酸丙酯(Propyl acetate),正丙胺(Propylamine)等化工产品的原料，也可用于生产醋酸纤维，或者作为增塑剂，金属脱垢剂使用。1-丙醇还可以在喷气燃料中用来控制胶凝体生成，某些特定情况下可以用来代替沸点较低的乙醇作为反应溶剂。
[0003]由于1-丙醇的广泛用途及高价值，1-丙醇的生产得到了广泛的关注，目前，研究的热点集中在化学合成法上。在石油化学工业上，1-丙醇主要是以乙烯(Ethene)为原料，经过一氧化碳和氢气合成反应产生丙醒(Propionaldehyde),然后再由丙醒加氢制得。所用催化剂有:钴或铑的羰基化合物，骨架催化剂(如镍、铜)，钌络合物等，这些催化剂中，在工业上最常使用骨架催化剂 ，但是在液相加氢反应中，大多采用镍系催化剂进行催化反应，而气相加氢反应中，大多使用了铜系催化剂。此外，1-丙醇也可利用低级烷烃的氧化液生产，在工业生产中，利用马铃薯或者谷物发酵生产乙醇时，1-丙醇也是常见的副产物。由于化学合成法合成1-丙醇必须使用高温，高压及贵重金属催化剂，且副产物较多，给下游分离纯化带来困难，合成成本较高，限制了化学合成法的发展。所以人们已经积极开始研究生物法来生产1-丙醇。
[0004]自然界中很多微生物可以合成1-丙醇，如克雷伯氏菌属(Klebsiella)和梭状芽胞杆菌属(Clostridium)等，这些细菌利用碳源的种类各不相同，并且这些菌生产1-丙醇时产生较多的副产物，如:乙醇(Ethanol),乳酸(Lactate),醋酸(Acetate),甲酸(Formate)等，这些底物均能在不同程度上抑制细菌的生长与目的产物的产生，并且这些菌株并不是成熟的模式生物，有些有一定的致病性，存在遗传背景不清楚，基因操作方法不成熟等问题。大肠杆菌具有生物量较大，发酵周期短，生物背景明确，并且产生较少或者不产乙醇，丁酸等副产物，因此，我们使用了模式生物大肠杆菌作为生产菌株，引入人工合成途径，达到利用葡萄糖生产1-丙醇的目的。
[0005]2008年，Atsumi等人在大肠杆菌中构建了利用葡萄糖生产1_丙醇的代谢途径，该途径依赖于酮酸的代谢途径，引入了两个中间代谢产物的关键酶来生产1-丙醇，经过一系列代谢网络的优化，1-丙醇的最终达到产量lg/L。另外一种1-丙醇代谢途径是通过1，2_丙二醇在二元醇脱水酶(Diol dehydratase)的作用下生产1_丙醛，再由乙醇脱氢酶(Primary alcohol dehydrogenase)催化脱氢转化为目的产物，Rachit等人在大肠杆菌中构建了这一合成途径，最终得到的约0.8g/L的1-丙醇(见图1)。这两种方法，都经过大肠杆菌中的碳代谢流量较少的代谢途径，导致了下游产物无法大量合成，限制了目的产物产量。
[0006]本发明设计了一条新的途径，葡萄糖通过糖酵解途径，进入三羧酸循环，由琥珀酰辅酶A在甲基丙二酰辅酶A变位酶(Methylmalonyl CoA mutase)的催化下生成L-甲基丙二酰辅酶A,再由甲基丙二酰辅酶A异构酶(Methylmalonyl-CoA epimerase)异构化为D-甲基丙二酰辅酶A，D-甲基丙二酰辅酶A经ygfG编码的甲基丙二酰辅酶A脱羧酶(Methylmalonyl-CoA decarboxylase)催化生成丙醇辅酶A,然后再adhE2编码的乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase)或mhpF编码的乙醒脱氢酶2 (Acetaldehydedehydrogenase2)催化下生成1_丙醇。该途径的优势在于利用了生物体内最重要也是碳通量最大的糖酵解途径和三羧酸循环中的中间代谢物来生产1-丙醇，具有很好地工业潜力和应用前景。结果，本发明人敲除了代谢副产物乳酸的生产支路，导入带有上述基因编码的不同拷贝数的质粒，证实了通过抑制乳酸的生成和外源基因的导入，大肠杆菌可以高效的生产1-丙醇，从而完成了本发明。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供产1-丙醇微生物，所述产1-丙醇微生物通过转入异源的5个基因来组成新的合成途径,并通过抑制副产物乳酸的生成来提高1-丙醇的产率。
[0008]本发明的另一个目的是提供所述产1-丙醇的微生物的生产方法。 [0009]本发明的又一目的是使用所述敲除乳酸代谢支路产1-丙醇微生物在葡萄糖的培养基上高效的生产1-丙醇的方法。
[0010]为了实现上述目的，本发明提供了乳酸代谢被抑制的产1-丙醇的微生物，通过向大肠杆菌中导入含有1-丙醇代谢途径相关基因的质粒制备所述产1-丙醇的微生物。
[0011]本发明还提供了乳酸代谢途径被抑制的产1-丙醇微生物的生产方法，通过向大肠杆菌中转导噬菌体制备所述产1-丙醇的微生物。
[0012]本发明还提供了大量生产1-丙醇的方法，所述方法包括以下步骤:
[0013]I)在含有葡萄糖和GL、M9培养基中培养如权利要求1中所述的产1_丙醇微生物；
[0014]2)由所培养的微生物生产1-丙醇。
[0015]如上文所解释的那样，本发明涉及1-丙醇的有效生产方法，所述方法的特征在于:使用抑制乳酸代谢途径并导入异源代谢途径的产1-丙醇的微生物，在培养基中生长并达到生产1-丙醇的目的。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1大肠杆菌利用葡萄糖合成1-丙醇的代谢网络示意图
[0017]图2新构建的大肠杆菌利用葡萄糖合成1-丙醇的代谢途径示意图
[0018]图3葡萄糖生产1-丙醇的质粒方式之一[0019]图4葡萄糖生产1-丙醇的质粒方式之二
[0020]图5培养基与质粒选取发酵结果
【具体实施方式】
[0021]具体实施例1
[0022]产1-丙醇微生物的构建
[0023]提取丙酮丁醇梭杆菌(C.acetobutylicum ATCC824)的基因组，设计引物，进行PCR，得到编码乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase)的基因adhE2。提取谢氏丙酸杆菌(P.shermanii)的基因组，设计引物，进行PCR，得到编码甲基丙二酰辅酶A异构酶(Methylmalonyl-CoA epimerase)的基因epi。提取大肠杆菌(E.coli)的基因组，设计引物，进行PCR,得到编码甲基丙二酰辅酶A变位酶(Methylmalonyl CoA mutase)的基因Sbm,编码甲基丙二酰辅酶A脱羧酶(Methylmalonyl-CoA decarboxylase)的基因ygfG和编码乙醒脱氢酶2 (Acetaldehyde dehydrogenase2)的基因mhpF。将这五个基因(分两组)分别与酶切好的PZE12连接，得到连接液备用。
[0024]热击法感受态的制备:将大肠杆菌BW25113，BL21*(DE3)，XLBlue平板挑取单菌落，在3mL LB培养基的试 管中37°C，250rpm培养过夜，第二天早上取1%接种于5OmLLB培养基的三角瓶中，培养至0D600到达0.2-0.4之间(约2hrs-2.5hrs)，取出培养液，置于冰上15min, 5000rpm, 4°C离心，弃上清，加入IOmL CCBl溶液，重新混悬，置于冰上IOmin,5000rpm，4°C离心，弃上清，重复一次，加入ImLCCBl溶液，重悬菌体，置于冰上，放入4V冰箱，12hrs后取出，加入ImL CCB2溶液，充分混匀，分装成50 μ L小管，_80°C保存待用。
[0025]CCBl溶液配制:5.15g CaCl2溶于200mL超纯水中，灭菌40min,冷却后加入2.5mL的IM MgSO4溶液。
[0026]CCB2溶液配制:2.06g CaCl2溶于128mL超纯水中，加入72mL甘油，灭菌40min，冷却后加入ImL的IM MgSO4溶液。
[0027]电转化法:将制备好的感受态细胞50 μ L置于冰上，加入2 μ L质粒，轻轻吸打混匀，放入预冷的电击杯中，1800V电击，用500 μ L LB培养基洗出菌体，置于1.5mL离心管中，37V复苏30min。将培养液涂于加入抗生素筛选标记的平板上，37°C过夜培养。
[0028]热击法:将制备好的感受态细胞50 μ L置于冰上，加入20 μ L上述步骤连接液，轻轻吸打混匀，冰浴30min。将混悬液置于42°C热水中90sec，拿出放于冰上2min。37V复苏30min。将培养液涂于加入抗生素筛选标记的平板上，37°C过夜培养。提取质粒待用。
[0029]电转化法感受态的制备:将大肠杆菌BW25113平板挑取单菌落，在3mL LB培养基的试管中37°C，250rpm培养过夜，第二天早上取1%接种于50mL LB培养基的三角瓶中，培养至 0D600 到达 0.2-0.4 之间(约 2hrs-2.5hrs)，5000rpm，4°C离心，弃上清，加入 IOmLlO%甘油，重新混悬；5000rpm,4°C离心，弃上清,加入2mL10 %甘油，重新混悬；重复此步骤一次；最后加入200 μ LlO %甘油混悬，置于冰上，待用。
[0030]取构建好的质粒2 μ L加入50 μ L，通过1800V电压电击转化。37°C复苏30min。将培养液涂于加入抗生素筛选标记的平板上，37°C过夜培养。
[0031]表1实验所使用菌种和质粒
[0032]
【权利要求】
1.乳酸生产途径被抑制的产1-丙醇微生物，通过向大肠杆菌菌株中导入含有1-丙醇代谢途径相关基因的基因表达元件制备所述产1-丙醇的微生物。
2.如权利要求1所述的乳酸生产被抑制的产1-丙醇微生物，其中，所述基因表达元件为下述I)-3)的质粒中的一种: .1)由Tl启动子、氨苄青霉素(Ampicillin)抗性、编码乙醇脱氢酶(Alcoholdehydrogenase)的基因adhE2，编码甲基丙二酸辅酶A异构酶(Methy lmalony 1-CoAepimerase)的基因epi，编码甲基丙二酸辅酶A变位酶(Methylmalonyl CoA mutase)的基因Sbm，编码甲基丙二酸辅酶A脱駿酶(Methylmalonyl-CoA decarboxylase)的基因ygfG和编码乙醒脱氣酶2 (Acetaldehyde dehydrogenase2)的基因mhpF组成的100-150个拷贝数的质粒； . 2)由Tl启动子、卡那霉素(Kanamycin)抗性、编码乙醇脱氢酶(Alcoholdehydrogenase)的基因adhE2，编码甲基丙二酸辅酶A异构酶(Methy lmalony 1-CoAepimerase)的基因epi，编码甲基丙二酸辅酶A变位酶(Methylmalonyl CoA mutase)的基因Sbm，编码甲基丙二酸辅酶A脱駿酶(Methylmalonyl-CoA decarboxylase)的基因ygfG和编码乙醒脱氢酶2 (Acetaldehyde dehydrogenase2)的基因mhpF组成的30-50个拷贝数的质粒；以及 . 3)由Tl启动子、氯霉素(Chloramphenicol)抗性、编码乙醇脱氢酶(Alcoholdehydrogenase)的基因adhE2，编码甲基丙二酸辅酶A异构酶(Methy lmalony 1-CoAepimerase)的基因epi，编码甲基丙二酸辅酶A变位酶(Methylmalonyl CoA mutase)的基因Sbm，编码甲基丙二酸辅酶A脱駿酶(Methylmalonyl-CoA decarboxylase)的基因ygfG和编码乙醒脱氢酶2 (Acetaldehyde dehydrogenase2)的基因mhpF组成的5-10个拷贝数的质粒。
3.如权利要求1所述的乳酸生产途径被抑制的产1-丙醇微生物，其中所述大肠杆菌选自于大肠杆菌BW25113、JM109或MG1655。
4.如权利要求1所述的乳酸生产途径被抑制的产1-丙醇微生物，其中所述大肠杆菌为乳酸代谢途径单敲除菌株或多敲除菌株。
5.如权利要求1所述的乳酸生产途径被抑制的产1-丙醇的微生物生产方法，通过向大肠杆菌中转入含有1-丙醇代谢途径相关基因的质粒制备的所述产1-丙醇微生物。
6.如权利要求5所述的乳酸生产途径被抑制的产1-丙醇的微生物生产方法，所述生产方法包括将下述I)-3)质粒中的一种转入大肠杆菌中的步骤: .1)由Tl启动子、氨苄青霉素(Ampicillin)抗性、编码乙醇脱氢酶(Alcoholdehydrogenase)的基因adhE2，编码甲基丙二酰辅酶A异构酶(Methylmalonyl-CoA epimerase)的基因epi，编码甲基丙二酸辅酶A变位酶(Methylmalonyl CoA mutase)的基因Sbm，编码甲基丙二酰辅酶A脱羧酶(Methylmalonyl-CoA decarboxylase)的基因 ygfG 和编码乙醒脱氣酶 2 (Acetaldehydedehydrogenase2)的基因mhpF组成的100-150个拷贝数的质粒； .2)由Tl启动子、卡那霉素(Kanamycin)抗性、编码乙醇脱氢酶(Alcoholdehydrogenase)的基因adhE2，编码甲基丙二酸辅酶A异构酶(Methy lmalony 1-CoAepimerase)的基因epi，编码甲基丙二酸辅酶A变位酶(Methylmalonyl CoA mutase)的基因Sbm,编码甲基丙二酸辅酶A脱竣酶(Methylmalonyl-CoA decarboxylase)的基因ygfG和编码乙醒脱氢酶2 (Acetaldehyde dehydrogenase2)的基因mhpF组成的30-50个拷贝数的质粒；以及 3)由Tl启动子、氯霉素(Chloramphenicol)抗性、编码乙醇脱氢酶(Alcoholdehydrogenase)的基因adhE2,编码甲基丙二酸辅酶A异构酶(Methy lmalony 1-CoAepimerase)的基因epi,编码甲基丙二酸辅酶A变位酶(Methylmalonyl CoA mutase)的基因Sbm,编码甲基丙二酸辅酶A脱竣酶(Methylmalonyl-CoA decarboxylase)的基因ygfG和编码乙醒脱氢酶2 (Acetaldehyde dehydrogenase2)的基因mhpF组成的5-10个拷贝数的质粒。
7.如权利要求5所述的乳酸生产途径被抑制的产1-丙醇微生物的生产方法，其中所述大肠杆菌选自于大肠杆菌BW25113、JM109或MG1655。
8.如权利要求5所述的乳酸生产途径被抑制的产1-丙醇微生物的生产方法，，所述方法包括以下步骤； 1)在含有葡萄糖、GL或M9培养基中培养如权利要求1中所述的产1-丙醇微生物； 2)由所培养的微生物生产1-丙醇。
【文档编号】C12N15/70GK103923871SQ201410191750
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年5月8日 优先权日:2014年5月8日
【发明者】袁其朋, 申晓林, 肖灵晨, 王佳 申请人:北京化工大学