被改造以产生异丙醇的微生物的制作方法

专利名称：被改造以产生异丙醇的微生物的制作方法
技术领域：
本发明提供了代谢性修饰(Metabolically-modified)的微生物和产生该微生物 的方法。本发明还提供了通过将适当的底物与代谢性修饰的微生物和来自该微生物的酶制 剂接触而产生生物燃料的方法。
背景技术：
出于经济和环境的考虑，预期对于作为汽油替代物的生物燃料的需求会增加。常 见的生物燃料——乙醇——并不理想，因为其能量密度低于汽油，并且必须以有限的浓度 范围与汽油混合以便用作运输燃料。乙醇也是吸湿性的和腐蚀性的，从而引起储存和配送 系统方面的问题。异丙醇与1-丁醇一样对乙醇具有优势；增加的优势是，由于其分支的碳 链，异丙醇的辛烷值高于1-丁醇。1-丁醇作为发酵产物而生产，并且用作发动机燃料，但异 丙醇从未以高收率从可再生资源中生产并且从未被认为是汽油替代品，即使其已经被用作 发动机添加剂。

发明内容
本文提供了代谢性修饰的微生物，其包括用于产生生物燃料诸如异丙醇的重组生 物化学途径。还提供了使用本文所述的微生物生产生物燃料的方法。本发明提供了一种重组微生物，包括从适当的碳底物的发酵生产异丙醇的生物化 学途径，所述生物化学途径包括乙酰辅酶A乙酰基转移酶，其中所述微生物包括至少一种 与相应的亲代微生物相比异源的多肽。在一个实施方案中，该微生物包括与亲代微生物相 比具有乙酰辅酶A乙酰基转移酶活性的多肽表达升高，其中所述重组微生物从包括乙酰辅 酶A的底物产生包括乙酰乙酰辅酶A的代谢物。在一个实施方案中，具有乙酰辅酶A乙酰基 转移酶活性的多肽由atoB基因或其同源物，或fadA基因或其同源物编码。在另一个实施方 案中，具有乙酰辅酶A乙酰基转移酶活性的多肽由与SEQ ID NO :1中所示的序列具有至少 约50%同一性的多核苷酸编码。atoB基因或fadA基因可来自埃希杆菌属。在一个实施方案 中，所述微生物是重组大肠杆菌(E. coli)。还在进一步的实施方案中，具有乙酰辅酶A乙酰 基转移酶活性的多肽由thl基因或其同源物编码。在一个实施方案中，thl基因来自梭菌属 (genus Clostridium)。还在另一个实施方案中，微生物包括与亲代微生物相比具有乙酰乙 酰辅酶A转移酶活性的多肽表达升高，其中该重组微生物从包括乙酰乙酰辅酶A的底物产 生包括乙酰乙酸的代谢物。在进一步的实施方案中，乙酰乙酰辅酶A转移酶由atoAD基因或 其同源物编码(例如，atoD包括SEQ ID NO :3中所示的序列)。在一个实施方案中，atoD包 括与SEQ ID NO :3至少50%、60%或70%或更高相同的序列。在另一个实施方案中，atoAD基因来自大肠杆菌。还在另一个实施方案中，微生物包括与亲代微生物相比具有乙酰乙酸 脱羧酶活性的多肽表达升高，其中该重组微生物从包括乙酰乙酸的底物产生包括丙酮的代 谢物。在另一个实施方案中，微生物包括由adc基因或其同源物编码的乙酰乙酸脱羧酶。 在一个实施方案中，adc基因来自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、溶纤维 丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)、热角军H高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharoIyticum)和艰难梭菌(Clostridium difficile)。在具体的实施方案中， 该微生物是丙酮丁醇梭菌。还在另一个实施方案中，乙酰乙酸脱羧酶包括与SEQ ID NO 5至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99. 5%相同的序列。在另一个实施方案中，微生 物包括与亲代微生物相比具有仲醇脱氢酶活性的多肽表达升高，其中该重组微生物从包括 丙酮的底物产生包括异丙醇的代谢物。在一个实施方案中，具有仲醇脱氢酶活性的多肽由 adh或sadh基因或其同源物编码。还在另一个实施方案中，adh基因来自布氏热厌氧杆菌 (T.brockii)或拜氏梭菌(C.beijerinckii)0还在进一步的实施方案中，adh或sadh包括 与SEQ ID N0:7或9至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99.5%相同并具有醇脱氢酶 活性的序列。在一个实施方案中，微生物包括乙酰辅酶A乙酰基转移酶、乙酰乙酰辅酶A转 移酶、乙酰乙酸脱羧酶和adh (仲醇脱氢酶)的表达或增加的表达。本发明还提供了一种重组微生物，其包括从适当的碳底物的发酵产生异丙醇的重 组生物化学途径，其中该重组生物化学途径包括乙酰辅酶A乙酰基转移酶、乙酰乙酰辅酶A 转移酶、乙酰乙酸脱羧酶和adh (仲醇脱氢酶)的升高表达。本发明进一步提供了一种产生重组微生物的方法，该微生物将适当的碳底物转变 为异丙醇，该方法包括用编码具有乙酰辅酶A乙酰基转移酶、乙酰乙酰辅酶A转移酶、乙酰 乙酸脱羧酶和adh(仲醇脱氢酶)活性的多肽的一种或多种多核苷酸转化微生物。本发明提供了一种产生异丙醇的方法，该方法包括在生物体中诱导thl或atoB基 因、CtfAB或atoAD基因或操纵子、adc基因、adh(仲醇脱氢酶)基因、或其任何组合的过度 表达，其中该生物体当在适当的碳底物的存在下培养时产生异丙醇。本发明提供了一种产生异丙醇的方法，该方法包括在产生异丙醇的条件下培养上 述的微生物。本发明还提供了一种产生异丙醇的方法，该方法包括(i)诱导生物体中thl或 atoB基因的过度表达；(ii)诱导生物体中CtfAB或atoAD基因的过度表达；(iii)诱导生物 体中adc基因的过度表达；(iv)诱导生物体中adh基因的过度表达；或(ν)诱导⑴、(ii)、 (iii)和(iv)的过度表达。本发明提供了一种重组载体，包括(i)编码第一多肽的第一多核苷酸，该第一多 肽催化从包括乙酰乙酰辅酶A的底物向乙酰乙酸的转变；(ii)编码第二多肽的第二多核苷 酸，该第二多肽催化从包括乙酰乙酸的底物向丙酮的转变；以及(iii)编码第三多肽的第 三多核苷酸，该第三多肽催化从包括丙酮的底物向异丙醇的转变。在一个实施方案中，该载 体可以是质粒。在另一个实施方案中，该载体可以是表达载体。此外，该载体可用来转化或 转染宿主细胞(例如，微生物)。转染或转化的微生物可用来产生异丙醇。本发明提供了一种重组微生物，包括至少一条促进葡萄糖向异丙醇转变的异源核 酸序列。本发明的一个或多个实施方案的细节在下面的附图和说明中给出。从说明和附图以及从权利要求中，其他特征、目的和优势将是显而易见的。附图简要说明

图1显示产生异丙醇的代谢途径。图2显示途径基因的各种组合的最大异丙醇产量的比较。图 3 显示 TAll (pTA39/pTA36 :thl-atoAD-adc_adh (cb))产生异丙醇的时程。图4显示用于本发明的方法和组合物中的adh多核苷酸的序列(SEQ ID NO 7和 9)。详细描述在本文中除非另外具体注明，使用的术语的定义为制药学领域中所使用的标准定 义。除非上下文另外明确地指明，在说明书和所附的权利要求中所使用的单数形式“一个”、 “一种”和“该”包括复数指代物。因此，例如，提到“一种底物”包括两种或更多种该类底物 的混合物，等等。除非另外说明，使用“或”的含义是“和/或”。类似地，“包括”、“包含”和“含有” 是可互换的，不意在是限制性的。要进一步理解的是，在各实施方案的描述使用术语“包括”时，本领域技术人员
将理解，在一些特定的情况下，可选地，实施方案可使用语言“基本上由......组成”或
“由......组成”来描述。除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技 术人员所普遍理解的相同含义。尽管在所公开的方法和组合物的实施中可使用与本文中所 述的相似或等效的任何方法和试剂，但现在示例性的方法和材料被描述。本文中所提到的所有出版物的全部内容以引用方式合并入本文中用于说明和公 开在这些出版物中描述的方法学，其可与本文中的描述结合使用。上面和整篇文章中所讨 论的出版物被提供，仅仅是因为他们在本发明申请日之前公开。本文中的任何内容都不应 被解释为承认因为在先公开而使本发明人无权占先于这些公开。1- 丁醇的天然生产物，诸如丙酮丁醇梭菌，也产生诸如丙酮、乙醇和丁酸的副产物 作为发酵产物。已经开发了高产量ι-丁醇生产物来优化收率和生产率。然而，这些微生物 的大多数相对地难以操作。用于这些微生物的遗传工具不如用于用户友好宿主诸如大肠 杆菌的遗传工具那样有效，并且对其生理学及其代谢调节理解较少，阻止了向高效率生产 的快速发展。此外，也没有鉴定到从葡萄糖生产工业相关数量级的其他高级醇诸如异丙醇、 2-甲基1-丁醇、3-甲基1-丁醇和2-苯乙醇的天然微生物，尽管作为微生物副产物已经被 鉴定到小量的这些高级醇。在各个实施方案中，本文中提供的代谢改造微生物(metabolically engineeredmicroorganism)包括用于生产包括异丙醇的醇类的生物化学途径。在各个方 面，本文中提供的重组微生物包括与亲代微生物相比至少一种靶酶表达升高。靶酶由来自 适当的生物来源的核酸序列编码，并从其表达。在一些方面，核酸序列是来自细菌或酵母来 源的基因。如在此使用的术语“代谢改造的”或“代谢改造”涉及合理的途径设计，以及生物 合成基因、操纵子相关基因和这些核酸序列的控制元件的组装，用于在微生物中产生所需 的代谢物，诸如醇。“代谢工程”可进一步包括通过使用遗传工程改造和合适的培养条件调节和优化转录、翻译、蛋白质稳定性和蛋白质功能性质来优化代谢通量。生物合成基因可 以是与宿主(例如，微生物)异源的，或是由于来源于宿主外，或在内源性宿主细胞中通过 诱变、重组和/或与异源表达控制序列相关联而被修饰。合适的培养条件是培养基PH、离 子强度、营养含量等条件；温度条件；氧/CO2/氮含量条件；湿度条件；以及允许由宿主微生 物——即通过微生物的代谢作用——产生化合物的其他培养条件。对于可用作宿主细胞的 微生物，合适的培养条件是公知的。因此，通过将遗传物质导入至选择的宿主或亲代微生物中从而修饰或改变微生物 的细胞生理学和生物化学而产生代谢“改造的”或“修饰的”微生物。通过遗传物质的导入， 亲代微生物获得新的性状，例如，产生新的或较大数量的细胞内代谢物的能力。在说明性的 实施方案中，遗传物质导入亲代微生物中产生新的或修饰的能力以产生醇诸如异丙醇。导 入亲代微生物中的遗传物质包含编码参与产生醇的生物合成途径的一种或多种酶的基因 (一种或多种)，或基因的一部分，并且还包括用于表达这些基因和/或调节这些基因的表 达的其他元件，例如，启动子序列。本文中提供的微生物被修饰从而以亲代微生物中不能获得的数量产生代谢物。 “代谢物”指由代谢产生的任何物质或特定代谢过程中必需的物质或参与特定代谢过程中 的物质。代谢物可以是有机化合物，该化合物是代谢的起始物质(例如，葡萄糖或丙酮酸)、 代谢的中间产物(例如，乙酰辅酶A)或代谢的终产物(例如，异丙醇)。代谢物可用来构建 更复杂的分子，或它们可分解为更简单的分子。中间代谢物可从其他代谢物合成，可能用于 制备更复杂的物质，或分解成为更简单的化合物，常常有化学能的释放。代谢的终产物是其 他代谢物分解的最终结果。术语“生物合成途径”还称为“代谢途径”，指用于将一种化学物种转变(改变)为 另一种的一组合成代谢或分解代谢生化反应。如果多个基因产物并联地或串联地作用于相 同的底物，产生相同的产物，或作用于或产生相同的底物和代谢终产物之间的代谢中间产 物(即，代谢物)，则这些基因产物属于同一“代谢途径”。术语“底物”或“适当的底物”指通过酶的作用转变为或试图转变为另一化合物的 任何物质或化合物。该术语不仅包括单一化合物，还包括化合物的组合，诸如含有至少一种 底物、或其衍生物的溶液、混合物和其他物质。此外，术语“底物”不仅包括提供适合用作起 始物质的碳源的化合物，诸如任何生物质衍生糖，而且包括与如本文中所述的代谢改造微 生物相关的途径中使用的中间代谢产物和代谢终产物。“生物质衍生糖”包括，但不限于， 诸如葡萄糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖的分子。术语生物质衍生糖包括通常由微生物利用的 适当的碳底物，诸如六碳糖，包括但不限于所有D或L型的葡萄糖、乳糖、山梨糖、果糖、艾杜 糖、半乳糖和甘露糖，或六碳糖的组合，诸如葡萄糖和果糖，和/或六碳糖酸，包括但不限于 2_酮-L-古洛糖酸、艾杜糖酸(IA)、葡萄糖酸(GA)、6_磷酸葡萄糖酸、2-酮-D-葡萄糖酸 (2KDG)、5_酮-D-葡萄糖酸、2-酮基葡萄糖酸磷酸盐、2，5- 二酮-L-古洛糖酸、2，3-L- 二酮 基葡萄糖酸、脱氢抗坏血酸、异抗坏血酸(EA)和D-甘露糖酸。本文中提供的重组微生物可表达参与使用适当的碳底物产生异丙醇的途径中的 多种靶酶。许多微生物可被修饰以包括适于产生异丙醇的重组代谢途径。多种微生物可用作 编码适合用于本文提供的重组微生物中的靶酶的遗传物质的“来源”。术语“微生物”包括
8来自古细菌域、细菌域和真核生物域的原核和真核微生物物种，后者包括酵母和丝状真菌、 原生动物、藻类或高等原生生物。术语“微生物细胞”和“微生物(microbes)”与术语微生 物互换使用。术语“原核生物”是本领域公知的，并且指不含有核或其他细胞器的细胞。原核生 物通常被分入两个域——细菌域和古细菌域——中的一个域。古细菌域和细菌域的生物体 之间的定义差别基于16S核糖体RNA中核苷酸碱基序列的根本差异。术语“古细菌”指一类疵壁菌门(division Mendosicute)生物体，一般见于异 常环境中，并且通过几个标准与原核生物的其余生物相区别，包括核糖体蛋白的数目和 细胞壁中缺少胞壁酸。基于ssrRNA分析，古细菌由系统发育不同的两群组成泉古菌门 (Crenarchaeota)和广古菌门(Euryarchaeota)。基于其生理学，古细菌编为三类产甲 烷菌(methanogen)(产生甲烷的原核生物)；极端嗜盐菌(extreme halophile)(在非 常高的盐浓度([NaCl])下生活的原核生物)；以及极端(超)嗜热菌(extreme (hyper) thermophilus)(在非常高的温度下生活的原核生物)。除了使它们与细菌相区分的统一古 细菌特征(即，细胞壁中没有胞壁质，无酯连接膜脂等)以外，这些原生生物显示独特的结 构或生物化学属性，使其适应于其特殊的栖息地。泉古菌门主要由超嗜热硫依赖型原核生 物(hyperthermophilicsulfur-dependent prokaryote)组成，而广古菌门包含产甲烧菌禾口 极端嗜盐菌。“细菌”或“真细菌(eubacteria)”指原核生物体的一个域。细菌包括如下至少 11个不同的群(1)革兰氏阳性(革兰氏+)细菌，其中有两种主要的亚门(subdivision) (1)高G+C群(放线菌属(Actinomycetes)、分枝杆菌属(Mycobacteria)、微球菌属 (Micrococcus)等)，(2)低 G+C 群(杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridia)、乳酸菌 属(Lactobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococci)、链球菌属(Str印tococci)、支原体 属(Mycoplasmas)) ； (2)变形菌(Proteobacteria)，例如，紫色光合+非光合革兰氏阴 性细菌(包括最“常见的”革兰氏阴性菌)；(3)蓝细菌(Cyanobacteria)例如，产氧光 合菌(oxygenic phototrophs), (4)螺旋体(Spirochetes)及亲缘种；(5)浮霉状菌属 (Planctomyces) ； (6)拟杆菌属(Bacteroides)、黄杆菌属(Flavobacteria) ； (7)衣原体 属(Chlamydia) ； (8)绿色硫细菌(Green sulfurbacteria) ； (9)绿色非硫细菌(Green non-sulfur bacteria) (^W^BiM.jtn-M (anaerobic phototrophs)) ； (10)而畐身寸 微球菌(Radioresistant micrococci)及亲缘细菌；(11)嗜热栖热袍菌(Thermotoga thermophiles)禾口嗜热栖热腔菌(Thermosiphothermophiles)。“革兰氏阴性细菌”包括球菌(cocci)、非肠道杆菌(nonenteric rods)和肠 道杆菌(enteric rods)。革兰氏阴性细菌属包括，例如，奈瑟菌属(Neisseria)、螺 菌属(Spirillum)、巴氏杆菌属(Pasteurella)、布鲁氏菌属(Brucella)、耶尔森氏菌 属(Yersinia)、弗朗西斯菌属(Francisella)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、博德特氏 菌属(Bordetella)、埃希杆菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺杆菌 属(Shigella)、克雷白杆菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、弧菌属(Vibrio)、假 单胞菌属(Pseudomonas)、拟杆菌属(Bacteroides)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、产气 杆菌属(Aerobacter)、农杆菌属(Agrobacterium)、固氮菌属(Azotobacter)、螺方宠状菌 属(Spirilla)、沙雷氏菌属(Serratia)、弧菌属(Vibrio)、根瘤菌属(Rhizobium)、衣原体属(Chlamydia)、立克次体属(Rickettsia)、密螺旋体属(Tr印onema)、和梭形杆菌属 (Fusobacterium)。“革兰氏阳性细菌”包括球菌、无孢菌(nonsporulating rods)和产孢菌 (sporulating rods)。革兰氏阳性细菌属包括，例如，放线菌属(Actinomyces)、杆菌 属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、丹毒丝菌 属(Erysipelothrix) > ff lif M (Lactobacillus)、李其Jf 特菌属(Listeria)、分枝杆菌 属(Mycobacterium)、粘球菌属(Myxococcus)、诺卡氏菌属(Nocardia)、葡萄球菌属 (Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)禾口链霉菌属(Streptomyces)。术语“重组微生物”和“重组宿主细胞”在本文中互换使用，并且指已经被遗传修 饰以表达或过度表达内源性核酸序列，或表达非内源性序列诸如包括在载体中的那些序列 的微生物。核酸序列通常编码如上所述的参与产生所需代谢物的代谢途径的靶酶。因此， 本文所述的重组微生物已经被遗传改造以表达或过度表达以前不被亲代微生物表达或过 度表达的靶酶。要理解，术语“重组微生物”和“重组宿主细胞”不仅指特定的重组微生物， 而且还指该微生物的子代或潜在的子代。“亲代微生物”指用来产生重组微生物的细胞。术语“亲代微生物”描述了天然存 在的细胞，即，没有被遗传修饰的“野生型”细胞。术语“亲代微生物”还描述已经被遗传修 饰但没有表达或过度表达靶酶——例如，参与产生所需代谢物诸如异丙醇的生物合成途径 的酶——的细胞。例如，野生型微生物可被遗传修饰以表达或过度表达第一靶酶诸如硫解 酶。此微生物可在被修饰以表达或过度表达第二靶酶的微生物的产生中用作亲代微生物。 依次地，被修饰以表达或过度表达例如硫解酶和第二酶的微生物可被修饰以表达或过度表 达第三靶酶等。因此，亲代微生物的作用是用作连续遗传修饰事件的参照细胞。各次修饰 事件可通过将核酸分子导入参照细胞中来实现。导入作用促进了靶酶的表达或过度表达。 要理解，术语“促进”包括通过亲代微生物中的例如启动子序列的遗传修饰来活化编码靶酶 的内源性核酸序列。要进一步理解，术语“促进”包括将编码靶酶的外源性核酸序列导入亲 代微生物中。在另一个实施方案中，提供了一种产生重组微生物的方法，该重组微生物将适当 的碳底物转变为异丙醇。该方法包括用编码多肽的一个或多个重组核酸序列转化微生物， 该多肽在碳源向终产物的转变中具有所需的酶功能。编码用于生成代谢物的酶——包括其 同源物、变体、片段、相关的融合蛋白或功能等效物——的核酸序列，被用在引导这类多肽 在合适的宿主细胞诸如细菌或酵母细胞中表达的重组核酸分子中。要理解，不改变核酸分 子的编码活性的序列的加入，诸如非功能或非编码序列的加入，是基础核酸的保守变异。酶 的“活性”是其催化产生代谢物的反应——即，发挥功能——的能力的量度，并且可表示为 反应的代谢物产生的速率。例如，酶活性可表示为每单位时间或每单位酶产生的代谢物的 量(例如，浓度或重量)，或以亲和力或解离常数计。本文中可互换使用的术语“蛋白质”或“多肽”，包括由称为肽键的化学键连接在一 起的称为氨基酸的化学构件的一条或多条链。“酶”是指全部或大部分由蛋白质组成的或多 或少特异性地催化或促进一个或多个化学或生物化学反应的任何物质。术语“酶”还可指 催化性多核苷酸(例如，RNA或DNA)。“天然”或“野生型”蛋白质、酶、多核苷酸、基因或细 胞是指天然存在的蛋白质、酶、多核苷酸、基因或细胞。
如果编码蛋白质的核酸序列具有与编码第二蛋白质的核酸序列相似的序列，则该 蛋白质与该第二蛋白质具有“同源性”或与其“同源”。可选地，如果两个蛋白质具有“相似 的”氨基酸序列，则一个蛋白质与第二蛋白质具有同源性。(因此，术语“同源蛋白”被定义 为指两个蛋白质具有相似的氨基酸序列)。如本文使用的，当氨基酸序列具有至少约60%、65%、70%、75%、80%、85%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%的同一性时，两个蛋白质(或所 述蛋白质的区)是基本上同源的。为了测定两条氨基酸序列或两条核酸序列的同一性百分 比，为了进行最优比较，将这些序列进行比对(例如，为了进行最优比对可在第一和第二氨 基酸或核酸序列的一个或两个中导入空位(gap)，并且为了进行比较可忽略非同源序列)。 在一个实施方案中，为了进行比较而比对的参考序列的长度为该参考序列的长度的至少 30 %，典型地至少40 %，更典型地至少50 %，甚至更典型地至少60 %，并且甚至更典型地至 少70 %、80 %、90 %、100 %。然后比较在相应的氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或 核苷酸。当第一序列中的一个位置被与第二序列中相应位置的氨基酸残基或核苷酸相同的 氨基酸残基或核苷酸占用时，则所述分子在该位置处是相同的(本文中使用的氨基酸或核 酸“同一性”与氨基酸或核酸“同源性”等价)。两条序列之间的同一性百分比是所述序列 共有的相同位置的数目的函数，同时考虑为了两条序列的最优比对而需要被导入的空位的 数目以及各空位的长度。当在提及蛋白质或肽时使用“同源的”时，要认识到不相同的残基位置经常由于保 守氨基酸置换而不同。“保守氨基酸置换”是一个氨基酸残基被具有含相似化学性质(例 如，电荷或疏水性)的侧链(R基团)的另一氨基酸残基置换。通常，保守氨基酸置换基本 上不改变蛋白质的功能特性。在两条或更多条氨基酸序列由于保守置换而彼此不同的情况 下，可向上调节序列同一性百分比或同源性程度以校正置换的保守性。用于进行此调节的 方式是本领域技术人员所熟知的(见，例如，Pearson等人，1994，在此以引用方式合并入本 文中)。下列的六组各自含有彼此保守置换的氨基酸1)丝氨酸(S)、苏氨酸(T) ；2)天门 冬氨酸(D)、谷氨酸(E) ；3)天门冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q) ；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K) ；5) 异亮氨酸⑴、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、丙氨酸㈧、缬氨酸(V)，以及6)苯丙氨酸(F)、酪氨 酸(Y)、色氨酸(W)0多肽的序列同源性，也称为序列同一性百分比，典型地使用序列分析软件来测 定° 见，例如，Genetics Computer Group (GCG), University of WisconsinBiotechnology Center (威斯康星大学生物技术中心)，910 University Avenue (910大学大街)， Madison(麦迪逊)，Wis.(威斯康星州)53705的序列分析软件包。蛋白质分析软件使用 指定为各种置换、缺失和其他修饰作用包括保守氨基酸置换的同源性量度来匹配相似的序 列。例如，GCG包含诸如“Gap”和“Bestfit”的程序，它们可使用缺省参数来测定密切相关 的多肽诸如来自不同种属的生物体的同源多肽之间或野生型蛋白质及其突变蛋白之间的 序列同源性或序列同一性。见，例如，GCG 6. 1版。当将抑制性分子序列与含有来自不同生物体的大量序列的数据库进行比较时，典 型的算法是计算机程序 BLAST (Altschul, 1990 ；Gish, 1993 ；Madden, 1996 ；Altschul, 1997 ； Zhang，1997)，特别是 blastp 或 tblastn(Altschul，1997)。用于 BLASTp 的典型参数为期
11望值10(缺省)；过滤seg(缺省)；空位开放罚分(Costto open a gap) :11(缺省)；空 位延伸罚分(Cost to extend a gap) :1(缺省)；最大比对100 (缺省)；字长11(缺省)； 描述编号100(缺省)；罚分矩阵(Penalty Matrix) :BL0WSUM62。当搜索含有来自大量不同生物体的序列的数据库时，典型地比较氨基酸序列。使 用氨基酸序列的数据库搜索可通过本领域已知的blastp以外的算法来测量。例如，多肽序 列可使用FASTA进行比较，FASTA是GCG 6. 1版中的一个程序。FASTA提供查询序列和搜索 序列之间的最佳重叠区的比对和序列同一性百分比(Pearson，1990，在此以引用方式合并 入本文中)。例如，氨基酸序列之间的序列同一性百分比可使用FASTA、采用其缺省参数(字 长为2，以及PAM250打分矩阵)来测定，FASTA在GCG 6. 1版中提供，该软件在此以引用方 式合并入本文中。要理解，上面所述的核酸序列包括“基因”，并且上述的核酸分子包括“载体”或“质 粒”。例如，编码酮硫解酶(keto thiolase)的核酸序列可由atoB基因或其同源物、或fadA 基因或其同源物编码。因此，术语“基因”，也称为“结构基因”指编码特定氨基酸序列的核 酸序列，包括编码一种或多种蛋白质或酶的全部或部分，并且可包括调控(非转录)DNA序 列，诸如启动子序列，其决定例如基因表达所处的条件。基因的转录区可包括非翻译区，包 括内含子，5'-非翻译区(UTR)和3' -UTR，以及编码序列。术语“核酸”或“重组核酸”指 多核苷酸诸如脱氧核糖核酸(DNA)，以及在适当时，指核糖核酸(RNA)。术语“表达”就基因 序列而言，指基因的转录，以及，在适当时，指得到的mRNA转录物翻译为蛋白质。因此，从上 下文将很清楚，蛋白的表达由开放阅读框序列的转录和翻译而产生。术语“操纵子”指从共同启动子、作为单个转录单位被转录的两个或多个基因。在 一些实施方案中，包括操纵子的基因是邻近基因。要理解，整个操纵子的转录可通过修饰 共同启动子而被修饰(即，增加、减少或去除)。可选地，操纵子中的任何基因或基因组合 可被修饰以改变编码多肽的功能或活性。修饰作用可导致编码多肽的活性增加。此外， 修饰作用可将新的活性赋予编码多肽。示例性的新活性包括利用替代底物(alternative substrate)和/或在更替的环境条件中发挥作用的能力。“载体”是核酸可在生物体、细胞或细胞组分之间传播和/或传递所借助的任何方 式。载体包括病毒、噬菌体、原病毒(pro-virus)、质粒、噬菌粒、转座子、和人工染色体诸如 YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)以及PLAC(植物人工染色体)等，其是“附 加体”，g卩，自主复制或可整合进宿主细胞的染色体中。载体还可以是裸RNA多核苷酸、裸 DNA多核苷酸、在同一条链内由DNA和RNA组成的多核苷酸、聚赖氨酸偶联的DNA或RNAJt 偶联的DNA或RNA、脂质体偶联的DNA等，或者本质上不是附加型的(印isomal)，或其可以 是包括上述多核苷酸构建体的一种或多种的生物体，诸如农杆菌或细菌。“转化”指载体导入至宿主细胞中的过程。转化(或转导，或转染)可通过许多方 式包括电穿孔、微注射、基因枪(或微弹轰击介导的递送)或农杆菌介导的转化中的任何一 种来实现。本领域技术人员将认识到，由于遗传密码的简并性，许多其核苷酸序列不同的DNA 化合物可用来编码本发明的指定氨基酸序列。编码上述生物合成酶的天然DNA序列在本文 中仅被引用来说明本发明的实施方案，并且本发明包括编码在本发明的方法中使用的酶的 多肽和蛋白质的氨基酸序列的任何序列的DNA化合物。以类似的方式，多肽可典型地容忍
12在其氨基酸序列中一个或多个氨基酸置换、缺失和插入，而不丧失或明显地丧失所需的活 性。本发明包括具有可选氨基酸序列的此类多肽，并且由本文中显示的DNA序列编码的氨 基酸序列仅说明本发明的实施方案。本发明提供编码一个或多个靶酶的核酸分子，其具有重组DNA表达载体或质粒形 式，如下面更详细的说明。通常，此类载体可在宿主微生物的胞质中复制或整合进宿主微生 物的染色体DNA中。在任一种情况下，载体可以是稳定载体(即，即使仅采用选择压力，载 体经多次细胞分裂后仍存在)或瞬时载体(即，随着细胞分裂次数的增加，载体逐渐地被宿 主微生物遗失)。本发明提供分离的(即，非纯的，但在制剂中以自然界中未发现的丰度和 /或浓度存在)和纯化的(即，基本上不含有污染物质或基本上不含有在自然界中与相应 DNA 一起存在的物质)形式的DNA分子。包括此类核酸的重组表达载体包括在本发明的范围内。术语表达载体指可被导入 至宿主微生物或无细胞转录和翻译系统中的核酸。表达载体可永久地或暂时地维持在微生 物中，或是作为染色体的一部分或是微生物中或任何的细胞区室中的其他DNA，诸如胞质中 的复制型载体。表达载体还包括驱动RNA表达的启动子，其典型地在微生物或细胞提取物 中被翻译成多肽。为了有效地从RNA翻译为蛋白质，表达载体还典型地含有位于要表达的 基因的编码序列的起始密码子上游的核糖体结合位点序列。其他元件，诸如增强子、分泌信 号序列、转录终止序列，以及含有载体的宿主微生物可通过其而被鉴定和/或选择的一种 或多种标志基因，也可存在于表达载体中。使用选择标记，即，赋予抗生素抗性或敏感性的 基因，并且当细胞在合适的选择性培养基中生长时赋予转化细胞以选择性表型。表达载体的各种成分可变化很大，取决于载体的使用目的以及载体预期在其中复 制或驱动表达的(多种)宿主细胞。适于在大肠杆菌、酵母、链霉菌和其他常用细胞中表达 基因和维持载体的表达载体成分是公知的并可从商业渠道获得。例如，用于包含在本发明 的表达载体中的合适启动子包括在真核或原核宿主微生物中发挥作用的那些启动子。启动 子可包括允许调控与宿主微生物的生长相关的表达的调控序列或响应于化学或物理刺激 使基因的表达开启或关闭的调控序列。对于大肠杆菌和某些其他的细菌宿主细胞，可使用 来源于生物合成酶、赋予抗生素抗性的酶和噬菌体蛋白的基因的启动子，包括，例如，半乳 糖启动子、乳糖(Iac)启动子、麦芽糖启动子、色氨酸(trp)启动子、β-内酰胺酶(bla)启 动子、λ噬菌体PL启动子和Τ5启动子。另外，还可使用合成启动子，诸如tac启动子(美 国专利号4，551，433)。对于大肠杆菌表达载体，包含大肠杆菌复制起点是有用的，诸如来自 pUC.plP.pl 禾口 pBRo因此，重组表达载体含有至少一种表达系统，依次地，该表达系统由可操作地与启 动子连接的至少一部分PKS和/或其他生物合成基因编码序列以及任选的可在相容的宿主 细胞中操作以实现该编码序列的表达的终止序列组成。宿主细胞通过用本发明的重组DNA 表达载体转化而被修饰以包含表达系统序列作为染色体外元件或整合进染色体中。如前所述，术语“宿主细胞”与术语“重组微生物”可互换使用，并且包括适于产生 异丙醇并易于用核酸构建物诸如载体或质粒转化的任何细胞类型。如本领域技术人员所理解的，修饰编码序列以增强其在特定宿主中的表达会是有 利的。遗传密码冗余，具有64种可能的密码子，但大多数生物体典型地使用这些密码子的 子集。在物种中最常利用的密码子称为最优密码子，并且那些不十分经常利用的密码子被归为稀有密码子或低利用率密码子(low-usagecodon)。密码子可被置换以反映宿主的优选 密码子使用，该过程有时称为“密码子优化”或“控制物种密码子偏好性”。可制备含有特定原核或真核宿主优选的密码子的优化编码序列(还参见，Murray 等人，(1989) Nucl. Acids Res. 17 :477_508)，例如，以增加翻译速率或产生具有所需特性的 重组RNA转录物，如与由非优化序列产生的转录物相比较长的半衰期。翻译终止密码子也 可被修饰以反映宿主偏好性。例如，酿酒酵母(S. cerevisiae)和哺乳动物的典型终止密码 子分别为UAA和UGA0对于单子叶植物典型的终止密码子为UGA，而昆虫和大肠杆菌常常使 用UAA作为终止密码子(Dalphin等人，(1996) Nucl. Acids Res. 24 :216_218)。用于优化在 植物中表达的核苷酸序列的方法学在例如，美国专利号6，015，891和本文中引用的参考文 献中提供。本发明的核酸可使用cDNA、mRNA或可选地，基因组DNA作为模板和合适的寡核苷 酸引物根据标准的PCR扩增技术和下面实施例部分中所述的那些步骤来扩增。如此扩增的 核酸可被克隆进合适的载体中，并且通过DNA序列分析来表征。此外，可通过标准的合成技 术，例如，使用自动DNA合成仪来制备对应于核苷酸序列的寡核苷酸。还要理解，编码与本文所述的酶同源的多肽的分离的核酸分子可通过将一个或多 个核苷酸置换、添加、或缺失引入编码特定多肽的核苷酸序列中而生成，使得一个或多个氨 基酸置换、添加或缺失被引入编码蛋白中。突变可通过标准技术——诸如位点定向诱变和 PCR介导的诱变——而被引入核酸序列中。与那些其中可能需要进行非保守氨基酸置换 (见上)的位置相反，在一些位置中优选进行保守氨基酸置换。“保守氨基酸置换”是这样 的置换，其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基置换。具有相似侧链的氨基酸残基 的家族在本领域中已经被确定。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨 酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链 的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非 极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、 色氨酸)、具有β-支化侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧 链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。在另一实施方案中，提供了产生异丙醇的方法。该方法包括在适当底物的存在下 并在适合于底物转变为异丙醇的条件下培养如本文中所提供的重组微生物。由本文中提供 的微生物所产生的醇可通过本领域技术人员所知的任何方法来检测。此类方法包括质谱测 定法。适合于生长和维持本文中提供的重组微生物的培养条件描述在下面的实施例中。普 通技术人员将认识到这些条件可被修改以适应各种微生物的要求。如前面所讨论的，描述本文中使用的分子生物学技术，包括载体、启动子的应用 和许多其他相关主题的普通教材包括Berger和Kimmel，Guide toMolecular Cloning Techniques (分子克隆技术指南)，Methods in Enzymology 152 卷，(Academic Press, Inc.，San Diego, Calif.) ( " Berger " ) ；Sambrook 等 人’ MolecularCloning__A Laboratory Manual (分子克隆-实验室手册)，第 二版，1-3 卷，ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. ,1989( " Sambrook ")禾口 CurrentProtocols in Molecular Biology (现代分子生物学实验指南)，F. M. Ausubel等人主编，Current Protocols (实验室指南)，a joint venture between Greene PublishingAssociates,
14Inc. and John Wiley & Sons, Inc. , (1999 年增刊)(〃 Ausubel “)。足以引导技术人 员进行体外扩增方法的实验方法的实例，包括聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应 (LCR)、Q β -复制酶扩增和其他RNA聚合酶介导的技术(例如，NASBA)，例如，用于产生本发 明的同源核酸的实验方法，参见Berger，Sambrook和Ausubel，以及Mullis等人，(1987) 美国专利号 4,683,202 ;Innis 等人，主编(1990)PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications (PCR 实验方法方法和应用指南)(Academic Press Inc. San Diego, Calif. )(〃 Innis" ) ；Arnheim & Levinson(Oct. 1，1990)C&EN 36-47 ;The Journal OfNIH Research (1991) 3 :81_94 ；Kwoh 等人，(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 1173 ；Guatelli 等人，(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :1874 ;Lomell 等人，(1989) J. Clin. Chem 35: 1826 ;Landegren 等人，(1988) Science 241 1077-1080 ；Van Brunt (1990) Biotechnology 8 :291-294 ;Wu 和 Wallace (1989) Gene 4 :560 ;Barringer 等人，(1990) Gene 89:117;以及 Sooknanan和Malek(1995)Biotechnology 13 :563_564。用于克隆体外扩增的核酸的改良 方法描述在Wallace等人，美国专利号5，426，039中。用于通过PCR扩增大核酸的改良方 法概述在Cheng等人，(1994)Nature 369 :684_685和其中引用的参考文献中，其中产生至 多40kb的PCR扩增子。技术人员将理解，基本上任何的RNA都可被转变为适合于限制性消 化、使用逆转录酶和聚合酶的PCR扩充和测序的双链DNA。见，例如，Ausubel、Sambrook和 Berger,均见前。因此，本发明提供了重组微生物，其产生异丙醇并包括与亲代微生物相比，靶酶诸 如乙酰辅酶A乙酰基转移酶(例如，atoB)、乙酰乙酰辅酶A硫解酶(例如，thl)、乙酰乙酰 辅酶A转移酶(例如，atoAD)、辅酶A转移酶(例如，ctfAB)、乙酰乙酸脱羧酶(例如，adc) 和仲醇脱氢酶(例如，sadh)或其任何组合的表达或升高表达。另外，与亲代微生物相比， 所述微生物可包括破坏、缺失或敲除偏好使用乙酰辅酶A作为底物的醇/乙醛脱氢酶(例 如，adhE基因)的表达。其他的破坏、缺失或敲除可包括编码选自由下列组成的组的多肽 或蛋白质的一种或多种基因(i)催化NADH依赖性的丙酮酸向D-乳酸的转变的酶；(ii) 促进催化延胡索酸和琥珀酸相互转变的酶；(iii)氧转录调节物(oxygen transcription regulator) ； (iv)催化乙酰辅酶A转变为乙酰磷酸的酶；以及(ν)催化丙酮酸转变为乙酰 辅酶A和甲酸的酶。在一个方面，微生物包括醇/乙醛脱氢酶和上面(i)-(iv)中的一种或 多种、但没有(ν)的组合的破坏、缺失或敲除。如图1中所示，乙酰乙酰辅酶A可由被代谢改造以表达或过度表达硫解酶或乙酰 辅酶A乙酰基转移酶的重组微生物产生。因此，本文提供的重组微生物包括至少一种靶酶如酮硫解酶的表达升高。在其他 的方面，重组微生物可表达参与从适当碳底物的发酵产生异丙醇的途径中的多种靶酶。多 种靶酶可包括酮硫解酶、乙酰辅酶A乙酰基转移酶、乙酰乙酰辅酶A转移酶、辅酶A转移酶、 乙酰乙酸脱羧酶和仲醇脱氢酶或其任何组合。如前所述，在本发明中描述的靶酶通常产生代谢物。例如，酮硫解酶从包括乙酰辅 酶A的底物产生乙酰乙酰辅酶A。另外，本发明中描述的靶酶由多核苷酸编码。例如，酮硫 解酶可由atoB基因、多核苷酸或其同源物，或fadA基因、多核苷酸或其同源物编码。atoB 基因或fadA基因可来自提供编码适当的酶的适当的核酸序列的任何生物来源。例如，atoB 基因或fadA基因可来自大肠杆菌或丙酮丁醇梭菌。
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在另一个方面，本文中提供的重组微生物包括与亲代微生物相比，乙酰辅酶A乙 酰基转移酶表达升高。该微生物从包括乙酰辅酶A的底物产生包括乙酰乙酰辅酶A的代谢 物。乙酰辅酶A乙酰基转移酶可由thlA基因、多核苷酸或其同源物编码。thlA基因或多核 苷酸可来自梭菌属。在另一个方面，本文中提供的重组微生物包括与亲代微生物相比，乙酰乙酰辅酶A 转移酶表达升高。该微生物从包括乙酰乙酰辅酶A的底物产生包括乙酰乙酸的代谢物。乙 酰乙酰辅酶A转移酶可由atoAD基因、多核苷酸或其同源物编码。atoAD可来自大肠杆菌。在另一个实施方案中，本文中提供的重组微生物包括与亲代微生物相比，辅酶A 转移酶表达升高。该微生物从包括乙酰乙酰辅酶A的底物产生包括乙酰乙酸的代谢物。辅 酶A转移酶可由ctfAB基因、多核苷酸或其同源物编码。ctfAB可来自梭菌。在另一个实施方案中，本文中提供的重组微生物包括与亲代微生物相比，乙酰乙 酸脱羧酶表达升高。该微生物从包括乙酰乙酸的底物产生包括丙酮的代谢物。乙酰乙酸脱 羧酶可由adc基因、多核苷酸或其同源物编码。乙酰乙酸脱羧酶可来自梭菌。在另一个实施方案中，本文中提供的重组微生物包括与亲代微生物相比，仲 醇脱氢酶表达升高。该微生物从包括丙酮的底物产生包括异丙醇的代谢物。仲醇脱 氢酶可由sadh基因、多核苷酸或其同源物编码。仲醇脱氢酶可来自梭菌或热厌氧菌 (Thermoanaerobium)0本发明鉴定了可用于本发明的方法、组合物和生物体中的特定基因；然而，要认识 到，没有必要与这些基因具有绝对的同一性。例如，在包括编码多肽或酶的序列的特定基因 或多核苷酸中可进行变化并筛选活性。典型地这些变化包括保守突变和沉默突变(silent mutation)。这些修饰的或突变的多核苷酸和多肽可使用本领域已知的方法筛选功能酶活 性的表达。下表和本发明提供了具有本领域技术人员可获得的多核苷酸和多肽序列的基因 和各基因的同源物的非限制性实例。
酶示例性的基因异丙醇示例性的微生物乙酰辅酶A乙酰基 转移酶atoB+大肠杆菌，丙酮丁 醇梭菌乙酰乙酰辅酶A硫 解酶thl，thlA，thlB+大肠杆菌，丙酮丁 醇梭菌辅酶A转移酶ctf，ctfA, ctfB+丙酮丁醇梭菌乙酰乙酰辅酶A转 移酶ato，atoA，atoD+大肠杆菌乙酰乙酸脱羧酶adc+丙酮丁醇梭菌
16 包括丙酮丁醇梭菌thl (乙酰辅酶A乙酰基转移酶)、大肠杆菌atoAD (乙酰乙酰辅 酶A转移酶)、丙酮丁醇梭菌adc (乙酰乙酸脱羧酶)和拜氏梭菌adh (仲醇脱氢酶)的组合 的过度表达的大肠杆菌的示例性收率数据为，在摇瓶中产生81. 6mM异丙醇，在生产阶段中 的收率为 43. 5% (mol/mol)。本发明公开了一种重组微生物，包括提供高于野生型微生物的收率的生物合成途 径。在一个实施方案中，亲代微生物不产生异丙醇。例如，野生型大肠杆菌不产生可示踪量 的异丙醇。还在另一个实施方案中，亲代微生物仅产生痕量的异丙醇。在具体的实施方案 中，微生物是大肠杆菌。在另一个方面，培养物包括基本上同源(例如，约70-100%同源) 的微生物群。在另一个方面，培养物可包括各自具有不同的生物合成途径的微生物的组合， 上述生物合成途径产生可被在异丙醇的生产中培养的至少一种其它微生物所利用的代谢 物。本发明提供了在产生本文中所述的重组微生物中有用的各种基因、同源物和变 体的登录号。要理解的是，本文中所述的同源物和变体是示例性的和非限制性的。本领 域技术人员可使用各种数据库获得其他的同源物、变体和序列，包括，例如，美国国家生物 ^ Η^Φ^ (National Center for Biotechnologylnformation) (NCBI), ^ihKJjiW (World-Wide-Web)上访问。乙醇脱氢酶(也称为醛_醇脱氢酶)在大肠杆菌中由adhE编码。adhE包括三 种活性醇脱氢酶(ADH)；乙醛/乙酰辅酶A脱氢酶(ACDH)；丙酮酸-甲酸裂解酶失活酶 (PFL失活酶)；PFL失活酶活性在铁、NAD和辅酶A依赖性反应中催化丙酮酸-甲酸裂解 酶催化剂的淬灭。同源物在本领域中是已知的(见，例如，醛-醇脱氢酶(Polytomella sp. Pringsheim 198. 80) gi | 40644910 | emb | CAD42653. 2 | (40644910)；酸-醇脱氢酶(A 型 肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum A str. )ATCC 3502) gi 1148378348 | ref | YP_ 001252889. 1 (148378348)；醛-醇脱氢酶(鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis) C092) gi
16122410 I ref I NP_405723. 1 (16122410)；醛-醇脱氢酶(假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis) IP 32953) gi | 51596429 | ref | YP_070620. 11 (51596429)；酸-醇脱氢 酶(鼠疫耶尔森氏菌 C092)gi|ll5347889|emb|CAL20810. 1 (115347889)；醛-醇脱氢酶 (假结核耶尔森氏菌 IP 32953) gi I 515897111 emb | CAH21341. 1 (51589711)；醛-醇脱氢酶 (大肠杆菌 CFT073) gi I 26107972 | gb | AAN80172. 11 AE016760_31 (26107972)；酸-醇脱氢酶 (田鼠型鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis biovar Microtus str.) 91001) gi | 45441777 ref |NP_993316. 1 (45441777)；醛-醇脱氢酶(鼠型鼠疫耶尔森氏菌 91001) gi | 45436639 gb|AAS62193. 1 (45436639)；醛-醇脱氢酶(产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens) ATCC 13124) gi 1110798574 I ref I ΥΡ_697219· 11 (110798574)；酸-醇脱氢酶(奥奈达希瓦 氏菌(Shewanella oneidensis)MR-l) gi | 24373696 | ref | NP_717739. 1 (24373696)；酸-醇 脱氢酶(A 型肉毒梭状芽孢杆菌 ATCC 19397) gi 1153932445 I ref I YP_001382747. 1 (153932 445)；醛-醇脱氢酶(古典型鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis biovar Antiqua str.) E1979001)gi 1165991833 |gb IEDR44134. 1 (165991833)；酸-醇脱氢酶(Α 型肉毒梭状芽孢杆菌 Hall ^ ) gi 1153937530 | ref | YP_001386298. 1 (153937530)；酸-醇脱氢酶(产气荚 膜梭菌 ATCC 13124) gi 1110673221 |gb IABG82208. 1 (110673221)；醛-醇脱氢酶(A 型肉毒 梭状芽孢杆菌 Hall 株)gi 1152933444 |gb| ABS38943. 1 (152933444)；醛-醇脱氢酶(东 方型鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis biovar Orientalis str.)F1991016) gi 1165920 640|gb|EDR37888. 1 (165920640)；醛-醇脱氢酶(东方型鼠疫耶尔森氏菌IP275)gi|l65 913933 |gb IEDR32551. 11 (165913933)；醛-醇脱氢酶(安哥拉鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis Angola) )gi 1162419116 | ref | YP_001606617. 11 (162419116)；酸-醇脱氢酶(肉毒 梭状芽孢杆菌 F 型 Langeland 株(Clostridium botulinum F str. Langeland)) gi 115394 0830|ref |YP_001389712. 1 (153940830)；酸-醇脱氢酶(大肠杆菌 HS 株)gi 1157160746 ref |YP_001458064. 1 (157160746)；酸-醇脱氢酶(大肠杆菌 EM377A) gi | I57I55679 | r ef IYP_001462491. 11 (157155679)；醛-醇脱氢酶(小肠结肠炎耶尔森氏菌小肠结肠炎亚 种(Yersinia enterocolitica subsp. Enterocolitica)8081)gi1123442494|ref|YP_001 006472. 11 (123442494)；醛-醇脱氢酶(聚球蓝细菌属(Synechococcus sp.) JA_3_3Ab) gi|8660519l|ref |YP_473954. 1 (86605191)；醛-醇脱氢酶(单核细胞增生性李斯特菌 (Listeria monocytogenes str.)4b F2365)gi|46907864|ref|YP_014253. 11(46907864)； 酸-醇脱氢酶(粪肠球菌(Enterococcusfaecalis) V583)gi I 29375484 I ref I NP_814638. 1 (29375484)；酸-醇脱氢酶(无乳链球菌(Streptococcus agalactiae) 2603V/R) gi | 2253 6238 I ref I NP_687089. 1 (22536238)；醛-醇脱氢酶(A 型肉毒梭状芽孢杆菌 ATCC 19397) gi 1152928489 |gb IABS33989. 11 (152928489)；酸-醇脱氢酶(大肠杆菌 E24377A) gi 1157 077709 |gb IABV17417. 11 (157077709)；酸-醇脱氢酶(大肠杆菌 HS 株)gi 1157066426 |g b|ABV05681. 1 (157066426)；醛-醇脱氢酶(肉毒梭状芽孢杆菌F型Langeland株)gi 152936726 |gb IABS42224. 1 (152936726)；醛-醇脱氢酶(鼠疫耶尔森氏菌 CA88-4125) g i 1149292312 |gb IEDM42386. 11 (149292312)；醛-醇脱氢酶(小肠结肠炎耶尔森氏菌小肠 结肠炎亚种 8081) gi 1122089455 |emb I CAL12303. 1 (122089455)；醛-醇脱氢酶(莱菌衣 藻(Chlamydomonas reinhardtii)) gi | 92084840 | emb | CAF04128. 11 (92084840)；酸-醇脱 氢酶(聚球蓝细菌属 JA-3-3Ab)gi I 86553733 |gb IABC98691. 1 (86553733)；醛-醇脱氢 酶(奥奈达希瓦氏菌 MR-l)gi I 24348056 |gb| AAN55183. 11 AE015655_9 (24348056)；醛-醇 脱氢酶(粪肠球菌 V583)gi I 29342944 |gb| AA080708. 1 (29342944)；醛-醇脱氢酶(单核 细胞增生性李斯特菌 4b F2365)gi I 46881133 |gb IAAT04430. 1 (46881133)；醛-醇脱氢酶 (单核细胞增生性李斯特菌 l/2a F6854) gi | 47097587 | ref | ZP_00235115. 1 (47097587)； 醛-醇脱氢酶(单核细胞增生性李斯特菌4b H7858) gi I 47094265 | ref | ΖΡ_00231973· 11 (4 7094265)；醛-醇脱氢酶(单核细胞增生性李斯特菌4b H7858) gi | 47017355 | gb | EAL08180 11 (47017355)；醛-醇脱氢酶(单核细胞增生性李斯特菌l/2a F6854) gi | 47014034 | gb EAL05039. 1 (47014034)；酸-醇脱氢酶(无乳链球菌 2603V/R) gi | 22533058 | gb | AAM9896 1. 11 AE014194_6 (22533058)ρ ；醛-醇脱氢酶(古典型鼠疫耶尔森氏菌E1979001) gi 11660 09278|ref |ZP_02230176. 1 (166009278)；醛-醇脱氢酶(东方型鼠疫耶尔森氏菌IP275) gi 1165938272 | ref | ZP_02226831. 1 (165938272)；醛-醇脱氢酶(东方型鼠疫耶尔森氏菌 F1991016)gi 1165927374 | ref | ZP_02223206. 11 (165927374)；酸-醇脱氢酶(安哥拉鼠疫 耶尔森氏菌)gi 1162351931 |gb| ABX85879. 11 (162351931)；醛-醇脱氢酶(假结核耶尔森
18氏菌 IP 31758) gi 1153949366 |ref I YP_001400938. 1 (153949366)；酸-醇脱氢酶(假结核 耶尔森氏菌 IP 31758) gi 1152960861 |gb IABS48322. 11 (152960861)；醛-醇脱氢酶(鼠疫 耶尔森氏菌 CA88_4125) gi 1149365899 | ref | ZP_01887934. 11 (149365899)；乙酸脱氢酶(乙 酰化)(大肠杆菌 CFT073) gi I 26247570 | ref | NP_753610. 11 (26247570)；醛-醇脱氢酶(包 括醇脱氢酶；乙醛脱氢酶(乙酰化)(EC 1. 2. 1. 10) (acdh)；丙酮酸-甲酸-裂解酶失活酶 (pfl 失活酶))(A 型肉毒梭状芽孢杆菌 ATCC 3502) gi 1148287832 |emb I CAL81898. 1 (1482 87832)；醛-醇脱氢酶(包括醇脱氢酶(ADH)；乙醛脱氢酶(乙酰化)(ACDH)；丙酮酸-甲 酸-裂解酶失活酶(PFL 失活酶))gi I 71152980 |sp |P0A9Q7. 2 |ADHE_EC0LI (71152980)； 醛_醇脱氢酶(包括醇脱氢酶和乙醛脱氢酶，以及丙酮酸_甲酸-裂解酶失活酶(胡萝 卜软腐欧文氏黑腐亚种(Erwinia carotovora subsp. Atros印tica) SCRI1043) gi | 501212 54|ref|YP_050421. 1| (50121254)；醛-醇脱氢酶(包括醇脱氢酶和乙醛脱氢酶，以及丙 酮酸-甲酸-裂解酶失活酶(胡萝卜软腐欧文氏黑腐亚种SCRI1043)gi I 49611780 Iemb CAG75229. 11 (49611780)；醛-醇脱氢酶(包括醇脱氢酶(ADH)；乙醛脱氢酶(乙酰化) (ACDH)) gi 119858620 | sp | P33744. 3 | ADHE_CL0AB (19858620)；酸-醇脱氢酶(包括醇脱 氢酶(ADH)；乙醛脱氢酶(乙酰化)(ACDH)；丙酮酸-甲酸-裂解酶失活酶(PFL失活酶)) gi I 71152683 | sp |P0A9Q8. 2 | ADHE_EC057 (71152683)；醛-醇脱氢酶(包括醇脱氢酶；乙醛 脱氢酶(乙酰化)；丙酮酸-甲酸-裂解酶失活酶(艰难梭菌630) gi 1126697906 I ref I YP_ 001086803. 11 (126697906)；醛-醇脱氢酶(包括醇脱氢酶；乙醛脱氢酶(乙酰化)；丙酮 酸-甲酸-裂解酶失活酶(艰难梭菌 630) gi 1115249343 |emb I CAJ67156. 1 (115249343)； 醛-醇脱氢酶(包括醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(乙酰化)(ACDH)；丙酮酸-甲酸-裂 解酶失活酶(PFL失活酶))(发光光杆状菌Laumondii亚种(Photorhabdusluminescens subsp. Laumondii) TT01) gi | 37526388 | ref | NP_929732. 11 (37526388)；醛-醇脱氢酶 2 (包 括醇脱氢酶；乙醛脱氢酶)(酿脓链球菌Manfredo株(Sti^ptococcus pyogenes str. Manfredo)) gi 1134271169 | emb | CAM29381. 1 (134271169)；酸-醇脱氢酶(包括醇脱氢酶 (ADH)和乙醛脱氢酶(乙酰化)(ACDH)；丙酮酸-甲酸-裂解酶失活酶(PFL失活酶))(发光 光杆状菌 Laumondii 亚种 TT01) gi | 36785819 | emb | CAE14870. 11 (36785819)；醛-醇脱氢酶 (包括醇脱氢酶和丙酮酸_甲酸-裂解酶失活酶(艰难梭菌630) gi 1126700586 | ref | ΥΡ_0 01089483. 11 (126700586)；醛-醇脱氢酶(包括醇脱氢酶和丙酮酸-甲酸-裂解酶失活酶 (艰难梭菌 630) gi 1115252023 I emb I CAJ69859. 11 (115252023)；醛-醇脱氢酶 2 (酿脓链球 菌 Manfredo 株)gi I 139472923 I ref I YP_001127638. 1 (139472923)；酸-醇脱氢酶 E (产气 荚膜梭菌13型)gi 118311513 | ref | ΝΡ_563447· 11 (18311513)；醛-醇脱氢酶E (产气荚膜梭 菌 13 型)gi 118146197 | dbj | BAB82237. 11 (18146197)；醛-醇脱氢酶，ADHEl (丙酮丁醇梭菌 ATCC 824) gi 115004739 | ref | NP_149199. 1 (15004739)；酸-醇脱氢酶，ADHEl (丙酮丁醇梭 菌 ATCC 824) gi 114994351 |gb| AAK76781. 11 AE001438_34 (14994351)；醛-醇脱氢酶 2(包 括醇脱氢酶(ADH)；乙醛 / 乙酰辅酶 A 脱氢酶(ACDH))gi|2492737|sp|Q24803. 1|ADH2_ ENTHI (2492737)；醇脱氢酶(肠炎沙门氏菌肠炎血清型Typhi株(Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhistr.)CT18)gi116760134|ref|NP_455751. 11(16760134)； 以及醇脱氢酶(肠炎沙门氏菌肠炎血清型Typhi株)gi 116502428 | emb | CAD08384. 11 (1650 2428))，与登录号相关的各序列整体地以引用方式合并入本文中。
乙酰乙酰辅酶A硫解酶(有时也称为乙酰辅酶A乙酰基转移酶)催化从两分子的 乙酰辅酶A产生乙酰乙酰辅酶A。取决于使用的生物体，异源的乙酰乙酰辅酶A硫解酶(乙 酰辅酶A乙酰基转移酶)可被改造用于在所述生物体中表达。可选地，可过度表达天然乙 酰乙酰辅酶A硫解酶(乙酰辅酶A乙酰基转移酶)。乙酰乙酰辅酶A硫解酶在大肠杆菌中 由thl编码。乙酰辅酶A乙酰基转移酶在丙酮丁醇梭菌中由atoB编码。THL和AtoB同源 物和变体是已知的。例如，这些同源物和变体包括，例如，乙酰辅酶A乙酰基转移酶(硫解 酶)(天蓝色链霉菌(Sti^ptomyces coelicolor) A3 (2)) gi | 21224359 | ref | NP_630138. 1 ( 21224359)；乙酰辅酶A乙酰基转移酶(硫解酶)(天蓝色链霉菌A3 (2)) gi | 31690411 emb CAA19239. 1 (3169041)；乙酰辅酶A乙酰基转移酶(硫解酶)(泊库岛食烷菌(Alcanivorax borkumensis)SK2)gi 1110834428 | ref | YP_693287. 1 (110834428)；乙酰辅酶 A 乙酰基转移 酶(硫解酶)(泊库岛食烷菌 SK2) gi I IlOM7539 I emb I CALl7Ol5. 11 (110647539)；乙酰辅酶 A乙酰基转移酶(硫解酶)(红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)NRRL 2338) gi 1133915420 | emb | CAM05533. 11 (133915420)；乙酰辅酶A乙酰基转移酶(硫解酶)(红色 糖多孢菌 NRRL 2338) gi 1134098403 I ref I YP_001104064. 1 (134098403)；乙酰辅酶 A 乙酰 基转移酶(硫解酶)(红色糖多孢菌 NRRL 2338) gi 1133911026 I emb I CAMOl 139. 1 (133911 026)；乙酰辅酶A乙酰基转移酶(硫解酶)(A型肉毒梭状芽孢杆菌ATCC 3502) gi 1148290 632 I emb | CAL84761. 11 (148290632)；乙酰辅酶A乙酰基转移酶(硫解酶)(铜绿假单孢菌 (Pseudomonas aeruginosa)UCBPP-PA14)gi1115586808|gb|ABJ12823. 11(115586808)；乙 酰辅酶A乙酰基转移酶(硫解酶)(抗重金属罗尔斯通氏菌(Ralstonia metallidurans) CH34) gi I 93358270 | gb | ABF12358. 11 (93358270)；乙酰辅酶 A 乙酰基转移酶(硫解酶)(抗 重金属罗尔斯通氏菌CH34)gi I 93357190 |gb| ABF11278. 1 (93357190)；乙酰辅酶A乙酰 基转移酶(硫解酶)(抗重金属罗尔斯通氏菌0134化丨|93356587^13|48 10675.1| (9335 6587)；乙酰辅酶A乙酰基转移酶(硫解酶)(富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha) JMP134) gi I 72121949 |gb IAAZ64135. 1 (72121949)；乙酰辅酶 A 乙酰基转移酶(硫解酶) (富养罗尔斯通氏菌 JMP134) gi I 72121729 | gb | AAZ63915. 11 (72121729)；乙酰辅酶 A 乙酰基 转移酶(硫解酶)(富养罗尔斯通氏菌 JMP134)gi I 72121320 |gb| AAZ63506. 1 (72121320)； 乙酰辅酶A乙酰基转移酶(硫解酶)(富养罗尔斯通氏菌JMP134) gi I 721210011 gb | AAZ631 87. 11 (72121001)；乙酰辅酶A乙酰基转移酶(硫解酶)(大肠杆菌)gi | 2764832 | emb | CAA6 6099. 11 (2764832)，与登录号相关的各序列整体地以引用方式合并入本文中。辅酶A转移酶催化从乙酰乙酰辅酶A产生乙酰乙酸。取决于使用的生物体，异源的 辅酶A转移酶可被改造用于在所述生物体中表达。可选地，可过度表达天然的辅酶A转移 酶。辅酶A转移酶在丙酮丁醇梭菌中由ctfAB编码，并且ctfAB同源物和变体是已知的。例 如，此类同源物和变体包括，例如，辅酶A转移酶(丙酮丁醇梭菌adhE、ctfA和CtfB基因) gi I 298080 I emb | X72831. 11 (298080)；丙酮丁醇梭菌 ATCC 824 巨大质粒 pSOLlgi 114994317
gb IAE001438. 3 | (14994317)，与登录号相关的各序列整体地以引用方式合并入本文中。乙酰乙酰辅酶A转移酶催化从乙酰乙酰辅酶A产生乙酰乙酸。取决于使用的生 物体，异源的乙酰乙酰辅酶A转移酶可被改造用于在所述生物体中表达。可选地，可过度 表达天然的乙酰乙酰辅酶A转移酶。乙酰乙酰辅酶A转移酶在大肠杆菌中由atoAB编码。 atoAB同源物和变体是已知的。例如，此类同源物和变体包括(或可见于下列的基因组序
20列中)，例如，NC_010468 大肠杆菌 ATCC8739，gi 11700180611 ref | NC_010468. 1 (17001806 1) ；NC_009654海洋单胞菌属(Marinomonas sp.) MWYLl gi 1152994043 | ref | NC_009654. 11 ( 152994043) ；NC_009454 ；Pelotomaculum thermopropionicum Si，完整基因组gi 114767633 5 I ref I NC_009454. 1 (147676335)；大肠杆菌APEC 01，完整基因组 gi 1117622295 | ref | NC_0 08563. 11 (117622295)；大肠杆菌 536，完整基因组 gi 1110640213 | ref | NC_008253. 11 (1106 40213)；大肠杆菌 UTI89，完整基因组 gi|91209055|ref |NC_007946. 1 (91209055)；大肠杆 菌 HS，完整基因组 gi 1157159467|ref |NC_009800. 1 (157159467)；拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)NCIMB 8052，完整基因组 gi 1150014892 | ref | NC_009617. 1 (150014892)； 索氏志贺氏菌(Shigella sonnei) Ss046，完整基因组 gi | 74310614 | ref | NC_007384. 1 (74 310614)克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)ATCC BAA-895，完整基因组 gi 1157144296 ref |NC_009792. l| (157144296)；深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)ATCC 11170，完整 基因组 gi I 83591340 | ref | NC_007643. 11 (83591340)；大肠杆菌 CFT073，完整基因组 gi | 262 45917|ref |NC_004431. 1 (26245917)；鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium) LT2，完 整基因组8丨|16763390|仪。^_003197. 1 (16763390)；大肠杆菌ATCC 8739，完整基因组g i 1169752989 | gb | CP000946. 11 (169752989)；大肠杆菌 K-12 株 MG1655 亚株(Escherichia coli 8廿.1(-1281^8廿.]\^1655)，完整基因组81|49175990|仪€|_000913.2| (49175990)； 大肠杆菌 K-12 株 MG1655 亚株，完整基因组 gi | 48994873 | gb | U00096. 2 | (48994873)；海洋 单胞菌 MWYL1，完整基因组 gi 1150834967 |gb| CP000749. 1 (150834967)；拜氏梭菌 NCIMB 8052，完整基因组gi 1149901357 | gb | CP000721. 11 (149901357)；与登录号相关的各序列整 体地以引用方式合并入本文中。乙酰乙酸脱羧酶催化乙酰乙酸脱羧形成丙酮和二氧化碳。取决于使用的生物体， 异源的乙酰乙酸脱羧酶可被改造用于在所述生物体中表达。可选地，可过度表达天然的乙 酰乙酸脱羧酶。乙酰乙酸脱羧酶在丙酮丁醇梭菌中由acd编码，并且ACD同源物和变体是已 知的。acd 的序列见 gi 115004705|ref |NC_001988. 2| (15004705)丙酮丁醇梭菌 ATCC 824 质粒PS0L1 ；与登录号相关的各序列整体地以引用方式合并入本文中。仲醇脱氢酶在NADH的存在下催化甲基酮还原为其相应的2_醇。取决于使用的生 物体，异源的仲醇脱氢酶可被改造用于在所述生物体中表达。可选地，可过度表达天然的仲 醇脱氢酶。可用于本发明的方法和组合物中的仲醇脱氢酶在丙酮丁醇梭菌或大肠杆菌中由 adh(sadh)编码。SADH同源物和变体是已知的。例如，赤红球菌(Rhodococcus rubber), sadh基因和sudh基因见登录号gi I 21615551 |emb IAJ491307. 1 (21615551)；似平滑念珠菌 (Candida metapsilosis)仲醇脱氢酶部分 sadh 基因，96144 株 gi | 47826366 | emb | AJ69811 5. 1 (47826366)；和近平滑念珠菌(Candida parapsilosis) SADH 基因，完整 cdsgi | 281540 8|dbj|AB010636. 1| (2815408)；与登录号相关的各序列整体地以引用方式合并入本文中。适合于本文中提供的重组微生物的生长和维持的培养条件描述在下面的实施例 中。普通技术人员将认识到，这些条件可被修改以适应各种微生物的要求。在生产异丙醇 产物中有用的合适的培养条件包括培养基PH、离子强度、营养含量等条件；温度；氧/CO2/ 氮含量；湿度；以及允许由宿主微生物——即通过微生物的代谢作用——产生化合物的其 他培养条件。对于可用作宿主细胞的微生物，合适的培养条件是公知的。在一个实施方案中，本发明的微生物可以表征为包括rrnBT14DlacZWJ16hsdR514DaraBADAH33 DrhaBADLD78 (从 XL-1 blue 转导 F ‘以提供 laclq)、(atoB-ctfAB-adc)、 pTA30 (atoB-atoAD-adc)、pTA39 (thl-atoAD-adc)禾口 pTA41 (thl-ctfAB-adc)的大肠杆菌。
实施例已经对梭菌属的几个种进行了异丙醇产量的评价，包括52个拜氏梭菌菌株。这些 菌株的异丙醇最大产量为30mM。关于这些菌株的代谢调节的有限知识和基因操作的难度阻 碍了异丙醇产量的进一步提高。另一方面，大肠杆菌是对于代谢性改造研究最多和容易操 作的细菌之一。该细菌已经显示产生很高滴度的乙醇和许多其他的生物化学物质。Bermejo 等人，(Appl. Environ. Microbiol. 64 1079-1085,1998)通过在来自丙酮 丁醇梭菌的thl启动子的控制下引入来自丙酮丁醇梭菌ATCC824的四种基因(分别编码乙 酰辅酶A乙酰基转移酶、乙酰乙酰辅酶A转移酶和乙酰乙酸脱羧酶的thl、ctfAB和adc)， 已经在大肠杆菌中产生了丙酮。此工程改造的大肠杆菌菌株产生的丙酮水平几乎与丙酮丁 醇梭菌ATCC 824相同。然而，还没有报道在大肠杆菌中产生异丙醇。本发明提供了一种改 造的合成途径用于在包括大肠杆菌的微生物中产生异丙醇。生物合成异丙醇的策略利用以拜氏梭菌构建的途径模型，该途径从乙酰辅酶 A(乙酰CoA)经丙酮产生异丙醇(图1)。首先，乙酰辅酶A乙酰基转移酶将两分子的乙酰 辅酶A缩合为一分子的乙酰乙酰辅酶A。下一步，乙酰乙酰辅酶A转移酶将辅酶A从乙酰 乙酰辅酶A转移至乙酸或至丁酸，形成乙酰乙酸，然后乙酰乙酸被乙酰乙酸脱羧酶转变为 丙酮和CO2。伯-仲醇脱氢酶(之后称为仲醇脱氢酶，SADH)在依赖NADPH的反应中将丙酮 转变为异丙醇。为了优化途径，在进行产生丙酮的初始步骤中，检验了天然大肠杆菌乙酰辅 酶A乙酰基转移酶(由atoB编码)和乙酰乙酰辅酶A转移酶(由atoAD编码)。此外，在 进行产生异丙醇的最终步骤中比较了来自拜氏梭菌NRRL B593和布氏热厌氧杆菌HTD4的 SADH(由adh编码)的活性。这两种SADH以前已经在大肠杆菌中表达并被表征。表1显示了在本研究中使用的菌株和质粒。通过Pl转导从大肠杆菌DH5 α Zl 引入IacItl的大肠杆菌B株(ATCC 11303)用作宿主菌株，并命名为ΤΑ11。丙酮途径基因 thl、ctfAB、atoB、atoAD和adc的多种组合被克隆进受PLlacO1启动子控制的ColEl来源 的质粒(pSA40)。得到的质粒命名为 pTA29 (atoB-ctfAB-adc)、pTA30 (atoB-atoAD-adc)、 pTA39 (thl-atoAD-adc)和pTA41 (thl-ctfAB-adc)(详情见表1)。来自拜氏梭菌或布氏热 厌氧杆菌的adh基因分别被克隆进受PjacO1控制的pl5A传递载体(pZA31-luc)以产生质 粒PTA36和pTA18。丙酮途径基因和异丙醇生成基因的各种组合被引入至TAll中进行评 价。对于异丙醇生成途径的除atoB和thl基因之外的所有基因使用相同的核糖体结 合位点(RBS) (GAAGGAGATATACAT (SEQ ID NO 11), atoB 和 thl 基因使用表达构建体的 RBS 被克隆至PJacO1启动子的下游。使用的RBS的来源为pET-31b(+)质粒(Invitrogen, Carlsbad, CA)。除两个adh基因以外的所有基因均从染色体DNA被PCR扩增，并验证序 列。在为大肠杆菌进行密码子优化后由EpochBiolabsOtouston，TX)合成两个adh基 因。下面的条件用于优化。15%临界值用于密码子效率除了具有强的二级结构的位 置(在此情况下使用较低频率的密码子来减轻此问题)以外，去除低于15%的任何密码 子。使用内建M-fold模块(build-in M-fold module)来检查二级结构。避免茎环和假
22SD (Shine-Dalgarno)序列。通过此优化改变碱基对的数目，对于拜氏梭菌为约290，而对于 布氏热厌氧杆菌为240。限制性酶、磷酸酶(New England Biolabs, Ipswich，ΜΑ)、连接酶 (快速 DNA 连接试剂盒(rapid DNA ligation kit) ；Roche,Manheim, Germany)和 DNA 聚合 酶(KOD DNA 聚合酶，EMD Chemicals, San Diego, CA)用于克隆。由 Invitrogen (Carlsbad, CA)合成寡核苷酸。pTA29 (PLlacO1 :atoB-ctfAB_adc)-为 了 用 PJacOi 置换 pZE21_MCSl 的 P^etO1, pZE12-luc用AatII和Acc65I消化。纯化较短的片段，并克隆进用相同的酶切 割的质粒pZE21-MCSl中，建立pSA40。为了克隆atoB、ctfAB和adc，使用pSA40中的 Acc65I-SalI (atoB)、SalI-XmaI (ctfAB)和 XmaI-BamHI (adc)识别位点。AatII 和 AvrII 识别位点用来用氨苄青霉素抗性基因来置换卡那霉素抗性基因。为了克隆atoB，大肠杆菌 K-12MG1655 的基因组 DNA 用作模板，使用一对引物 TA15F(5，CGCGGTACCATGAAAAATTGTGTC ATCGTCAGTG 3，(SEQ ID NO: 12))和 TA 16R (5 ‘ CCGCGTCGACTTAATTCAACCGTTCAATCACCATC 3，(SEQ ID N0:13))，并且PCR产物用Acc65I和SalI消化。为了克隆ctfAB，丙酮丁醇梭 菌 ATCC824 (ATCC)的基因组 DNA 用作模板，使用一对引物 TA19F (5，CCGCGTCGACGAAGGAGATA TACATATGAACTCTAAAATAATTAGATTTG 3，(SEQ ID N0:14))和 TA4R(5，CGCCCCGGGCTAAACAGCC ATGGGTCTAAGTTCA 3，(SEQ ID NO :15))，且 PCR 产物用 SalI 和 XmaI 消化。为了克隆 adc, 丙酮丁醇梭菌ATCC824的基因组DNA用作模板，使用一对引物TA20F (5，CGCCCCGGGGAAGGAG ATATACATATGTTAAAGGATGAAGTAATTAAAC3，(SEQ ID N0:16))和 TA6R(5，CGCGGATCCTTACTTAA GATAATCATATATAACT 3，(SEQ ID NO 17))，且 PCR 产物用 XmaI 禾口 BamHI 消化。PTASO(PLlacC)1: :atoB-atoAD_adc) -为 了克隆 atoAD，大肠杆菌 K-12MG1655 的基 因组 DNA 用作模板，使用一对引物 TA21F(5，CCGCGTCGACGAAGGAGATATACATATGAAAACAAAATT GATGACATTAC 3，(SEQ ID NO: 18))和 TA 18R(5，CGCCCCGGGTCATAAATCACCCCGTTGCGTATTC 3，(SEQ ID N0:19))。PCR产物用Sail和XmaI消化，并克隆进用相同酶切割的质粒pTA29 中。pTA39 (PlIbcO1 thl-atoAD-adc)-为 了克隆 thl，丙酮丁醇梭菌 ATCC824 的基因组 DNA用作模板，使用一对引物TA13F(5，CGCGGTACCATGAAAGAAGTTGTA ATAGCTAGTG 3，(SEQ ID NO :20))和 TA14R(5，CCGCGTCGACCTAG CACTTTTCTAGCAATATTGC 3，(SEQ IDNO :21))。PCR 产物用Acc65I和Sail消化，并克隆进用相同酶切割的质粒pTA30中。pTA41 (PlIbcO1 thl-ctfAB-adc)-为 了克隆 thl，丙酮丁醇梭菌 ATCC824 的基因组 DNA用作模板，使用一对引物TA13F和TA14R。PCR产物用Acc65I和SalI消化，并克隆进用 相同酶切割的质粒PTA29中。pTA18 (PlIbcO1 adh (布氏热厌氧杆菌))_为了克隆adh (布氏热厌氧杆菌)，布氏 热厌氧杆菌HTD4的合成DNA (Epoch Biolabs)用作模板，使用一对引物TA7F(5，CGCGGTACC ATGAAAGGTTTTGCAATGCTGTCCA 3，(SEQ IDNO :22))和 TA8R(5，CGCTCTAGACTATGCTAAAATCAC CACTGGTTTAATT3，(SEQ ID NO :23))。PCR产物用Acc65I和XbaI消化并克隆进用相同酶切 割的质粒pZE12-luc中，建立pTA8。为了用pl5A和卡那霉素抗性基因置换复制起点和氨苄 青霉素抗性基因，pZA31-luc用AatII和AvrII消化。纯化较短的片段并克隆进用相同酶 切割的PTA8中以建立pTA18。为在大肠杆菌中表达，优化合成DNA的密码子使用，并且通过 用二级结构预测程序检查来避免茎环结构。该序列显示在补充资料中。
PTA36 (PlIbcO1 ::adh(拜氏梭菌))-为了克隆adh(拜氏梭菌)，带有拜氏梭菌NRRL B593的合成DNA的质粒(Epoch Biolabs)用Acc65I和SalI消化并克隆进用相同酶切割的 质粒pZE12-luc中，建立pTA34。为了用pl5A和卡那霉素抗性基因置换复制起点和氨苄青 霉素抗性基因，pZA31-luc用AatII和AvrII消化。纯化较短的片段并克隆进用相同酶切 割的质粒中以建立PTA36。以与来自布氏热厌氧杆菌的adh基因相同的方式优化合成DNA 的密码子使用(见，例如，图4)。作为预培养培养基，制备含2%葡萄糖的SD-7(NH4Cl，7.0g/l ；KH2PO4,1. 5g/l ； Na2HPO4,1. 5g/l ；K2SO4,0. 35g/l ；MgSO4 ‘ 7H20，0. 17g/l，痕量元素，0. 8ml/l ；酵母提取物； 5g/l)，如(13)所述。含有 2 % 葡萄糖的 SD-8 (NH4Cl, 7. Og/Ι ；KH2PO4, 7. 5g/l ；Na2HPO4, 7. 5g/l ;K2S04,0 . 85，MgSO4 · 7Η20，0· 17g/l，痕量元素，0. 8ml/l ；酵母提取物；10g/l) (13) 培养基用于发酵。痕量元素溶液含有下列物质(以每升5M HCl的克数计)=FeSO4 · 7H20， 40. 0 ；MnSO4 · H20,10. 0 ；Al2 (SO4) 3，28. 3 ；CoCl2 · 6H20,4. 0 ；ZnSO4 · 7H20, 2. 0 ；Na2MoO4 · 2H20 ； CuCl2 · 2H20,1. 0 ；和H3BO4,0. 5。在合适时加入抗生素；氨苄青霉素100 μ g/ml和氯霉素 40 μ g/mlο在试管中含有5ml SD-7培养基的预培养在旋转振荡器(250rpm)上在37°C过夜 (17h)进行。250μ 1的过夜培养物接种在250ml带挡板培养瓶中的25ml SD-8培养基中。 当OD6qq为 1.0 (3h)时，加入0. ImM IPTG用于诱导。细胞在37°C下在旋转振荡器(250rpm) 上生长 30. 5h 并在 0、3、6· 5,9. 5、12、24、28· 5 和 30. 5h 时收获。使用葡萄糖分析试剂(Sigma Aldrich)测量葡萄糖。使用火焰离子化检测器通过 气相色谱定量各种醇。该系统由5890A型气相色谱仪(Hewlett Packard, Avondale, PA) 和7673A型自动进样器、采样器和控制器(Hewlett Packard)组成。通过DB-WAX毛细管柱 (30m, 0. 32mm-i. d.，0. 50 μ m_ 膜厚度；AgilentTechnologies)进行醇化合物的分离。GC 烘 箱温度初始地在40°C保持5min，并以15°C /min的梯度升高至120°C，然后以50°C /min的 梯度升高至230°C，并保持4min。氦气用作载气，入口压力为9. 3psi。进样器和检测器维持 在225°C。0.5μ1培养肉汤上清液以分流注样模式(1 15分流比)注入。1_丙醇用作内 标。对于其他分泌的代谢物，过滤的上清液加至(20μ1)装有自动采样器 (AgilentTechnologies)禾口 BioRad(Biorad Laboratories,Hercules,CA)Aminex HPX87 柱 (5mM H2S04，0. 6ml/min，柱温度为65°C )的Agilent 1100HPLC中。使用光二极管阵列检测 器在210nm检测有机酸(延胡索酸、乳酸、柠檬酸、丙酮酸、甲酸、苹果酸、乙酸和琥珀酸)。在诱导后4h收获的细胞在离心后用于酶测定。在缺氧条件下用0. Imm玻璃珠和 Mini Bead Beater 8(Biospec Product, OK)制备 50mM Tris 氯化物(pH8)中的粗制提取 物。通过用NADPH在25°C下在氩气中还原丙酮(6. 7mM)来测定SADH活性。测定混合物含 有50mM Tris-Cl缓冲液(pH 7. 5)、ImM 二硫苏糖醇和0. 2mM NADPH0 1单位活性为每分钟 氧化 lymol NADPH0使用5种不同的基因组合用于产生异丙醇(图2)。所有合成途径从lllmM(20g/ 1)的初始葡萄糖浓度在缺氧条件下产生异丙醇。对于所有组合，在接种后12小时内葡萄糖 被耗尽(用IPTG诱导后9小时)。如在图2中显示，带有pTA39/pTA36的TAll产生最高量 的异丙醇。与异丙醇的产量相比，所有菌株产生的乙醇量均非常低(小于IOmM)。
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图3显示使用TAll (pTA39/pTA36)发酵的时程。在葡萄糖耗尽(12h)后异丙醇浓 度下降。在24h时向培养物中加入葡萄糖(IllmM)将异丙醇的生产恢复至与第一生产阶段 相同的速率，表明即使在14小时饥饿后途径活性仍然是稳定的。当葡萄糖被耗尽(30. 5h) 时，异丙醇的终浓度达到81. 6mM。在初始葡萄糖耗尽后丙酮浓度继续增加，并随着葡萄糖的 加入，丙酮浓度突然下降(图3)。在由IPTG诱导后除了延胡索酸(最大浓度，386 μ M)以 外没有有机酸的显著积累。在葡萄糖饥饿期间异丙醇浓度降低而丙酮浓度升高。比较具有ρΤΑ36或ρΤΑ18的菌株的异丙醇产量。来自拜氏梭菌的SADH的氨基酸 序列与来自布氏热厌氧杆菌的SADH的氨基酸序列具有76%的同一性和86%的相似性。然 而，ΤΑ11(ρΤΑ39/ρΤΑ18)比含有来自拜氏梭菌的adh的菌株(pTA39/pTA36)产生浓度较低 的异丙醇和浓度高得多的丙酮。为了进一步研究，测定了来自含有这两种醇脱氢酶的培养 物(pTA18或pTA36)的粗制提取物中的酶活性。来自拜氏杆菌(pTA39/pTA36)的醇脱氢 酶活性(3. 08士0.36单位/mg蛋白质)的确大大地高于布氏热厌氧杆菌(pTA39/pTA18) (0. 24士0. 08单位/mg蛋白质)，与较高的异丙醇产量相一致。当在菌株中缺少含adh的质粒时，宿主由仅含有PTA39的TAll产生丙酮。在24h 时加入葡萄糖至lllmM，菌株以几乎相同的生产速率继续产生丙酮。细胞生长和乙醇浓度 显示与在异丙醇生产试验期间所观察到的相似的趋势。当葡萄糖耗尽(30. 5h)时，丙酮的 终浓度测定为148. 3mM。当在异丙醇生产中时，在IPTG诱导后除了延胡索酸(最大浓度 292 μ M)以外没有有机酸的显著积累。本发明证明了在大肠杆菌中生产异丙醇。在摇瓶培养中，含有ΡΤΑ39/ΡΤΑ36的 TAll株在30. 5h时产生81. 6mM异丙醇，在3 9. 5h之间的最大生产率为6. 9mM/h (0. 41g/ 1/h)。工程大肠杆菌超过了报道最好的拜氏梭菌NRRL B593菌株，后者产生的异丙醇为 30mM,最大生产率为 3mM/h ( 0. 18g/l/h) (4)。在接种后9. 5h时的异丙醇收率为43. 5% (mol异丙醇/mol葡萄糖)。该收率是由在3 9. 5h之间产生的异丙醇(44. 8mM)和消耗 的葡萄糖(103. OmM)来计算的摩尔收率=44. 8/103. 0 = 0. 435。该收率是非常令人鼓舞 的，因为使用该生产途径从葡萄糖的最大理论收率为1 (mol异丙醇/mol葡萄糖)。异丙醇 生产的理论收率是基于图1中显示的途径来计算的。1摩尔葡萄糖转变为2摩尔乙酰辅酶 A和2摩尔C02。然后2摩尔乙酰辅酶A缩合形成1摩尔异丙醇，损失了额外的1摩尔C02。结果显示与含有拜氏梭菌CtfAB的菌株相比，含有atoAD的大肠杆菌产生较高浓 度的异丙醇。对于CtfAB，乙酸的Km(1200mM)比AtoAD(53. ImM)高得多。此乙酸亲和力的 差异可能解释了为何AtoAD是用于生产异丙醇的较好的酶。异丙醇生产显示来自拜氏梭菌 的SADH的丙酮至异丙醇的转换率大大高于布氏热厌氧杆菌。的确，使用粗制提取物的醇脱 氢酶测定显示来自拜氏梭菌的SADH从丙酮形成异丙醇的活性高于布氏热厌氧杆菌。尽管 没有排除表达水平的差异，但来自拜氏梭菌的SADH是在这些条件下生产异丙醇的较好选 择。密码子优化可改变表达。普遍知道基因的GC含量影响表达效率。拜氏梭菌和布氏热 厌氧杆菌中的GC含量分别为38%和44%。这些值不同于大肠杆菌K-12MG1655的平均GC 含量。Bermejo等人，见前，证明使用摇瓶的分批和葡萄糖流加培养用于在大肠杆菌中生 产丙酮，利用了来自丙酮丁醇梭菌(thl、ctfAB、adc)的重组丙酮途径。该菌株在分批培养 中在接种后24h时产生约40mM丙酮，在葡萄糖流加培养中产生93mM丙酮。使用相同的培养基，相同的葡萄糖浓度和大肠杆菌B株的变型。然而，使用相同的基因构建物(PTA41)的 分批产量为在12h时达到60. 3mM丙酮。在摇瓶中，含有pTA39的TAll株在约30h时达到 148. 3mM的最大浓度，和12. lmM/h(0. 70g/l/h) (3-9. 5h)的最大生产率。丙酮滴度也超过野 生型丙酮丁醇梭菌所产生的水平(90mM)。不进一步优选菌株和发酵条件，在接种后12h时 的丙酮收率已经为理论最大值的73. 5% (mol/mol)。此高收率表明在异丙醇的工业生产中 使用代谢工程大肠杆菌的极大潜力。 已经描述了本发明的许多实施方案。然而，要理解的是，在不背离本发明的精神和 范围的前提下可作出多种改动。因此，其他实施方案包含在下列权利要求的范围内。
2权利要求
一种重组微生物，包括从适当的碳底物的发酵生产异丙醇的生物化学途径，所述生物化学途径包括乙酰辅酶A乙酰基转移酶，其中所述微生物包括至少一种与相应的亲代微生物相比异源的多肽。
2.如权利要求1所述的重组微生物，包括与亲代微生物相比具有乙酰辅酶A乙酰基转 移酶活性的多肽表达升高，其中所述重组微生物从包括乙酰辅酶A的底物产生包括乙酰乙 酰辅酶A的代谢物。
3.如权利要求2所述的重组微生物，其中所述具有乙酰辅酶A乙酰基转移酶活性的多 肽由与SEQ ID NO :30、66、68或66和68中所示的序列具有至少约50%同一性的多核苷酸编码。
4.如权利要求2所述的重组微生物，其中所述具有乙酰辅酶A乙酰基转移酶活性的多 肽由atoB基因或其同源物，或fadA基因或其同源物编码。
5.如权利要求4所述的重组微生物，其中所述atoB基因或fadA基因来自埃希杆菌属。
6.如权利要求5所述的重组微生物，其中所述埃希杆菌是大肠杆菌。
7.如权利要求1所述的重组微生物，其中所述微生物是重组大肠杆菌。
8.如权利要求7所述的重组微生物，其中所述具有乙酰辅酶A乙酰基转移酶活性的多 肽由与SEQ ID NO 32中所示的序列具有至少约50%同一性的多核苷酸编码。
9.如权利要求7所述的重组微生物，其中所述具有乙酰辅酶A乙酰基转移酶活性的多 肽由thl基因或其同源物编码。
10.如权利要求9所述的重组微生物，其中所述thl基因来自梭菌属。
11.如权利要求10所述的重组微生物，其中所述梭菌是丙酮丁醇梭菌。
12.如权利要求1所述的重组微生物，包括与亲代微生物相比具有乙酰乙酰辅酶A转移 酶活性的多肽表达升高，其中所述重组微生物从包括乙酰乙酰辅酶A的底物产生包括乙酰 乙酸的代谢物。
13.如权利要求12所述的重组微生物，其中所述乙酰乙酰辅酶A转移酶由atoAD基因 或其同源物编码。
14.如权利要求13所述的重组微生物，其中所述atoAD基因来自大肠杆菌。
15.如权利要求1所述的重组微生物，包括与亲代微生物相比具有乙酰乙酸脱羧酶活 性的多肽表达升高，其中所述重组微生物从包括乙酰乙酸的底物产生包括丙酮的代谢物。
16.如权利要求15所述的重组微生物，其中所述乙酰乙酸脱羧酶由adc基因或其同源 物编码。
17.如权利要求16所述的重组微生物，其中所述adc基因来自丙酮丁醇梭菌、溶纤维丁 酸弧菌、热解糖高温厌氧杆菌和艰难梭菌。
18.如权利要求17所述的重组微生物，其中所述微生物是丙酮丁醇梭菌。
19.如权利要求1所述的重组微生物，包括与亲代微生物相比具有仲醇脱氢酶活性的 多肽表达升高，其中所述重组微生物从包括丙酮的底物产生包括异丙醇的代谢物。
20.如权利要求19所述的重组微生物，其中所述具有仲醇脱氢酶活性的多肽由与SEQ ID NO :7或9任一个中所示的序列具有至少约50%同一性的多核苷酸编码。
21.如权利要求19所述的重组微生物，其中所述具有仲醇脱氢酶活性的多肽由adh或 sadh基因或其同源物编码。2
22.如权利要求21所述的重组微生物，其中所述ccr基因来自布氏热厌氧杆菌或拜氏 梭菌。
23.如权利要求1所述的重组微生物，其中所述适当的碳底物包括葡萄糖。
24.如权利要求1所述的重组微生物，其中所述重组微生物包括编码催化乙酰辅酶A转 变为乙醇、催化丙酮酸转变为乳酸、催化乙酰辅酶A和磷酸转变为辅酶A和乙酰磷酸、催化 乙酰辅酶A和甲酸转变为辅酶A和丙酮酸、或乙酰辅酶A的乙酰基与3-甲基-2-氧代丁酸 (2-氧代异戊酸)的缩合的酶的基因中的一个或多个缺失或敲除。
25.如权利要求1所述的重组微生物，进一步包括降低的乙醇脱氢酶活性、乳酸脱氢酶 活性、磷酸乙酰基转移酶活性或其任何的组合。
26.如权利要求25所述的重组微生物，其中所述敲除或破坏包括选自下列的缺失或破 坏adhE、ldhA、其任何组合，其任何同源物或天然存在的变体。
27.如权利要求1所述的重组微生物，包括乙酰辅酶A乙酰基转移酶、乙酰乙酰辅酶A 转移酶、乙酰乙酸脱羧酶和adh(仲醇脱氢酶)的表达或增加的表达。
28.一种重组微生物，包括从适当的碳底物的发酵产生异丙醇的重组生物化学途径，其 中所述重组生物化学途径包括乙酰辅酶A乙酰基转移酶、乙酰乙酰辅酶A转移酶、乙酰乙酸 脱羧酶和adh (仲醇脱氢酶)的表达升高。
29.如权利要求28所述的重组微生物，其中所述适当的碳底物包括葡萄糖。
30.一种产生重组微生物的方法，所述重组微生物将适当的碳底物转变为异丙醇，所述 方法包括用一种或多种编码具有乙酰辅酶A乙酰基转移酶、乙酰乙酰辅酶A转移酶、乙酰乙 酸脱羧酶和adh (仲醇脱氢酶)活性的多肽的多核苷酸转化微生物。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述适当的碳底物包括葡萄糖。
32.一种产生异丙醇的方法，所述方法包括在生物体中诱导thl或atoB基因、ctfAB或 atoAD基因或操纵子、adc基因、adh(仲醇脱氢酶)基因、或其任何组合的过度表达，其中所 述生物体当在适当的碳底物的存在下培养时产生异丙醇。
33.一种产生异丙醇的方法，所述方法包括(i)诱导生物体中thl或atoB基因的过度表达；(ii)诱导生物体中ctfAB或atoAD基因的过度表达；(iii)诱导生物体中adc基因的过度表达；(iv)诱导生物体中adh基因的过度表达；或(ν)诱导⑴、(ii)、(iii)和(iv)的过度表达。
34.如权利要求32或33所述的方法，其中所述适当的碳底物包括葡萄糖。
35.一种重组载体，包括(i)编码第一多肽的第一多核苷酸，所述第一多肽催化从包括乙酰乙酰辅酶A的底物 向乙酰乙酸的转变；(ii)编码第二多肽的第二多核苷酸，所述第二多肽催化从包括乙酰乙酸的底物向丙酮 的转变；和(iii)编码第三多肽的第三多核苷酸，所述第三多肽催化从包括丙酮的底物向异丙醇 的转变。
36.如权利要求35所述的重组载体，其中所述第一多核苷酸编码乙酰辅酶A乙酰基转移酶或乙酰乙酰辅酶A转移酶。
37.如权利要求35所述的重组载体，其中所述第二多核苷酸编码乙酰乙酸脱羧酶。
38.如权利要求35所述的重组载体，其中所述第三多核苷酸编码仲醇脱氢酶。
39.如权利要求35所述的重组载体，其中所述载体包括丙酮丁醇梭菌thl(乙酰辅酶A 乙酰基转移酶)、大肠杆菌atoAD (乙酰乙酰辅酶A转移酶)、丙酮丁醇梭菌adc (乙酰乙酸 脱羧酶)和拜氏梭菌adh (仲醇脱氢酶)基因或多核苷酸。
40.转染进大肠杆菌中的权利要求35、36、37、38或39所述的重组载体。
41.如权利要求35所述的重组载体，其中所述载体是质粒。
42.如权利要求35所述的重组载体，其中所述载体是表达载体。
43.一种重组宿主细胞，包括权利要求42所述的表达载体。
44.如权利要求43所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞产生异丙醇。
45.一种重组微生物，包括至少一条促进葡萄糖向异丙醇转变的异源核酸序列。
全文摘要
本文提供了一种可用于生产生物燃料的代谢性修饰的微生物。
文档编号C12P21/06GK101903530SQ200880119064
公开日2010年12月1日 申请日期2008年10月11日 优先权日2007年10月12日
发明者渥美正太, 花井泰三, 詹姆士·C·里奥 申请人:加利福尼亚大学董事会