用于从单个样品中分离基因组dna、rna和蛋白质的方法

专利名称：用于从单个样品中分离基因组dna、rna和蛋白质的方法
技术领域：
本发明涉及用于分离基因组DNA、总RNA和蛋白质的方法。更具体地，本发明涉及 用于从单个样品中提取和纯化基因组DNA、总RNA和蛋白质的简单且快速的系统和方法。
背景技术：
近三十年来已看出，在开发用于从生物来源中分离和纯化核酸和蛋白质的改良方 法的方面付出了相当大的努力。这主要是由于核酸和蛋白质在医学和生物科学中应用的不 断增加。从血液、组织或培养细胞中分离基因组RNA有几种用途，其包括PCR、测序、基因分 型、杂交和DNA印迹法。质粒DNA已被用于测序、PCR、疫苗开发和基因治疗。分离的RNA有 多种下游应用，包括体外翻译、cDNA合成、RT-PCR以及用于微阵列基因表达分析。在蛋白 质领域中，通过蛋白印迹鉴定蛋白已成为基础研究中研究基因表达以及为了诊断目的鉴定 特定蛋白(例如病毒蛋白的检测)的重要工具。通常在核酸和蛋白质的分析和体外操作之前要进行分离步骤，以便使样品从不需 要的污染物中游离出来，所述污染物可能会干扰后续的处理步骤。对于研究和诊断用分子 生物学中的大部分方法来说，需要提取的核酸和蛋白质作为第一步。RNA、DNA和蛋白质的用途增加为用于分离DNA、RNA和蛋白质的快速、简单且可靠 的方法和试剂创造了需要。在许多应用中，若可从单个样品中同时分离出三种细胞组分 (RNA、DNA和蛋白质)，则将极大简化收集生物材料样品及其后续分析。当样品量小(例如 在活检时)到不允许将其分成更小的样品来进行针对DNA、RNA和蛋白质的单独分离方案 时，同时分离尤为重要。此外，出于不同原因，DNA、RNA和蛋白质的全部三种水平提供了有价值的信息。DNA 或基因型提供了关于遗传易感性和获得性突变/局部重排的重要信息。mRNA谱和蛋白质 谱得到了生物学阶段/状态或疾病的“分子肖像(molecular portrait) ”，并且还可用于疾 病的发展和治疗的分期和监测。与DNA相反，mRNA谱和蛋白质谱代表了细胞生物学的“快 照”，这是由于它们会随周围环境作出反应而不断变化。由于调节机制作用于转录、翻译和 翻译后水平三者，mRNA水平和蛋白质水平并不总是相互关联。因此研究同一样品中的mRNA 和蛋白质是极其重要的。因此，如上所述，然而mRNA水平和蛋白质水平之间并非一定存在1 1的相关性。 若将蛋白质水平和相应的mRNA水平作比较，那么对于mRNA与蛋白质之比并不为1 1的每 种蛋白质而言，所述蛋白质受到了一些形式的感兴趣的转录后调节和/或翻译后调节。针 对特定基因的mRNA/蛋白质之比往往在疾病条件下会转变。为了能够研究调节机制并解释 mRNA/蛋白质之比转变背后的原因，从同一样品中分离mRNA和蛋白质是极其重要的。
此外，微小RNA(miRNA)调节基因表达，并且miRNA的失调牵涉到许多疾病或病况。 若微小RNA可从同一样品中与总蛋白质、基因DNA和总RNA—同被分离，则对于我们理解它 们之间的相互作用和效应会有明显的好处。用于分离微小RNA的有效方法还有助于癌症、 神经学、心脏病学及其它领域中基于微小RNA的诊断学和治疗学的发展。本文提供了用于从同一样品中进行基因组DNA、RNA和蛋白质的分离的新型且有 益的方法。发明简述一般而言，本发明提供了用于从同一样品中快速分开和分离双链核酸和单链核酸 的改良的方法、系统和试剂盒。所述双链核酸在高浓度的离液盐存在下选择性吸附到矿物 支持体(mineral support)。调节含单链核酸的流过液以使单链核酸吸附到第二矿物支持 体。所述核酸分别从各自的矿物支持体洗脱下来，而蛋白质可从第二矿物支持体的流过液 中纯化。因此，本发明的一个方面提供了用于分离和/或纯化至少两种细胞组分的方法， 所述细胞组分选自基因组DNA、RNA和蛋白质。所述方法包括首先裂解生物样品，得到含细 胞组分的水溶液；随后将所述水溶液在使基因组DNA结合的条件下上样(apply)至第一矿 物支持体；收集含有未结合的RNA和蛋白质的流过液。所述方法还包括将所述流过液在使 RNA结合的条件下上样至第二矿物支持体，并收集包含蛋白质的流过液。在本发明的某些实施方案中，使用裂解液裂解样品，所述裂解液包含离液盐、非离 子型去污剂和还原剂。优选所述离液盐为盐酸胍(GuHCl)。还优选的是，所述非离子型去污 剂为NP-40而所述还原剂为巯基乙醇(0-ME)。在本发明的其它实施方案中，来自第一 矿物支持体的流过液在RNA与第二矿物支持体结合之前与有机物混合。在优选的实施方案 中，所述有机物为极性或偶极的非质子溶剂。最优选地，所述有机物为丙酮。在某些实施方案中，所述方法还包括洗涤第一矿物支持体并洗脱其基因组DNA。在 其它的实施方案中，所述方法还包括洗涤第二矿物支持体并洗脱其RNA。在其它的实施方案 中，所述方法还包括从流过液中进一步分离蛋白质。在另一方面，本发明提供了用于分开和分离双链核酸、单链核酸和蛋白质的试剂 盒。所述试剂盒包括用于裂解生物样品的裂解液；用于结合双链核酸的第一矿物支持体； 用于结合单链核酸的第二矿物支持体；用于从第一矿物支持体中洗脱双链核酸的洗脱液； 和用于从第二矿物支持体中洗脱单链核酸的洗脱液。任选地，所述试剂盒还包括用于在基 因组DNA和RNA与各自的矿物支持体结合后从流过液中分离蛋白质的工具(means)。在优选的实施方案中，所述裂解液包含离液盐、非离子型去污剂和还原剂。在另一 优选的实施方案中，所述第一矿物支持体和所述第二矿物支持体各自为二氧化硅膜。本发明的上述和其它特征以及优点将通过下面的详述和权利要求而变得更清楚。附图简述

图1出示了根据本发明的实施方案，用于从单个样品中分离基因组DNA、总RNA和 蛋白质的方法的示意图。图2显示了根据本发明的一个实施方案分离的基因组DNA和总RNA的凝胶图像。图3显示了根据本发明的某些实施方案分离的基因组DNA和RNA样品与市售产品 所得的那些基因组DNA和RNA样品比较的凝胶图像。上总RNA;下基因组DNA。左侧凝胶显示了从培养的海拉细胞(HaLa cell)中分离的核酸样品。右侧凝胶显示了从大鼠肝组 织中分离的核酸样品。图4为根据本发明的实施方案从海拉细胞培养物中分离的总RNA样品对比市售产 品所得的那些RNA样品的AgilentBioanalyzer所得的图像。图5显示了来自海拉细胞培养物的基因组DNA样品所得的实时PCR扩增结果，该 结果具有在包括使用市售产品所得的那些基因组DNA样品在内的样品中观察到的非常相 似的扩增概况。图6显示了从来自海拉细胞培养物的总RNA样品所得的实时RT-PCR扩增结果，该 结果具有在包括使用市售产品所得的那些总RNA样品在内的样品中观察到的非常相似的 扩增概况。图7为SDS-PAGE凝胶的考马斯染色结果，其显示了根据本发明的实施方案从海拉 细胞培养物中分离的总蛋白质，以及从市售产品中分离的总蛋白质。图8显示了根据本发明的实施方案分离的蛋白质样品对比采用市售产品分离的 那些蛋白质样品的蛋白印迹实验所得的结果。图9是根据本发明的实施方案从大鼠肝组织中分离的总RNA样品对比来自市售产 品的总RNA样品的Agilent Bioanalyzer所得到的图像。图10显示了来自大鼠肝组织的基因组DNA样品所得到的实时PCR扩增结果，该结 果具有在包括来自市售产品的样品在内的样品中观察到的非常相似的扩增概况。图11显示了来自大鼠肝组织的总RNA样品所得的实时RT-PCR扩增结果，该结果 具有在包括使用市售产品所得总RNA样品在内的样品中观察到的非常相似的扩增概况。图12为SDS-PAGE凝胶的考马斯染色情况，其显示了根据本发明的某些实施方案 从大鼠肝组织中分离的总蛋白质。图13为SDS-PAGE凝胶的考马斯染色情况，其显示了根据本发明的实施方案从大 鼠肝组织中分离的总蛋白质，以及从市售产品中分离的总蛋白质。图14显示了根据本发明的某些实施方案从海拉细胞中分离到的基因组DNA和总 RNA的凝胶图像和产量的结果。图15显示了根据本发明的某些实施方案从大鼠肝组织中分离到的基因组DNA和 总RNA的凝胶图像和产量的结果。图16显示了从根据本发明的实施方案纯化的总RNA中分离的小RNA (泳道1、2、3) 以及对照样品(Q和Q)的凝胶图像和产量的结果。总RNA原材料作为另一对照(泳道‘输 入’)加样。图17出示了四种微小RNA的qRT-PCR图，确定了分离的小RNA样品中低拷贝数微 小RNA和高拷贝数微小RNA两者的存在情况。图18比较了根据本方法分离的总RNA与从两种市售产品中分离的总RNA的小RNA 分离情况。小RNA显示在下面的凝胶中，而“大”RNA(无小RNA的总RNA)显示于上面的凝 胶中。发明详述本发明提供了用于从单个生物材料(诸如细胞、组织和生物液体)中高效、简单地 提取基因组DNA、RNA和蛋白质的组合物、方法和试剂盒。有利地，这些可在无需使用有毒或腐蚀性试剂并且无需使用昂贵的超速离心设备的条件下实现。利用本发明的试剂和方法可 在短至30分钟的时间内分离基因组DNA和总RNA，并且可在短至45分钟的时间内分离蛋白 质。这些结果大致上要快于用于分离各种组分的现有方法。本发明还适用于单独分离RNA、DNA、蛋白质或这些细胞组分中至少两种的任何组 合。分离所得的基因组DNA和总RNA具有适用于下游应用的高质量。我们还发现，相对于 从其它的市售方案分离的总RNA，通过本方法分离的总RNA包含更高水平的小RNA。因此本 发明还提供了用于分离小RNA的方法，所述方法通过使根据本方法分离的总RNA接受任一 种已知的小RNA分离方法来进行。因此，小RNA可从相同的起始样品与其它组分(即基因 组DNA、总RNA和蛋白质)一同被分离。“生物材料”或“生物样品”是广义上采用的术语，意指包括多种含有核酸和蛋白质 的生物来源。这些的来源非限制性地包括全组织(包括活检材料和抽吸液(aspirate))； 体外培养的细胞(包括原代细胞和传代细胞、转化细胞系、以及组织和血细胞)；体液(诸 如尿、痰、精液、分泌物、洗眼液(eye washes)及眼抽吸液、洗肺液及肺抽吸液)。真菌组织 和植物组织(例如叶、根、茎和根冠)也包括在本发明的范围之内。生物样品上或生物样品 中可存在的微生物和病毒在本发明的范围之内。细菌细胞也在本发明的范围之内。在其最广泛的方面，本发明涵盖了用于从生物材料(包括组织、细胞和体液)中分 离基本上纯化的且未降解的总RNA、基因组DNA和蛋白质的方法。因此，首先裂解生物样品 以得到含细胞组分的水溶液；然后将水溶液在使基因组DNA结合的条件下上样至第一矿物 支持体；同时收集含未结合的总RNA和蛋白质的流过液。将流过液在使RNA结合的条件下 上样至第二矿物支持体；收集其流过液，该流过液包含蛋白质。从所述第一和第二矿物支持 体中分别洗脱基因组DNA和总RNA。本发明的一个实施方案的流程的实例在图1中示出。优选的是，首先在含离液物质和/或其它盐的含水裂解系统中裂解生物样品或细 胞，即在最简单的情况下通过将其加入细胞中。本文所用术语“离液剂”或“离液盐”是指 通过例如但不限于以下方式使蛋白质或核酸无序化的物质改变蛋白质或核酸的二级、三 级或四级结构同时保持一级结构完整。例示性离液剂包括但不限于盐酸胍、硫氰酸胍、硫 氰酸钠、碘化钠、高氯酸钠和尿素。按离液强度由强至弱依次显示，典型的阴离子型离液剂 系列(chaotropicseries)包括CC13C0(T — CNS" — CF3C0(T — CIO; > r — CH3C0(T — Br\ CF 或 CHO”所提及的一些原材料在含离液物质的水系统中不可直接被裂解，以细菌为例，这 是由于它们的细胞壁状况。因此，这些原材料必须经过预处理，例如在被用于本发明的方法 之前用水解酶预处理。RNA和蛋白质的分离中最重要的一个方面是防止它们在分离步骤期间降解。因此， 用于裂解生物样品的现有试剂优选为含有大量离液离子的溶液。该裂解缓冲液随即灭活几 乎所有酶，防止RNA和蛋白质的酶解。所述裂解液包含浓度为0. 1-10M(例如1-10M)的离 液物质。作为所述离液物质，尤其可采用盐，例如高氯酸钠、氯化胍、异硫氰酸胍/硫氰酸 胍、碘化钠、碘化钾和/或其组合。优选的是，所述裂解液还包含还原剂，所述还原剂通过离液剂促进RNase变性并 且有助于分离未降解的RNA。优选的是，所述还原剂为2-氨基乙硫醇、三-羧基乙基膦 (TCEP)或巯基乙醇。
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任选地，所述裂解液还包含非离子型表面活性剂(即去污剂)。去污剂的存在能够使基因组DNA与矿物支持体选择性结合。例示性非离子型表面活性剂包括 但不限于叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )、(辛基苯氧基)聚氧乙氧 基乙醇(IGEPALtmCA-630/NP-40)、三甘醇单月桂基醚(BRIJ 30)、失水山梨醇单月桂 酸酯(sorbitari monolaurate) (SPAN 20)或化学品的聚山梨酯家族，诸如聚山梨 酯20 (即TTOEN 20)。其它市售的聚山梨酯包括TWEEN 40、TWEEN 60和TWEEN 80(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)。这些和其它相关化学品中任一种可有效作为TWEEN 20的代替品。用于选择性结合双链核酸的非离子型去污剂的有效量可随不同的去污剂而稍作 变化。然而，各种去污剂(或去污剂的组合)的最佳浓度可很容易通过一些简单的实验 来确定。具体而言，已发现终浓度在0. 5%以上的去污剂对于选择性结合双链核酸而言是 有效的。在某些实施方案中，有效浓度为0.5%-约10%。在优选的实施方案中，浓度为
-8%。还应注意到的是可合并超过一种的非离子型去污剂，只要去污剂的合并浓度在 0. 5% -约10%的范围内即可。已发现一定浓度下，去污剂的存在不仅提高了核酸的回收而且减少了被纯化的单 链核酸中双链核酸的污染。这通过提高基因组DNA与二氧化硅膜的结合来至少部分地实 现。在优选实施方案中，所述裂解液包含NP-40 (IGEPAL CA-630)。在最优选实施方案 中，所述裂解液包含盐酸胍、TWEEN 20、NP-40和β -巯基乙醇。本发明的裂解液还优选包含足量的缓冲液以维持所述溶液的ρΗ。对于同时分离 RNA、DNA和蛋白质而言，ρΗ应保持在约5_8的范围内。裂解液中采用的优选缓冲液包括 三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、磷酸钠、醋酸钠、四硼酸钠-硼酸和甘氨酸-氢 氧化钠。生物样品一旦裂解后，则将含细胞组分的水溶液上样至矿物支持体。已发现在裂 解液(含一定量的非离子型去污剂)的条件下，几乎所有的基因组DNA结合到第一矿物支 持体，而总RNA和蛋白质不结合并通过简单的离心(spin)作为流过液收集。所述矿物支持体优选由以下组成多孔或无孔的金属氧化物或混合金属氧化物、 硅胶、二氧化硅膜、主要由玻璃组成的材料(诸如未改性的玻璃颗粒、玻璃粉)、石英、氧化 铝、沸石、二氧化钛或二氧化锆。矿物支持体材料的粒径范围为0. 1 μ m-1000 μ m，孔径为 2-1000 μ m。所述多孔或无孔的支持体材料可以疏松填充物的形式存在或按以下形式被包 含(embody):由玻璃、石英或陶瓷制成的滤层，和/或其中排列有硅胶的膜，和/或由石英 或玻璃纤维的矿物支持体和织物制成的颗粒或纤维，以及带有或不带有官能团的乳胶颗 粒，或由聚乙烯、聚丙烯或聚偏二氟乙烯(特别是超高分子量聚乙烯和高密度聚乙烯)制成 的多孔材料(frit material)。来自第一矿物支持体的流过液含有总RNA和蛋白质。所述流过液与有机溶液混合 并上样至第二矿物支持体。已发现在某些有机溶液的存在下RNA与矿物支持体结合而蛋白 质则不结合。简单的离心步骤将与矿物支持体结合的RNA从流过液中的蛋白质分离出来。举例而言，极性质子溶剂(如低级脂肪醇)为合适的有机溶剂。优选所述有机溶 剂为偶极非质子溶剂。合适的偶极非质子溶剂包括但不限于丙酮、四氢呋喃(THF)、甲乙酮、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜(DMS0)。更优选地，所述有机溶剂为丙酮 或乙腈。用于RNA结合的第二矿物支持体由与上述的第一矿物支持体相似的材料组成。优 选的是，所述第一矿物支持体和第二矿物支持体各自为二氧化硅膜。应预见的是，在某些应用中使基因组DNA和RNA两者一同与相同的矿物柱结合将 是有利的。这可通过在第一柱加样之前加入有机溶剂(诸如偶极非质子溶剂)来实现。DNA 和RNA的分离可通过常规技术，例如通过控制洗脱条件来实现。或者，可通过酶反应去除所 述核酸中的一种。在任选进行洗涤步骤后，吸附于第一矿物支持体上的双链核酸和吸附于第二矿物 支持体上的单链核酸可分别在低离子强度的条件下或用水洗脱。任选地，洗涤步骤还可在相应的核酸(单链核酸或双链核酸)的洗脱之前进行。对 于纯化双链的基因组DNA而言，用裂解缓冲液对第一矿物支持体(即柱)的任选洗涤去除 了任何残留量的RNA。此外，含高浓度的有机溶剂(如低级脂肪醇)的洗涤缓冲液可用于基 因组DNA和RNA两者的纯化，以通过快速离心步骤去除所需核酸之外的组分。根据图1中说明的流程和如以下实施例2和3进一步描述的实验条件，已成功地 从生物样品中纯化DNA和总RNA。表1出示了利用培养细胞和大鼠肝组织所得的DNA和总 RNA的分离数据。通过比较当前行业标准或其它市售纯化试剂盒，从这些实验中得到高质量 的核酸(参见下文)。表1 从9个样品中各自分离DNA和总RNA。
流过液中的蛋白质可用本身已知的方法(例如沉淀、凝胶过滤或疏水作用色谱 (HIC))进一步纯化。优选所述蛋白质通过沉淀来纯化。更优选所述蛋白质在二价金属阳离 子存在下通过沉淀来纯化。最优选地，所述蛋白质在ZnS04#在下通过沉淀分离。表2显 示了采用不同的下游蛋白质分离方法可得到的蛋白质产量。表2 采用不同的下游蛋白质分离方案的蛋白质产量。
本发明还提供了用于从同一样品分离小RNA的方法。简单来说，通过上述方法纯 化的总RNA相对于从其它的市售方案中分离的总RNA含有更高水平的小RNA，因此能够从经纯化的总RNA中分离包括微小RNA在内的小RNA。我们显示，市售的微小RNA分离试剂盒对 于从本方法所得到的总RNA样品中分离小RNA是有效的。所分离的小RNA包含高拷贝数和 低拷贝数的微小RNA。还提供的是用于从生物样品中分离和/或纯化基因组DNA、总RNA和蛋白质的试剂 盒。所述试剂盒包括用于裂解生物样品的裂解液；用于结合基因组DNA的第一矿物支持 体；用于结合RNA的第二矿物支持体；用于从所述第一矿物支持体中洗脱基因组DNA的洗 脱液；用于从所述第二矿物支持体中洗脱RNA的洗脱液以及有机溶剂例如丙酮。任选地，所 述试剂盒还包括用于在基因组DNA和RNA结合各自的矿物支持体后从流过液中分离蛋白质 的工具，以及使用手册。优选地，试剂盒中的裂解液包含离液盐、非离子型去污剂和还原剂。最优选地，所 述裂解液包含盐酸胍、TWEEN 20、NP-40和巯基乙醇。所述矿物支持体可按疏松填充，固定在两个装置(means)之间，或者以布置在柱 的中空壳体内的膜的形式存在。优选地，所述第一矿物支持体和第二矿物支持体各自为二
氧化硅膜。本发明的其它特征和优点将通过以下的实施例和权利要求显而易见。 实施例以下实施例用于根据本发明的实施方案阐述用于从单个来源中分离基因组DNA、 RNA和蛋白质的方法，而并不旨在限制。溶液和方案1.实施例中采用的溶液和柱 2.样品破碎和匀浆化2. 1细胞破碎和勻浆化a.通过在8000xg离心1分钟将lxlO6培养细胞沉淀在1. 5ml微量离心管中。b.通过抽吸完全去除上清液。c.加入350 u 1裂解缓冲液(含3 -ME)。
d.旋涡振荡以使细胞沉淀重新悬浮。e.使所述裂解液通过安装在无RNA酶和DNA酶的注射器上的20规针至少5次来 使所述裂解液勻浆化。f 进行步骤3。2. 2 利用 P0LYTR0N 勻浆器(Kinematica AG, Switzerland)进行组织破碎和勻浆 化a.将10mg组织置于合适尺寸的管中。b.加入350 u 1裂解缓冲液(含3 -ME)。c.根据P0LYTR0N 的使用手册将组织勻浆化。d.肉眼观察所制备的勻浆并确保已彻底勻浆化。e 进行步骤3。2. 3利用研钵和研杵破碎组织后用针头和注射器勻浆化a.将已称重的组织迅速置于液氮中，并用研钵和研杵充分研磨。b.将组织粉末和液氮滗至无RNA酶、用液氮冷却的2ml微量离心管中。c.使液氮挥发，但不让组织解冻。d.加入适当体积的裂解缓冲液，并将裂解液通过安装在无RNA酶的注射器上的20 规针至少5次来勻浆化。3. rDNA 的纯化3. lgDNA 的结合a.将新的离心柱置于新的收集管中。b.将步骤2中所勻浆化的裂解液(约350 u 1)转移至柱中。c. llOOOxg 离心 1 分钟。d.保存流过液用于RNA和蛋白质的纯化。e.将柱转移至新的2ml收集管中。3. 2柱的洗涤a.将500 u 1裂解缓冲液加入柱中。b. llOOOxg离心1分钟。弃去流过液。c.将柱放回相同的收集管中。d.将500 U 1洗涤缓冲液加入柱中。e. llOOOxg 离心 1 分钟。f.将柱转移至无DNA酶的1. 5ml微量离心管中。3. 3gDNA 的洗脱a.将100 ill gDNA洗脱缓冲液加入柱的中心。b. 8000xg 离心 1 分钟。c.弃柱并将含纯的gDNA的管储存于-20°C。4.总RNA的纯化4. 1RNA 的结合a.将新的离心柱置于新的收集管中。b.将350iill00%丙酮加入步骤3. 1. d的流过液中。通过上下移液数次充分混合。
12将全部混合液转移至柱中。c. llOOOxg 离心 1 分钟。d.保存流过液用于蛋白质的纯化。e.转移柱至新的2ml收集管中。4. 2柱的洗涤a.加入500 u 1洗涤缓冲液至柱中。b. llOOOxg 离心 1 分钟。c.转移柱至无RNA酶的1. 5ml微量离心管中。4. 3RNA 的洗脱a.将100 u 1洗脱缓冲液加入柱的中心。b. 8000xg 离心 1 分钟。c.弃柱并将含纯的RNA的管储存于_80°C待用。5.用 2-D Clean-Up 试剂盒(GE Healthcare)纯化总蛋白质注除非另外说明，否则所有步骤应在冰上进行。5.1蛋白质沉淀a.用步骤4. 1的流过液作为用于蛋白质沉淀的起点。充分混合并将100 yl流过 液转移至新的1. 5ml的微量离心管中。b.加入300沉淀剂并充分混合。冰上孵育15分钟。c.加入300共沉淀剂至混合物中。简单混合。d.将管以最大转速离心5分钟。e.通过移液或滗出尽可能完全地去除上清液。f.加入40 U 1共沉淀剂至沉淀上，并在冰上孵育5分钟。g.将管以最大转速离心5分钟。小心地去除并弃掉上清液。5. 2蛋白质沉淀的洗涤a.用移液枪加入25 yl去离子水至沉淀中。旋涡振荡管5分钟。b.加入1ml预冷的洗涤缓冲液和5 u 1洗涤添加剂至各管中。剧烈旋涡振荡(注 沉淀不溶于洗涤缓冲液)。c.在_20°C下孵育管30分钟，每10分钟旋涡振荡一次，每次20-30秒。d.将管以最大转速离心5分钟。e.小心地去除并弃掉上清。此步骤中应可见白色沉淀。f.保持盖子打开，在室温下干燥沉淀多至5分钟。5. 3蛋白质沉淀的重新悬浮a.加入多至lOOiU的5%SDS或7M尿素并剧烈混合以溶解蛋白质沉淀。用移液 枪的枪头破碎沉淀。b.在95°C下孵育3分钟以完全溶解蛋白质并使其变性。然后将样品冷却至室温。c. llOOOxg离心1分钟以沉淀任何残留的不溶性物质。上清液用于下游的应用，即 SDS-PAGE和蛋白印迹。样品可在-20°C下储存数月或在4°C下储存数天。6.总蛋白质的分离(用ZnSCX沉淀)
6.1蛋白质的沉淀a.利用步骤4. 1. d中的流过液作为蛋白质沉淀的起点。b.加入 60011110%的21^04溶液。c.剧烈混合并在室温下孵育10分钟以沉淀蛋白质。d. 16000xg 离心 10 分钟。e.通过移液或滗出小心地去除上清液。6. 2洗涤蛋白质沉淀a.将500 ill的50%乙醇加入蛋白质沉淀中。b. 16000xg 离心 1 分钟。c.通过用移液枪吸走或通过滗出尽可能多的液体来去除上清液。d.保持盖子打开并在室温下干燥沉淀5-10分钟。6. 3蛋白质沉淀的重新悬浮a.为了定量蛋白质，在SDS-PAGE前，加入至少lOOiil的5% SDS(或7M尿素)并 剧烈混合以溶解蛋白质沉淀。用移液枪的枪头破碎沉淀。b.若有需要，加入多至1ml的5% SDS (或7M尿素)以完全溶解沉淀。c.在95°C下孵育5分钟以完全溶解蛋白质并使其变性。剧烈旋涡振荡。d.使样品在室温下冷却5分钟。e. llOOOxg 离心 1 分钟。f.将上清液转移至新的1. 5ml的微量离心管中。g.用上清液进行SDS-PAGE和蛋白印迹。h.样品在-20°C下储存数月或在4°C下储存数天。实施例1 流程的优化在努力寻找最佳流程中，我们测试了用于从海拉细胞培养物中提取和纯化基因组 DNA、总RNA和总蛋白质的多种溶液和添加剂。我们发现，含有7M盐酸胍、50mM Tris_HCl、pH 7 (含或不含去污剂，例如5% NP-40 或TWEEN 20)的混合液的裂解缓冲液在还原剂(例如TCEP或0-ME)存在下很有效。或 者，含7M盐酸胍、50mM Tris_HCl、pH 5 (含去污剂，例如5% NP-40)的混合液的裂解缓冲液 在还原剂(例如TCEP或0-ME)存在下也很有效。生物样品当与任一溶液混合时，根据以 上提供的方案勻浆化并加样到二氧化硅膜柱上。快速离心(spin)去除以作为流过液的混 合液并使基因组DNA与柱结合。根据以上方案进一步地处理含基因组DNA的柱以分离纯的 基因组DNA。所述流过液含有总RNA和蛋白质。对于进一步地使总RNA与蛋白质分离，发现0. 7 体积的丙酮能有效地使总RNA选择性吸附于二氧化硅膜柱。因此，将0. 7体积的丙酮加入 流过液中，然后将所述混合液加样到二氧化硅膜柱中。快速离心分离作为现含有蛋白质的 流过液的混合液和上面结合有RNA的柱。根据上述方案进一步地处理柱以分离纯的RNA，而 流过液用于蛋白质的纯化。我们还测试了极性质子溶剂如低级脂肪醇和偶极非质子溶剂。正如预期，低级脂 肪醇能够使RNA与二氧化硅膜柱结合。我们发现许多偶极非质子溶剂也可以用于该目的。 具体而言，我们发现丙酮和乙腈比其它溶剂更优选，但发现其它的被试偶极非质子溶剂也有效(数据未显示)。图2显示了从本方法分离的基因组DNA和总RNA的凝胶图像。原材料是lxlO6的 海拉细胞。裂解液包含 7M GuHCl、50mMTris-HCl、pH 7,5% TWEEN 20 禾口 1%TCEP。在加 样至第二矿物支持体之前，将流过液与丙酮或乙腈混合。其它步骤如上进行。以200iU终 体积洗脱基因组DNA。以lOOyl终体积洗脱总RNA。每条凝胶泳道含10 yl的经洗脱的样 品。清楚的是所述方案对于分离和纯化基因组DNA和总RNA两者十分有效(泳道1-3 用 丙酮分离总RNA ；4-5 用乙腈分离总RNA ；M 入HindHI标记)。实施例2 从培养细胞』中分离某因鉬DNA、RNA和蛋白质用培养细胞进一步测试了流程的性能。我们还测试了所述流程与市售产品(即 AllPr印试剂盒(Qiagen Inc. , Valencia, CA)和 NUCLEOSPIN RNA/Protein 试剂盒(加上 DNA洗脱缓冲组套(set)，MACHEREY-NAGEL GmbH&Co. KG, Germany)的对比。处理多种样品 以评价方案的一致性。产物的纯度通过紫外分光光度计和凝胶分析评价。所得样品还可在 下游应用例如实时PCR、RT-PCR和蛋白印迹实验中评价。我们的结果显示上述方案一致性 有效并且十分适用于经培养的细胞。我们从lxlO7海拉细胞培养物开始。在制备开始前沉淀细胞并将其稀释至lxlO6 的等份。三名操作人员各自用等份之一遵循上述或生产商的相同方案。不进行各种方案 的任选步骤。在第一天分离基因组DNA和RNA。在第二天用以下三种不同的方法进一步纯 化蛋白质流过液2_D Clean-Up 试剂盒(GE Healthcare, Piscataway, NJ)、NUCLEOSPIN Protein Pecipitator试剂盒(Macherey-Nagel)禾口 AllPrep Protein Precipitation试剂 盒(Qiagen)。基因组DNA和总RNA分离产量的结果在上表1中显示。蛋白质纯化产量的结果在 上表2中显示。可以看出，所述方案在分离基因组DNA、总RNA和蛋白质方面产生了一致且 高质量的结果。还通过琼脂糖凝胶分析检测基因组DNA和RNA的纯度。图3显示了所分离的基因 组DNA和RNA样品与市售产品对比的凝胶图像。上总RNA ；下基因组DNA。左侧凝胶显示 了从培养的海拉细胞中分离的核酸样品。右侧凝胶显示了从大鼠肝组织中分离的核酸样品 (参见实施例3)。M:标记人/Hind Ill(lOOng) ；D 大鼠的基因组DNA对照(400ng) ；R 大 鼠肝的总RNA对照(600ng)。对于基因组DNA，本方法和NUCLEOSPIN 为每孔加样2 yl，而 AllPr印加样4iil。对于总RNA，本方法和AllPr印为每孔加样5iil，而NUCLEOSPIN 加样 3 yl。从凝胶图像清楚可见所分离的基因组DNA和RNA是纯的并且几乎不交叉污染。我们还利用 Agilent Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.，Santa Clara， CA)分析所分离的总RNA。同样地，该图像显示了从不同方案得到的相似结果(图4)。经纯化的基因组DNA的质量通过实时PCR测定评价。实时PCR反应如下设定每 个样品采用lOOng的经纯化的基因组DNA，在GELSTAR 染料存在下(Cambrex，Baltimore, MD)用 PuReTaqREADY-T0-G0 PCR 珠(GE Healthcare, Piscataway, NJ)，并采用特异性针 对GAPDH基因的引物。实时PCR反应用水将基因组DNA模板稀释至20ng/ u 1。 在 ABI7900HT 快速实时 PCR 系统(Applied Biosystems Inc.，Foster City, CA) 上监测扩增，按照以下循环条件 信号的量与GAPDH基因的扩增密切相关。信号升高在本底阈值之上的点被定义为 扩增的Ct值。所有被试样品显示出非常相似的扩增概况(图5)。类似地，总RNA通过实时RT-PCR检测。图6显示了得到的扩增结果，该结果具有 在包括来自市售产品的样品在内的样品中观察到的非常相似的扩增概况。所分离的蛋白质在SDS-PAGE凝胶上用考马斯染色分析。来自RNA柱的流过液用 改良的2-D Clean-Up试剂盒方案进行处理。所沉淀的蛋白质用50 yl的5% SDS复溶。将 5ul的样品蛋白质加样至各孔。图7显示了用本发明的方案从海拉细胞培养物中分离的总 蛋白质，可比得上用市售产品(AllPr印)的方案分离的总蛋白质。还利用蛋白印迹实验用抗0肌动蛋白抗体分析蛋白质样品并与市售产品比较。结果在图 8 中示出。M :Full_Range RainbowMolecular Weight Markers (GE Healthcare)。 第1-2条、第6-7条和第10条泳道用2-D Clean-Up试剂盒的本方案的流过液。第3_4 条和第 8-9 条泳道 AllPrep Protein ppt。第 5 条泳道，用 Macherey-Nagel Protein Pecipitator的NUCLE0SPIN 流过液。对于从海拉细胞中分离的蛋白质，每孔用5 y g，对于 从组织中分离的蛋白质，每孔采用10 y g(参见实施例3)。经纯化的基因组DNA、RNA和蛋白质的分析清楚地表明该流程对于培养细胞很有 效。实施例3 从组织样品中分离基因组DNA、RNA和蛋白质我们用多种组织来源检测了所述流程的性能，包括大鼠的肝、脾和肺。我们还检测 了所述流程与市售产品(即AllPr印试剂盒和NUCLE0SPIN RNA/Protein试剂盒(加上DNA 洗脱缓冲组套)的对比。处理多种样品以评价方案的一致性。产物的纯度通过紫外分光光 度计和凝胶分析测量。所得到的基因组DNA还在下游应用中评价，例如实时PCR、RT-PCR和 蛋白印迹实验。我们的结果显示上述方案效果一致并且十分适用于组织样品。作为实例，本文提供了用于从大鼠肝分离基因组DNA、RNA和蛋白质的细节。用 P0LYTR0N 勻浆器将10mg大鼠肝组织勻浆化。该实验与实施例2的实验设计相似。简单 来说，三名操作人员各自根据上述或生产商的相同方案处理等份的裂解液。不进行每种方 案中的任选步骤。在第一天分离基因组DNA和RNA。在第二天用以下不同的方法进一步地 纯化蛋白质流过液，包括2-DClean-Up试剂盒，NUCLE0SPIN Protein Pecipitator试剂 盒禾口 AllPrep Protein Precipitation 试剂盒。基因组DNA和总RNA的分离结果在上表1中显示。蛋白质分离结果在上表2中显 示。从结果可以看出所述方案制备出一致的、高质量的基因组DNA、总RNA和蛋白质。基因组DNA和RNA的纯度还通过琼脂糖凝胶分析检测。图3显示了所分离的基因 组DNA和RNA样品的凝胶图像(细节参见实施例2)。从凝胶图像明显看出所分离的基因组 DNA和RNA是纯的并且几乎不具有交叉污染。我们还利用Agilent Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.，Santa Clara, CA)分析了所分离的总RNA。同样地，该图像显示在不 同方案中的相似结果(图9)。经纯化的基因组DNA的质量通过实时PCR测定评价。根据实施例2的方案，每种 样品采用lOOng经纯化的基因组DNA设定实时反应(图10)。类似地，通过实时RT-PCR检 测总RNA。图11显示了所得到的扩增结果，该结果具有在包括来自市售产品的样品在内的 样品中观察到的非常相似的扩增概况。所分离的蛋白质在SDS-PAFE凝胶上用考马斯染色分析。来自本方案的蛋白质流 过液用多种方法进行处理，所述方法包括用不同量的21^04或11^沉淀。所沉淀的蛋白质用 700 ill的5% SDS复溶。将lOiU样品加样到每孔中。图12显示，在不同的沉淀方案中从 大鼠肝中分离的总蛋白质概况是类似的。图13显示了来自本方案的蛋白质流过液可用2-D Clean-Up试剂盒和Macherey-NagelProtein Precipitator试剂盒进一步纯化。产量与市 售的AllPr印试剂盒或NUCLE0SPIN 试剂盒的产量类似(图13)。还采用蛋白印迹实验分析所述蛋白质样品并与市售产品作比较(图8，详见实施 例2)。经纯化的基因组DNA、RNA和蛋白质的分析清楚地证明该流程对于组织样品很有
如实施例2和3所阐述，我们的含2% TWEEN 20的标准裂解缓冲液很有效。然 而，我们发现在第一实例中增大的非离子型去污剂的量提高基因组DNA与二氧化硅膜的结 合，从而增大了基因组DNA和总RNA的回收。因此，实施例1用含5% TWEEN 20的裂解缓 冲液进行。增大去污剂水平的另外的益处是所分离的总RNA中基因组DNA的交叉污染的减 少，这至少部分是由于在第一实例中基因组DNA与二氧化硅膜结合的提高。我们发现许多非离子型去污剂(例如TWEEN 20、NP-40、TRITON X-100 )中任 一种可实现该效果。这些去污剂的各种组合也是有效的。此外，增大的去污剂的量可作为 裂解液的一部分，或者其可恰好在样品与二氧化硅膜柱结合之前加入。我们在此出示了用 TWEEN 20和NP-40的最佳结合所得的结果。即在裂解缓冲液中用2% TWEEN 20和5% NP-40的组合代替2% TWEEN 20。虽然其它的溶液和方案按照实施例的开始部分所述来使 用和进行，但去污剂的组合和水平的调整导致所分离的总RNA中基因组DNA污染的极大减 少。此外，基因组DNA和总RNA两者的产量也增加了。通过增大裂解缓冲液中去污剂的水 平，并不对总蛋白质的分离有不利影响(数据未显示)。图14出示了从各lxlO6细胞的海 拉细胞样品中所得的凝胶图像和产量。图15出示了从大鼠肝样品(各10mg)中所得的凝 胶图像和产量。实施例5 所分离的总RNA含有高水平的小RNA在所分离的总RNA中，我们观察到高浓度的小RNA分子(参见图14和图15)。我 们在此出示的数据显示了从上述方案中纯化的总RNA样品中富集并分离小RNA(长度小于 200nt)，并将所分离的小RNA与利用市售的微小RNA分离试剂盒分离的小RNA比较。我们首先采用Qiagen的市售试剂盒(miRNeasy Mini Kit Qiagen，产品编号 217004)从根据本发明分离的总RNA中纯化小RNA。简单来说，根据市售试剂盒的方案用 上述分离的30 y g总RNA(相当于与从10mg大鼠肝组织中分离的总RNA的约2/3)纯化小 RNA。作为对照，还采用miRNeasy Mini试剂盒中提供的方案从10mg大鼠肝组织中直接分 离小RNA。图16显示了结果。第1、2、3条泳道为从根据本方案分离的总RNA中纯化的小 RNA。标记为C的泳道显示了从大鼠肝组织中直接分离的对照小RNA。我们还将所分离的总 RNA作为另一对照运行(例如泳道标记为输入)。清楚的是，遵照本方法比直接从组织样品 分离可分离到更多的小RNA。为了验证所分离的小RNA含有微小RNA，我们用各种拷贝数的不同的微小RNA进行 qRT-PCR测定。我们成功地检测到样品中的全部四种微小RNA(图17)。因此我们利用市售 试剂盒从本方法中纯化的总RNA中成功地分离到了微小RNA。我们还就所分离的总RNA中小RNA的存在情况和丰富程度将我们的方案与市售产 品作比较。我们选择Qiagen的AllPr印和Norgen的RNA/DNA/Protein纯化试剂盒。两者 都被推荐用于同时分离基因组DNA、总RNA和蛋白质。我们利用这些试剂盒以及我们自己的 方案分离总RNA。然后我们试图利用miRNeasy Mini试剂盒从总RNA中分离小RNA。结果 在图18中显示。小RNA在下面凝胶中显示，而“大”RNA(除去了小RNA的总RNA)在上面凝 胶中显示。本方法(cm)和AllPr印试剂盒(Q)中的输入总RNA作为对照显示。我们估计， 利用我们的方案分离的总RNA所含的小RNA超过10%，而从其它的试剂盒分离的总RNA所含的小RNA低于3%。 本文提及的所有专利、专利申请和其它公布的参考文献在此全部引作参考，其程 度如同各自具体并单独地通过参考引入到本文中。虽然描述了本发明优选的阐述性实施方 案，但本领域的技术人员应理解的是本发明可通过所述实施方案之外的方案实践，其仅以 阐述性的目的而并非限制性的方式示出。本发明仅受限于以上的权利要求。
权利要求
一种用于分离和/或纯化至少两种细胞组分的方法，所述细胞组分选自基因组DNA、总RNA和蛋白质，所述方法包括a)通过用裂解液裂解生物样品，产生含所述细胞组分的水溶液；b)将所述水溶液在使得基因组DNA结合第一矿物支持体的条件下上样至所述第一矿物支持体；c)收集含有未结合的RNA和蛋白质的流过液；d)将步骤(c)中的所述流过液与偶极非质子溶剂混合以形成混合液，然后将所述混合液在使得RNA结合第二矿物支持体的条件下上样至所述第二矿物支持体；和(e)收集含蛋白质的流过液。
2.权利要求1的方法，所述方法还包括洗涤所述第一矿物支持体和从所述第一矿物支 持体中洗脱基因组DNA。
3.权利要求1的方法，所述方法还包括洗涤所述第二矿物支持体和从所述第二矿物支 持体中洗脱RNA。
4.权利要求1的方法，所述方法还包括从步骤(e)的流过液中纯化蛋白质。
5.权利要求4的方法，其中所述蛋白质通过沉淀、凝胶过滤或疏水作用色谱(HIC)纯化。
6.权利要求1的方法，其中所述裂解液包含离液盐、非离子型去污剂和还原剂。
7.权利要求6的方法，其中所述离液盐为盐酸胍。
8.权利要求6的方法，其中所述非离子型去污剂选自三甘醇单月桂基醚、(辛基苯氧 基)聚乙氧基乙醇、失水山梨醇单月桂酸酯、叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇、聚山梨酯20、聚 山梨酯40、聚山梨酯60和聚山梨酯80或其组合。
9.权利要求8的方法，其中所述非离子型去污剂或其组合的范围为0.1-10%。
10.权利要求1的方法，其中所述裂解液包含1-10M盐酸胍、0.1-10% TWEEN 20和 0. 1-10% NP-40。
11.权利要求1的方法，其中所述第一矿物支持体和第二矿物支持体是多孔或无孔的， 并且由金属氧化物或混合金属氧化物、硅胶、二氧化硅膜、玻璃颗粒、玻璃粉、石英、氧化铝、 沸石、二氧化钛或二氧化锆组成。
12.权利要求1的方法，其中所述第一矿物支持体和第二矿物支持体各自为二氧化硅膜。
13.权利要求1的方法，其中所述偶极非质子溶剂选自丙酮、乙腈、四氢呋喃(THF)、甲 乙酮、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜。
14.权利要求1的方法，其中所述生物样品选自培养细胞、微生物、植物、动物或酶反 应的混合物。
15.一种用于分离微小RNA的方法，所述方法包括使从权利要求3中洗脱的总RNA接受 一个或多个另外的分离步骤以纯化微小RNA。
16.一种用于从单个生物样品中分离和/或纯化基因组DNA、总RNA和蛋白质的试剂 盒，所述试剂盒包含a)用于裂解生物样品的裂解液；b)用于结合基因组DNA的第一矿物支持体；c)用于结合RNA的第二矿物支持体；d)用于从所述第一矿物支持体中洗脱基因组DNA的洗脱液；e)用于从所述第二矿物支持体中洗脱RNA的洗脱液； 任选地，所述试剂盒还包含用于在基因组DNA和RNA结合各自的矿物支持体后从流过液中分离蛋白质的工具。
17.权利要求16的试剂盒，其中所述裂解液包含离液盐、非离子型去污剂和还原剂。
18.权利要求16的试剂盒，其中所述第一矿物支持体和所述第二矿物支持体各自为二氧化硅膜。
19.权利要求16的试剂盒，其中所述试剂盒还包含偶极非质子溶剂，所述偶极非质子 溶剂选自丙酮、四氢呋喃(THF)、甲乙酮、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜。
全文摘要
本发明提供了用于分离和/或纯化至少两种细胞组分的系统、方法和试剂盒，所述细胞组分选自基因组DNA、RNA和蛋白质。所述方法包括首先裂解生物样品，得到含所述细胞组分的水溶液；然后将所述水溶液在使基因组DNA结合的条件下上样至第一矿物支持体；收集合有未结合的总RNA和蛋白质的流过液。所述方法还包括将所述流过液在使RNA结合的条件下上样至第二矿物支持体，收集含蛋白质的流过液。可洗脱被结合的基因组DNA和总RNA，而流过液中的蛋白质可进一步地被纯化。此外，所分离的总RNA可被用于分离诸如微小RNA的小RNA。
文档编号C12N15/10GK101878304SQ200880118888
公开日2010年11月3日 申请日期2008年11月25日 优先权日2007年11月30日
发明者M·S·布里格斯, R·E·布鲁诺, R·杜利帕拉, Y·C·蔡, 蒋淼 申请人:通用电气医疗集团生物科学公司