线粒体基因组9bp序列基因多态性在评价苯中毒风险中的应用的制作方法

本发明涉及生物医学领域，具体涉及线粒体基因组9bp序列基因多态性在评价苯中毒风险中的应用。

背景技术：

近年来，苯及苯系物中毒病例报道逐年上升，苯中毒后致白血病死亡病例也逐年上升，危害非常严重。研究表明，苯中毒主要是中间活性代谢产物作用于线粒体通过氧化损伤引起的。慢性苯中毒的发生除了与苯的接触浓度有关，还与接触者的遗传易感性有关。

线粒体细胞色素C氧化酶亚单位II基因(简称MTCO2基因)和线粒体tRNA赖氨酸基因(简称MTTK基因)间的小片段非编码序列含有2个串联重复的9bp序列(核苷酸序列为：5′-CCCCCTCTACCCCCTCTA-3′)，其还存在插入/缺失多态性：3个串联重复的9bp序列即为插入型(核苷酸序列为：5′-CCCCCTCTACCCCCTCTACCCCCTCTA-3′)，1个9bp序列即为缺失型(核苷酸序列为：5′-CCCCCTCTA-3′)。缺失型与多种遗传疾病的发生有关，但未见与苯中毒的发生相关的报道。

血小板的主要细胞器之一是线粒体，线粒体是其唯一具有遗传功能的细胞器，血小板线粒体相对白细胞线粒体DNA它不受人类染色体其它同源序列基因的干扰，提取血小板的基因组DNA可对线粒体基因组DNA进行分析更有优势。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是如何评价待测者从事苯暴露工作时发生慢性苯中毒的风险性的高低。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于检测线粒体中具有“2个串联重复的9bp序列”还是“2个串联重复的9bp序列的缺失型”的物质在制备评价慢性苯中毒风险性的产品中的应用。

为解决上述技术问题，本发明还提供了用于检测线粒体中具有“2个串联重复的9bp序列”还是“2个串联重复的9bp序列的缺失型”的物质在评价慢性苯中毒风险性中的应用。

如果线粒体中具有“2个串联重复的9bp序列”，待测者慢性苯中毒风险性较低。如果线粒体中具有“2个串联重复的9bp序列的缺失型”，待测者慢性苯中毒风险性较高。线粒体中具有“2个串联重复的9bp序列”的待测者慢性苯中毒风险性低于线粒体中具有“2个串联重复的9bp序列的缺失型”的待测者。

上述应用中，所述“用于检测线粒体中具有“2个串联重复的9bp序列”还是“2个串联重复的9bp序列的缺失型”的物质”可为特异引物对，所述特异引物对由引物F和引物R组成；

所述引物F可为如下a1)或a2)：

a1)序列表的序列2所示的单链DNA分子；

a2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；

所述引物R可为如下a3)或a4)：

a3)序列表的序列3所示的单链DNA分子；

a4)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明提供的引物F和引物R的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明设计的引物F和引物R的核苷酸序列具有85％或者更高同一性的核苷酸，且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种评价慢性苯中毒风险性的产品。

本发明所提供的评价慢性苯中毒风险性的产品，可包括用于检测线粒体中具有“2个串联重复的9bp序列”还是“2个串联重复的9bp序列的缺失型”的物质。

上述产品中，所述“包括用于检测线粒体中具有“2个串联重复的9bp序列”还是“2个串联重复的9bp序列的缺失型”的物质”可为所述特异引物对。

所述产品还可包括记载有判断标准的载体。

所述判断标准为判断标准甲或判断标准乙。

判断标准甲：如果线粒体中具有“2个串联重复的9bp序列”，待测者慢性苯中毒风险性较低；如果线粒体中具有“2个串联重复的9bp序列的缺失型”，待测者慢性苯中毒风险性较高。

判断标准乙：线粒体中具有“2个串联重复的9bp序列”的待测者慢性苯中毒风险性低于线粒体中具有“2个串联重复的9bp序列的缺失型”的待测者。

上述任一所述的产品的制备方法也属于本发明的保护范围。

上述任一所述的产品的制备方法可包括将上述任一所述特异引物对中的各引物分别单独包装的步骤。

为解决上述技术问题，本发明还提供了评价待测者发生慢性苯中毒的风险性的方法。

本发明所提供的评价待测者发生慢性苯中毒的风险性的方法为方法一，具体可包括如下步骤：检测待测者线粒体中具有“2个串联重复的9bp序列”还是“2个串联重复的9bp序列的缺失型”；如果线粒体中具有“2个串联重复的9bp序列”，待测者慢性苯中毒风险性较低；如果线粒体中具有“2个串联重复的9bp序列的缺失型”，待测者慢性苯中毒风险性较高。

本发明所提供的评价待测者发生慢性苯中毒的风险性的方法为方法二，具体可包括如下步骤：检测待测者线粒体中具有“2个串联重复的9bp序列”还是“2个串联重复的9bp序列的缺失型”；线粒体中具有“2个串联重复的9bp序列”的待测者慢性苯中毒风险性低于线粒体中具有“2个串联重复的9bp序列的缺失型”的待测者。

“2个串联重复的9bp序列”或“2个串联重复的9bp序列的缺失型”作为标记物在评价慢性苯中毒风险性中的应用也属于本发明的保护范围。

所述特异引物对也属于本发明的保护范围。

所述特异引物对在评价慢性苯中毒风险性中的应用也属于本发明的保护范围。

所述特异引物对在制备用于评价慢性苯中毒风险性的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的评价待测者发生慢性苯中毒的风险性的方法为方法三，具体可包括如下步骤：以待测者的线粒体基因组DNA为模板，采用所述特异引物对进行PCR扩增；PCR扩增产物为738bp的待测者慢性苯中毒风险性较低，PCR扩增产物为729bp的待测者慢性苯中毒风险性较高。

本发明所提供的评价待测者发生慢性苯中毒的风险性的方法为方法四，具体可包括如下步骤：以待测者的线粒体基因组DNA为模板，采用所述特异引物对进行PCR扩增，PCR扩增产物为738bp的待测者慢性苯中毒风险性低于PCR扩增产物为729bp的待测者。

上述任一所述高于可为在统计学上的高于。

上述任一所述低于可为在统计学上的低于。

上述任一所述“2个串联重复的9bp序列”可如序列表的序列1所示；

上述任一所述“2个串联重复的9bp序列的缺失型”可为所述“2个串联重复的9bp序列”缺失了第1至9个核苷酸。上述任一所述“2个串联重复的9bp序列的缺失型”可如序列表的序列1自5′末端起第10至18位所示。

上述任一所述慢性苯中毒为职业性慢性苯中毒。

以27名慢性苯中毒的患者作为病例组，以40名正常健康体检者作为对照组，对其线粒体基因组进行研究。结果表明，病例组中具有“2个串联重复的9bp序列的缺失型”的比例(33.3％)显著高于对照组(10.0％)，且两者的差异有统计学意义(χ²＝5.090，P＝0.024)，OR值(95％CI)为4.5(1.21-16.62)。因此，线粒体基因组DNA中具有“2个串联重复的9bp序列的缺失型”的个体发生慢性苯中毒的风险高于线粒体基因组DNA中具有“2个串联重复的9bp序列”的个体发生慢性苯中毒的风险。因此，“2个串联重复的9bp序列的缺失型”与慢性苯中毒风险性有密切联系，可评价慢性苯中毒的风险性。

附图说明

图1为对照组的测序结果。

图2为病例组的测序结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

天净沙系列柱式血液DNA提取试剂为北京天恩泽生物技术有限公司的产品。 Long PCR Master Mix为普洛麦格北京生物技术有限公司。

“2个串联重复的9bp序列”如序列表的序列1所示。“2个串联重复的9bp序列的缺失型”为“2个串联重复的9bp序列”缺失了第1至9个核苷酸。

下述实施例中的各个实验均是在患者的知情同意的前提下进行的，且均签署知情同意书。

实施例1、2个串联重复的9bp序列的缺失型在评价慢性苯中毒风险性中的应用

一、病例的选择

以确诊为慢性苯中毒的患者27名(男性6名，平均年龄39.8±9.6岁；女性21名，平均年龄40.7±5.9岁)进行研究，并依次编号p1-p27。以40名正常健康体检者作为对照(男性24名，平均年龄42.1±8.3岁；女性16名，平均年龄35.3±11.3岁)，并依次编号h1-h40。

将上述27名慢性苯中毒的患者作为病例组，27名慢性苯中毒患者均满足病例组纳入标准。病例组纳入标准：已确诊为职业性慢性苯中毒(GBZ68-2013《职业性苯中毒诊断标准》)。

将上述40名正常健康体检者作为对照组，40名正常健康体检者均满足对照组纳入标准。对照组纳入标准：①无职业性苯接触史；②无吸烟、饮酒史；③无遗传疾病或家族史；④近3个月无内无感染史、服药史；⑤近3个月内无X射线或其他放射线接触史。

二、成套引物的制备

成套引物由引物F：5′-TATGCCCTTTTCCTAACACT-3′(序列表中序列2)和引物R：5′-TTGGGTGATGAGGAATAGTGTAAG-3′(序列表中序列3)组成。

成套引物中，引物F和引物R的摩尔比为1:1。

由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物F和引物R。

三、2个串联重复的9bp序列的缺失型评价慢性苯中毒风险性

1、分别取27名慢性苯中毒的患者和40名正常健康体检者的外周血5mL，置于EDTA抗凝管中，然后100×g离心15min，收集上清液(上清液即为富血小板血浆)。

2、完成步骤1后，取所述上清液，采用天净沙系列柱式血液DNA提取试剂提取DNA，得到线粒体基因组DNA。

3、以线粒体基因组DNA为模板，以步骤二合成的引物F和引物R为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

反应体系为20μL，由10μL Long PCR Master Mix、1μL引物F、1μL引物R、2μL(约5ng)线粒体基因组DNA和6μL双蒸水组成；初始反应体系中，引物F的浓度为0.5μM，引物R的浓度为0.5μM。

反应条件：95℃10s；95℃1min，58℃30s，72℃50s，35次循环；72℃10min。

4、完成步骤3后，取PCR扩增产物，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

对照组测序结果见图1(NC_012920.1为正常人类线粒体基因组参考序列)，病例组测序结果见图2(NC_012920.1为正常人类线粒体基因组参考序列)。结果表明，编号p1至编号p18的慢性苯中毒的患者和编号h1至编号h36的正常健康体检者的PCR扩增产物中均具有2个串联重复的9bp序列；编号p19至编号p27的慢性苯中毒的患者和编号h37至编号h40的正常健康体检者的PCR扩增产物中均具有2个串联重复的9bp序列的缺失型。

5、统计学方法

采用SPSS16.0统计软件分析步骤4获得的实验数据，组间比较采用卡方检验分析(以P<0.05为差异有统计学意义)；采用Logistic回归分析模型比较病例组和对照组的9bp序列的基因型、相对优势比(OR)，95％置信区间(CI)来衡量9bp序列的基因型与慢性苯中毒风险性的相关性。

统计结果见表1：病例组中具有“2个串联重复的9bp序列的缺失型”的比例(33.3％)显著高于对照组(10.0％)，且两者的差异有统计学意义(χ²＝5.090，P＝0.024)，OR值(95％CI)为4.5(1.21-16.62)。结果表明，线粒体基因组DNA中具有“2个串联重复的9bp序列的缺失型”的个体发生慢性苯中毒的风险高于线粒体基因组DNA中具有“2个串联重复的9bp序列”的个体发生慢性苯中毒的风险；所述高于为在统计学上的高于。因此，“2个串联重复的9bp序列的缺失型”与慢性苯中毒风险性有密切联系，可评价慢性苯中毒的风险性。

表1

按照上述步骤，将步骤4替换为步骤B，其它步骤均不变，得到的统计结果与采用上述步骤得到的统计结果基本一致。步骤B为：完成步骤3后，取PCR扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测。检测结果表明，编号p1至编号p18的慢性苯中毒的患者和编号h1至编号h36的正常健康体检者的PCR扩增产物的大小为738bp、则编号p1至编号p18的慢性苯中毒的患者和编号h1至编号h36的正常健康体检者的线粒体基因组DNA中具有“2个串联重复的9bp序列”；编号p19至编号z27的慢性苯中毒的患者和编号h37至编号h40的正常健康体检者的PCR扩增产物的大小为729bp、则编号p19至编号p27的慢性苯中毒的患者和编号h37至编号h40的正常健康体检者的线粒体基因组DNA中具有“2个串联重复的9bp序列的缺失型”；电泳检测结果与步骤4的测序结果得到的结论完全一致。

<110> 深圳市职业病防治院

<120> 线粒体基因组9bp序列基因多态性在评价苯中毒风险中的应用

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