一种水稻粒型基因qSS7及制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域。更具体涉及一种水稻粒型基因qSS7,同时还 涉及一种水稻粒型基因qSS7的制备方法，还涉及一种水稻粒型基因qSS7的用途，具体包含 了一个控制粒型的主效基因qSS7,针对该基因设计分子标记QS1，并利用分子标记技术将 一个控制水稻长粒等位基因导入到短粒品种中，使短粒品种籽粒变长，改良水稻外观品质， 创制品质改良新材料的方法。
【背景技术】
[0002] 水稻是世界上最重要的粮食作物之一。为了满足日益增长的人口对粮食的需求， 育种家一直以来把提高单产作为水稻育种的主攻方向，而忽视了对水稻品质的提高。随着 人们生活水平的日益提高，稻米品质要求越来越高。目前的稻米品质远未达到消费的需求。 因此，改良品质已经成为育种家的迫切任务。
[0003] 水稻品质可分为加工品质、外观品质、蒸煮食味品质和营养品质，其中外观品质和 蒸煮食味品质尤为重要。水稻外观品质包括粒型(一般用粒长、粒宽、长宽比来表示)、垩白 率和垩白度等。国家优质稻谷质量标准明确规定，籼稻一级长宽比不小于2. 8,垩白粒率不 大于10%，垩白度不大于1.0% (GB/T17891-19992000-04-01实施)。粒型对外观品质影响 很大，同时粒型对水稻产量影响也较大。因此，研究者对水稻粒型的遗传研究较为深入，在 水稻12条染色体上已定位了大量控制粒型的数量性状位点（http://www.gramene.org)。 人们也克隆了许多粒型基因，包括GS3、GW5/qSW5、GS5、GW8 和qGL3.1(Fanetal.，2006; Songetal. , 2007；Ayahikoetal. , 2008；ffengetal. , 2008；Lietal. , 2011；ffanget al.，2012;Zhangetal.，2012)。其中GW2、qSW5/GW5和GW8影响产量和外观品质的作用表 现为相反的效应，即增加产量会降低品质，利用它们进行水稻品质改良过程中不能同时兼 顾产量和品质的改良。利用GS3和qGL3. 1虽然可同时改良产量和品质，但由于短粒等位基 因对长粒基因为显性，因此，在水稻育种利用，特别是杂交稻育种中，操作相对复杂，利用起 来较困难。
[0004] 垩白率和垩白度受环境影响很大，由于该性状遗传上受到三倍体胚乳基因型的影 响，遗传机理十分复杂。目前为止，人们虽然定位到了一些影响垩白的QTL，但还没有用图位 克隆法分离鉴定出垩白基因的报道，因此，利用遗传手段降低垩白率和垩白度也具有一定 难度。
[0005] 本发明利用图位克隆法分离得到1个粒型基因qSS7,其来源于热带粳稻的等位基 因增加粒长，改善长宽比。转基因抑制该基因表达可以缩短粒长。根据该基因序列的变异， 设计了该基因的分子标记；通过分子标记辅助选择的方法将该基因导入到水稻短粒品种 中，可以增加粒长和长宽比，减小垩白率和垩白度，极大地改良外观品质，创造品质改良的 水稻新材料。
[0006] 本发明在国内外未见报道，所在课题组尽管公开发表了该基因的精细定位结果， 但未公开发表涉及本
【发明内容】
的文章，本发明在国内外公众未知。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是在于提供了一种改良水稻籽粒外观品质的基因qSS7,其序列为 SEQIDNO. 1所示，其对应的cDNA编码区序列为SEQIDN0. 2所示，编码的氨基酸为SEQ IDN0. 3所示。导入qSS7长粒等位基因能够增加粒长，改善长宽比，减小垩白率和垩白度， 极大地改良外观品质。
[0008] 本发明的另一个目的是在于提供了一种改良水稻籽粒外观品质的基因的制备方 法，该方法易行，操作简便。
[0009] 本发明还有一个目的在于提供了一种基于qSS7基因的分子标记QS1引物，针对 Cypress和珍汕97的qSS7基因序列差异设计基因标记QS1，通过分子标记辅助选择方法， 能够准确、快捷的区分长短粒等位基因。
[0010] 本发明最后一个目的在于提供了一种水稻粒型基因qSS7在改良水稻籽粒外观品 质中的应用，利用基因在水稻染色体片段代换系后代中选择外观品质显著改善、单株产量 不变或有提商、其他品质性状不变的株系，创造品质改良的新材料。
[0011] 为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
[0012] 一种改良水稻籽粒外观品质的基因的制备方法，其步骤是：
[0013] 提取Cypress(来源于国际水稻研究所，编号为：IRGC117282)的DNA，用引物 qs2(左引物：ATATCATACTTATATGGCA，右引物：GACAAGTGGCTATGCTGTAT)进行聚合酶链式反 应（PCR)，PCR程序：94°C预变性5分钟；35个循环（94°C变性40秒；55°C退火40秒；72°C延 伸8分钟)，72°C延伸10分钟；用扩增产物测序，获得Cypress基因全长序列，其序列为SEQ IDNO. 1 所示。
[0014]以Cypress幼穗cDNA为模板，用引物qs3(左引物：ATGCCTCCGGCGAGGGTGCT，右引 物：TCAGCTTGTACTACTAAATG)进行聚合酶链式反应，获得Cypress基因编码序列（⑶S)，其序 列为SEQID N0.2所示。
[0015]利用Primer3 软件（http://frodo.wi.mit.edu/)翻译编码序列（CDS)获得 Cypress的氨基酸序列，由940个氨基酸组成，其序列为SEQIDNO. 3所示。该蛋白分子量 为104211. 9道尔顿，富含丝氨酸（14. 1%)，不稳定系数为73. 47,脂肪系数66. 96,亲水。
[0016] 一种水稻粒型基因qSS7在改良水稻籽粒外观品质中的应用，其步骤如下：
[0017] 1)粒型变短的稳定转基因材料的犾得：
[0018] (1)将该基因3'端234bp的一段cDNA片段连接到RNAi表达载体pDS1301 (Chu ZH，etal.2006)上，构建qSS7抑制表达载体；
[0019] (2)利用根癌农杆菌介导的转基因方法将qSS7抑制表达载体导入到含qSS7区段 的染色体片段代换系Q〇43(Qiuetal.，2012)中，获得转基因植株；
[0020] (3)利用聚合酶链式反应对T0代转基因植株进行阳性检测（图2)，利用RT-PCR的 方法鉴定qSS7的表达，选择表达量下降且粒长变短的单株（图3)，收获单株自交种子；
[0021] (4)将步骤4选留的转基因植株的种子种成家系（T1代），继续利用聚合酶链式反 应对T1代单株进行阳性检测，收种后分析粒型；
[0022] (5)将步骤5选留的转基因植株的种子种成家系（T2代），获得粒型变短的稳定转 基因材料。通过抑制基因qSS7表达得到稳定的短粒株系，直接证实了qSS7控制粒长的功 能。
[0023] 2)粒型变长的转基因材料的获得：
[0024](1)将该基因的CDS(SEQIDN0. 2)，与超表达载体PU1301(ZhaoYetal.，2009) 连接，构建qSS7超表达载体（图5);
[0025] (2)利用根癌农杆菌介导的转基因方法将超表达载体导入到短粒品种中花11 (中 国公开品种）中，获得转基因植株；
[0026] (3)利用聚合酶链式反应对T0代转基因植株进行阳性检测（图6)，收获单株自交 种，测量粒型，获得粒长变长的材料。
[0027] 3)水稻qSS7基因在改良水稻品种珍汕97的应用，其步骤是：
[0028] (1)针对Cypress和珍汕97中（中国公开品种）qSS7的基因序列差异设计一个基 因标记QS1，引物序列为CGATGCTAGGGGCTITTG和CCAGCCTCCCAITGTAGT ;
[0029] (2)以珍汕97为受体，热带粳稻品种Cypress为供体构建含qSS7区段的染色体片 段代换系Q〇43(Qiuetal.，2012)，以珍汕97为母本，Q043为父本杂交，得到F1，F1套袋自 交得到166个单株的F2分离群体。利用基因标记QS1从该分离群体中选择基因qSS7分别 含有来源于Cypress和珍汕97的单株，命名为近等基因系NILCYP和NILZS97;
[0030] (3)对qSS7的近等基因系NILCYP和NILZS97进行产量和品质相关性状考察。与 NILZS97相比，NILCYP能够显著改良粒型和垩白品质(增加粒长1mm，增大长宽比0. 6，减小 粒宽0. 1mm，降低垩白率18%，降低垩白度8%)。选择粒型和垩白品质改良的稳定株系，培育 新材料。
[0031] 本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
[0032] A、qSS7同时增加粒长和长宽比，减小粒宽(增加粒长1mm，增大长宽比0. 6,减小粒 宽0. 1mm)，因此，可以极大地改良水稻外观品质；
[0033]B、qSS7同时减小垩白率和垩白度（降低垩白率18%，降低垩白度8%)，不影响其他 品质和水稻产量。在利用该基因改良水稻外观品质时，不用担心其他品质和产量受到负面 影响；
[0034]C、遗传上qSS7表现出长粒对短粒为显性（Qiuetal.，2012)，因此在杂交稻选育 过程中，只需改良杂交组合的其中一个亲本，方法易行，操作简便。
[0035]D、本方法针对qSS7设计了基因标记，可以在苗期鉴定出长短粒等位基因，剔除不 需要的杂合及纯和短粒基因型植株(剔除比例占总体样本的3/4,排除了选育后代粒型存在 分离的可能，至少减少一季的选育环节。因此，在品质育种实践中可以缩小后代选育材料的 面积75%、提高基因选择准确性、缩短育种进程。
【附图说明】
[0036] 图1为一种抑制表达载体构建不意图。
[0037] 先将qSS73'端234bp的一段cDNA片段连接到RNAi表达载体pDS1301上，形成中 间载体，再将该片段连接到中间载体，形成抑制表达载体。
[0038] 图2为一种T0代转基因植株阳性检测示意图。
[0039] 第1泳道为空白（灭菌双蒸水，d2H20)，第2-12泳道为部分T0代转基因植株扩增结 果。其中有10个单株为转基因阳性。
[0040] 图3为RT-PCR检测TO代转基因植株中qSS7的表达量示意图。
[0041] 上排qSS7的表达量，下排内参Actin的表达量。第1泳道为对照CK(阴性转基因 植株)。
[0042] 图4为一种T2代家系转基因植株阳性检测示意图。
[0043] 第一泳道为Marker(全式金公司，货号：BM111)，第36泳道为空白（灭菌双蒸 水，d2H20)。" + "代表阳性单株，代表阴性单株。
[0044] 图5为一种超表达载体构建不意图