。
[0045]将基因qSS7 的CDS(SEQIDN0. 2)与超表达载体PU1301(ZhaoYetal.，2009) 连接，构建qSS7超表达载体；
[0046] 图6为一种T0代转基因植株阳性检测不意图。
[0047] 第1-4泳道为阳性植株扩增结果，5、6泳道为阴性单株扩增结果。
[0048] 图7为个基因标记分析未本基因型的电泳不意图。
[0049] 其中珍汕97和CypressPCR扩增产物大小均为487碱基对（bp)，经限制性内切 酶HinPlI(纽英伦生物技术有限公司产品）酶切2小时后，珍汕97的DNA扩增片段被酶 切为363bp和124bp。点样顺序从右至左为：Marker(全式金公司，货号：BM111);酶切前 Cypress,珍汕 97;酶切后Cypress,珍汕 97。
【具体实施方式】
[0050] 本发明通过以下详细的实施例给出。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术 人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发 明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。所述的分子克隆方法及试剂配方如 未特别说明，均参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等（译），科学出 版社，2002;测序工作由北京六合华大基因股份有限公司完成。
[0051] 实施例1 :
[0052] 基因qSS7的制备方法：
[0053] (1)提取Cypress(来源于国际水稻研究所，编号为：IRGC117282)的DNA，用引物 qs2(左引物：ATATCATACTTATATGGCA，右引物：GACAAGTGGCTATGCTGTAT)进行聚合酶链式反 应（PCR)，PCR程序：94°C预变性5分钟；35个循环（94°C变性40秒；55°C退火40秒；72°C延 伸8分钟)，72°C延伸10分钟；用扩增产物测序，获得Cypress基因全长序列，其序列为SEQ IDNO. 1 所示。
[0054] (2)从Cypress的幼穗组织提取RNA,反转录获得cDNA。以Cypress幼 穗cDNA为模板，用引物qs3 (左引物：AAAGGATCCATGCCTCCGGCGAGGGTGCT，右引物： AAAGGATCCTCAGCTTGTACTACTAAATG)进行聚合酶链式反应（PCR)，PCR程序：94°C预变性5分 钟；35个循环（94°C变性40秒；55°C退火40秒；72°C延伸3分钟)，72°C延伸7分钟；用扩 增产物测序，获得Cypress基因编码序列（⑶S)，其序列为SEQIDN0. 2所示。
[0055] (3)利用Primer3 软件（http://frodo.wi.mit.edu/)翻译编码序列（CDS)获得 Cypress的氨基酸序列，其序列为SEQIDNO. 3所示。
[0056] 实施例2 :
[0057]qSS7抑制表达载体的构建和转化农杆菌的建立：
[0058] (1)根据粳稻qSS7cDNA序列的3'端的序列设计标记，并分别在序列5'端增加 BamHI、KpnI、SacI和SpeI酶切位点，设计左引物GL260MF序列为
[0059]AAAGAGCTCGGATCCGITGAGGATCCACTGAATGG，右引物GL260MR序列为AAAACTAGTGGTA CCGTGTAGTTGCTAAGCTTCCTA(引物由上海生工生物技术有限公司负责合成)。以Cypress幼 穗cDNA为模板进行聚合酶链式反应（PCR)。PCR反应程序为94°C预变性5分钟；35个循环 (94°C变性30秒；55°C退火30秒；72°C延伸40秒)，72°C延伸7分钟，获得目的片段。
[0060] 将该片段连接到载体上。方法为：用BamHI和KpnI进行双酶切，分离回收目的 片段，与用BamHI和KpnI双酶切后的pDS1301(抑制载体，ChuZH，etal. 2006.Promoter mutationsofanessentialgeneforpollendevelopmentresultindisease resistanceinrice.GenesDev20:1250_1255)用T4连接酶连接形成中间载体，再将该片 段用SacI和SpeI双酶切，分离回收目标片段，与用SacI和SpeI双酶切过中间载体用 T4连接酶连接形成抑制表达载体。以上限制性内切酶（BamHI、KpnI、SacI和SpeI) 和T4连接酶均购于Takara公司（图1)。
[0061] (2)将抑制表达载体转化大肠杆菌感受态DH5a(Takara公司产品)，在含X-Gal、 IPTG和卡那霉素（上海生工公司产品）的抗性培养基上挑选白色单菌落。
[0062] (3)将挑选的白色单菌落富集抽提质粒，用BamHI和KpnI双酶切后电泳检测，挑 选连接正确的质粒转化农杆菌EHA105 (Takara公司产品），转化后的菌株命名为S1。
[0063] 实施例3:
[0064] 农杆菌介导的籼稻遗传转化：
[0065] (1)诱导：
[0066] 将成熟的水稻材料Q043(长粒型水稻材料，含qSS7区段的染色体片段代换系（Qiu etal.，2012))种子去壳，然后依次用70%体积比的乙醇处理1分钟，0. 15%浓度的氯化汞 (HgCl2)种子表面消毒15分钟；用灭菌水洗种子4-5次；将种子放在籼稻诱导培养基上；将 接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1°C。
[0067] (2)继代：
[0068] 挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于籼稻继代培养基上黑暗下培养2-3 周，温度25±1°C。
[0069] (3)预培养：
[0070] 挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于籼稻预培养基上黑暗下培3-4天，温度 25±1°C。
[0071] (4)农杆菌培养：
[0072] 在带有卡那霉素抗性(上海生工公司产品）选择的LA培养基（LA培养基的配制参 照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等（译），科学出版社，2002)上预 培养农杆菌株S1两天，温度28°C;刮取农杆菌至悬浮培养基中悬浮培养，温度28°C。
[0073] (5)侵染：
[0074] 将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；调节农杆菌S1的悬浮液至 0D_0. 8-1. 0;将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然 后放置在籼稻共培养基上培养3天，温度19-20°C。
[0075](6)筛选：
[0076] 用灭菌水洗涤愈伤8遍；浸泡在含400毫克/升羧苄青霉素（CN)(上海生工公司 产品）的灭菌水中30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤至含有250毫克/ 升羧苄青霉素（CN)、50毫克/升潮霉素（Hn) (Roche公司产品）籼稻选择培养基上选择培 养2-3次，每次2周。
[0077] (7)分化：
[0078] 将抗性愈伤转移至籼稻分化培养基上，光照下培养，温度26°C。
[0079] (8)生根：
[0080] 剪掉再生苗分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周， 温度26V。
[0081] (9)移栽：
[0082] 洗掉再生植株根上的残留培养基，移入钵中盆栽，同时在最初的几天保持水分湿 润，待植株存活健壮后移入大田。
[0083] 实施例4:
[0084] qSS7抑制表达转基因植株粒长的鉴定：
[0085] 取转基因植株叶片抽提DNA，用引物PMCG1 (左引物序列：CTGCTCCACACATGTCCATT; 右引物序列：CCCACCATCTTGTGGAGCTA)和PMCG2 (左引物序列：GGCTCACCAAACCTTAAACAA;右 引物序列：CTGAGCTACACATGCTCAGGTT)进行聚合酶链式反应（PCR)，PCR程序：94°C预变性5 分钟；30个循环（94°C变性30秒；55°C退火30秒；72°C延伸40秒)，72°C延伸7分钟；电泳 检测扩增产物，能分别扩增出750bp和500bp大小条带的单株即为阳性转化单株（图2)。抽 提阳性单株幼穗中的RNA进行RT-PCR，以Actin为对照（Qiuetal.，2012)，用引物GL256 (左引物序列：AGGTCTCGAAGAGTCCAAGA,右引物序列：CCTTCGAATGAATATGACAGT)检测基因 qSS7表达量的变化，有6份阳性单株(编号：R3,R5,R8,R9,R10,Rll)qSS7的表达量下降（图 3)。收获转基因材料的自交种，粒型考察方法(参照范楚川，2006,稻米品质性状的遗传基础 研究以及粒长基因GS3的图位克隆，博士学位论文：25-26);其中3株(编号：R3，R5，R8)的 粒长明显变短(见表1)，与阴性对照R6(CK)相比，3个单株粒长分别减少0. 54mm、0. 24mm和 0? 34mm〇
[0086] 以上所有引物序列均由上海生工生物技术有限公司合成。
[0087] 表1T0代材料粒型
【主权项】
1. 一种分离的基因，其序列为SEQ ID NO. 1所示。
2. 权利要求1所述基因对应的cDNA编码区，其序列为SEQ ID NO. 2所示。
3. 权利要求1或权利要求2所述基因编码的蛋白质，其序列为SEQ ID NO. 3所示。
4. 权利要求1所述基因的分子标记引物，左引物：CGATGCTAGGGGCTTTTG，右引物： CCAGCCTCCCATTGTAGT。
5. 权利要求1或2所述的基因在提高水稻粒长中的应用。
6. 权利要求1或2所述基因在改良水稻籽粒外观品质中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种水稻粒型基因qSS7及制备方法和应用，一种水稻粒型基因qSS7，其序列为SEQIDNO.1所示，该基因可增加粒长和长宽比，减小粒宽，同时减小垩白率和垩白度，在利用该基因改良水稻外观品质时，不用担心其他品质和产量受到负面影响；同时针对qSS7设计了基因标记，可以在苗期鉴定出长短粒等位基因，剔除不需要的杂合及纯和短粒基因型植株，排除了选育后代粒型存在分离的可能，至少减少一季的选育环节。因此，在品质育种实践中可以缩小后代选育材料的面积75%、提高基因选择准确性、缩短育种进程。
【IPC分类】C07K14-415, C12N15-84, C12N15-29
【公开号】CN104745599
【申请号】CN201310753447
【发明人】余四斌, 邱先进, 王记林, 孙文强
【申请人】华中农业大学
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2013年12月31日