水稻粒形调控蛋白OsPIL15、基因、载体和应用
【专利摘要】本发明公开了一种水稻粒形调控蛋白OsPIL15、基因、载体和应用，属于植物基因工程技术领域。通过构建胚乳特异性启动子Gt13a驱动的OsPIL15过表达载体和OsPIL15干涉载体，并利用农杆菌浸染水稻胚性愈伤组织，筛选、分化得到转基因阳性植株，对转基因植株籽粒产量相关的表型进行鉴定，验证OsPIL15与水稻籽粒大小的关系，其中转OsPIL15基因超表达转基因株系的籽粒粒长、粒宽和千粒重显著降低，而RNAi干涉转基因株系的籽粒粒长、粒宽和千粒重显著增加，表明基因OsPIL15在调控水稻籽粒大小、粒重以及增加作物产量上具有潜在的工业应用价值，能产生更高的经济效益。
【专利说明】
水稻粒形调控蛋白OsP IL15、基因、载体和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种水稻粒形调控蛋白0SPIL15,同时还涉及编码该蛋白的基因，以及 载体和应用，属于植物基因工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 水稻是一种重要的粮食作物，为全世界一半以上的人口提供主食，是人类重要的 食物来源。在我国，水稻种植面积占粮食作物种植面积的1/3以上，产量约占粮食总产量的 42%，近2/3的人口以稻米为主食，因此水稻在我国粮食安全中占有极其重要的地位，是国 家粮食安全的基石。水稻产量主要由产量构成三要素穗数、每穗粒数和千粒重决定。水稻的 胚乳是淀粉和蛋白的主要存储器官，而灌浆期胚乳的生长发育直接决定水稻的产量和品质 (Bhullar et al.，2013;Xu et al.，2008)。因此通过生物技术手段提高水稻籽粒大小，促 进水稻灌浆充实，对提高水稻产量具有重要意义。
[0003] 众所周知，光是作物生长发育所需的重要生态因子之一，是作物产量形成的基础， 超过90%的作物产量由光合作用提供。同时光也是一种重要的环境信号，它能调节植物基 因表达，影响酶活及植物形态构建等各个代谢环节，使植物更好地适应外界环境(Carvalho et al.，2011)。光敏色素能够感受红光和远红光，黑暗环境中光敏色素以不活跃的红光吸 收型（Pr)存在，红光照射后可转变为活跃的远红光吸收型（Pfr)( (Franklin et al.， 2010)。远红光吸收型能够从细胞质进入到细胞核中，并与转录因子相互作用调节下游基因 的表达(Bae et al.，2008)，与Pfr直接作用的转录因子属于bHLH家族，被称为光敏色素互 作因子(PIFs)或(PILs)(Toledo_Ortiz et al. ,2003)。作为bHLH蛋白的一种，所有的PIFs 家族蛋白都包含在N端与光敏色素互作的APB(Active Phytochrome B-binding)或APA (Active Phytochrome A-binding)结构域和C端bHLH-DNA结合结构域及核定位结构域 (Khanna et al.，2004;Shen et &1.，2008)。13111^结构域由大约15个氛基酸的0嫩结合区和 约60个氨基酸螺旋-环-螺旋（HLH)结合区组成，它能够与靶基因启动子区域的G-box (CACGTG)或PBE-box(CACATG)结合，从而调控下游靶基因表达(Hornitschek et al. ,2012; Zhang et al.,2013)。
[0004] 在水稻中，Nakamura等通过同源性分析在水稻基因组中鉴定了 6个PIF转录因子 (0sPILll-0sPIL16)，这6个转录因子均有着与拟南芥中PIFs类似的APB基序(Nakamura et al. JOOThOsPILs在叶片中的表达量是根和花中的10倍，在种子发育过程中一些OsPILs也 有表达，其中OsPILll表达量较高，0sPIL13、0sPIL14、0sPIL15表达水平中等，而0sPIL12的 表达较低(Jeong et al.，2013)。0#儿13在水稻中超表达后能够促进水稻节间伸长，反之 则抑制其节间伸长，这表明一些OsPILs能够促进细胞的伸长(Todaka et al.，2012)。研究 表明，超表达0sPIL15的水稻种子在黑暗环境中的萌发受到抑制，基因芯片技术推测这可能 与0sPIL15抑制生长素合成路径和细胞壁生成有关，而持续7d的红光和远红光照射可以解 除这一抑制，使转基因水稻种子顺利萌发(Zhou et al. JOMhPGLI是一个非典型的bHLH 家族基因，过量表达PGLI会增加水稻籽粒长度和重量，而APG是PGLI的拮抗性互作因子，APG 基因也即PIFs家族的OsPIL16，APG干涉后籽粒显著变长变宽，表明OsPIL16能够负调控PGL1 进而调控籽粒大小(Heang et al.，2012)。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种水稻粒形调控蛋白0sPIL15。
[0006] 再者，本发明提供一种编码上述蛋白的基因。
[0007] 同时，本发明提供一种调控水稻粒形的载体。
[0008] 最后，本发明提供一种上述基因、载体在调控水稻粒形中的应用。
[0009] 为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
[0010] 水稻粒形调控蛋白0SPIL15,其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0011] 编码上述蛋白的基因，其碱基序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID N0.3所示。
[0012] 0sPIL15过表达载体，其上插入有编码如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的基因。具 体的，基因序列如SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.4所示。
[0013]1?熟1干涉载体，其上插入有如3￡0 1〇从).12、3￡0 1〇从).13所示的基因序列。
[0014]基因序列SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.12、SEQ ID N0.13&&0sPIL15 过表达载体、RNAi干涉载体在调控水稻粒形中的应用。
[0015] 基因序列SEQ ID NO. 12、SEQ ID N0.13以及RNAi干涉载体在培育（高产）水稻品系 以及提高水稻产量中的应用。
[0016]本发明的有益效果：
[0017]本发明提供了一种可用于调控水稻籽粒大小和粒重的蛋白及基因0sPIL15。通过 构建胚乳特异性启动子Gtl3a驱动的0sPIL15过表达载体和0sPIL15干涉载体，并利用农杆 菌浸染水稻胚性愈伤组织，筛选、分化得到转基因阳性植株，对转基因植株籽粒产量相关的 表型进行鉴定，验证0sPIL15与水稻籽粒大小的关系，其中转0sPIL15基因超表达转基因株 系籽粒粒长、粒宽和千粒重显著降低，而RNAi干涉转基因株系籽粒粒长、粒宽和千粒重显著 增加，表明基因0sPIL15在调控水稻籽粒大小和粒重以及增加作物产量上具有潜在的工业 应用价值，能产生更高的经济效益。
[0018]本发明针对当前人口不断增长和粮食需求不断增加的现状，利用光敏色素互作因 子在调节水稻产量中的作用，探讨光敏色素互作因子在水稻品种改良中的功能，从而为 0sPIL15在培育高产水稻，特别是通过调控籽粒大小进而增加千粒重提供依据。本发明基于 0sPIL15的表达载体可以为培育高产水稻新品系提供一种简单有效的技术手段，基因 0sPIL15在提高水稻籽粒大小和粒重以及增加作物产量上具有潜在的应用价值，可利用分 子改良技术在生产中加以应用。
【附图说明】
[0019]图1为0sPIL15过表达载体的结构示意图；
[0020] 图2为0sPIL15RNAi干涉载体的结构示意图；
[0021] 图3为0sPIL15超表达转基因株系花后12d籽粒胚乳中0sPIL15表达量分析图；
[0022] 图4为0sPIL15RNAi干涉转基因株系花后12d籽粒胚乳中0sPIL15表达量分析图；
[0023]图5为野生型对照、0sPIL15超表达和RNAi干涉转基因株收获籽粒粒长差异分析 图；
[0024]图6为野生型对照、0sPIL15超表达和RNAi干涉转基因株收获籽粒粒长比较图； [0025]图7为野生型对照、0sPIL15超表达和RNAi干涉转基因株收获籽粒粒宽差异分析 图；
[0026] 图8为野生型对照、0sPIL15超表达和RNAi干涉转基因株收获籽粒粒宽比较图；
[0027] 图9为野生型对照、0sPIL15超表达和RNAi干涉转基因株收获籽粒千粒重差异分析 图。
【具体实施方式】
[0028] 下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0029] 实施例1
[0030] 0sPIL15基因序列的合成：
[0031 ]在水稻生物学网站（http://rapdb.dna.affrc.go.jp/)下载0sPIL15 (0s01g0286100)基因组DNA序列（如SEQ ID勵.5所示），序列前端斜体部分为5'端17^(非翻 译区），下划线部分为CDS序列(外显子，编码区），末尾斜体部分为3 '端UTR，无标记部分为内 含子。
[0034] 将上述⑶S序列拼接在一起得到编码氨基酸的碱基序列（如SEQ ID NO.3所示），序 列前端斜体ATG为起始密码子，末尾斜体TAA为终止密码子，下划线部分为Kpnl和Sac頂每切 位点。由序列SEQ ID N0.3翻译得到的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，由于终止密码子TAA 不翻译蛋白，末尾以*表^
[0039] 根据载体pTCK303所需酶切位点(Kpnl和SacI)，对0sPIL15的⑶S序列进行优化。由 于该序列中有Kpnl和SacI两个酶切位点，而在构建超表达载体时需要使用这两个酶切位 点，如果不进行优化，在用这两个酶切割时会把CDS序列切断，因此在合成基因时需要把这 两个酶切位点优化掉，即利用生物编码氨基酸的简并密码子，在不改变翻译出氨基酸序列 的情况下，把这两个酶切位点去掉，得到如SEQ ID N0.2所示的碱基序列。序列前端斜体ATG 为起始密码子，末尾斜体TGA为终止密码子。
[0042] 在序列SEQ ID NO.2前后添加酶切位点，并在起始密码子ATG前加上一段5'端UTR， 以使CDS能更好的翻译序列，优化得到的碱基序列如SEQ ID NO.4所示。序列前端下划线处 为Kpn頂每切位点，末尾下划线处为Sac頂每切位点，斜体部分为5'端UTR。
[0045] 将序列SEQ ID NO.4交由苏州金唯智生物科技有限公司合成，合成后的DNA连接在 PUC57载体上(通过Kpnl和SacI两个酶切位点连接在pUC57载体上），得到含有目标DNA的重 组质粒(同样由苏州金唯智生物科技有限公司合成）。
[0046] 实施例2
[0047]调控水稻粒形的0sPIL15过表达载体的构建：
[0048] 使用限制性内切酶Kpnl和SacI分别对含有目标DNA的重组质粒pUC57: :0sPIL15和 含有胚乳特异性启动子Gtl3a(He et al.，2011;Ning et al.，2008)的表达载体pTCK303进 行双酶切，纯化回收得到目标DNA 0sPIL15和线性化质粒pTCK303。使用T4DNA连接酶连接， 连接产物转化至DH5a感受态细胞，在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基上，37°C倒置培养 16h。对含有重组质粒的大肠杆菌进行菌落PCR验证，选取验证正确的质粒进行酶切验证，并 将酶切验证正确的质粒命名为PTCK303: :0sPIL15，结构示意图见图1。
[0049] 实施例3
[0050] 0sPIL15RNAi干涉载体的构建：
[0051 ] 使用TRIzol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA,USA)提取粳稻品种日本晴叶片总 RNA，并用RNase-free DNase I(TaKaRa Bio Inc. ,0tsu,Shiga,Japan)去除DNA污染。取3ug 总尺麻，使用反转录酶（？1'〇1116 83，]\^(118〇11，￥1，1]5六）反转录得到〇0财。以〇0财为模板，以 0sPIL15(KpnI)-F、0sPIL15(BamHI)-R为引物(如SEQ ID N0.6、7所示），扩增得到反式干扰 片段0sPIL15anti-sense(如SEQ ID N0.12K*);&0sPIL15(SpeI)-F、0sPIL15(SacI)-RS 引物（如3￡〇10^).8、9所示），扩增得到顺式干扰片段〇8?几15861186(如3￡〇10^).13所 示，该序列是⑶S序列SEQ ID NO.3中的一部分，选取这一部分，通过RNAi方法即可干扰整个 蛋白SEQ ID N0.1的表达）。
[0052] 使用限制性内切酶Kpnl和BamHI分别对0sPIL15 anti-sense和含有胚乳特异性启 动子Gtl3a的表达载体pTCK303进行双酶切，纯化回收酶切产物；用T4连接酶连接后转化大 肠杆菌DH5a，筛选出阳性克隆并测序，得到连接有〇 sPIL15anti-sense的重组质粒 PTCK303: :0sPIL15anti-sense。使用限制性内切酶Spel和SacI分别对0sPIL15sense和重组 质粒PTCK303: : 0sPIL15anti-sense进行双酶切，纯化回收酶切产物；用T4连接酶连接，转化 大肠杆菌后菌落PCR筛选出阳性克隆并测序，最终得到0sPIL15RNAi干涉载体，结构示意图 见图2。
[0057] 实施例4
[0058] 0sPIL15过表达载体和0sPIL15RNAi干涉载体转化水稻品种日本晴，包括以下步 骤：
[0059] 1、0sPIL15过表达载体和0sPIL15RNAi干涉载体转化农杆菌EHA105
[0060] 1)分别取两种表达载体lyg，加入到200yL冰上溶化的感受态细胞中，轻混，冰浴 30min，液氮中速冻5min，37 °C水浴5min，再迅速冰浴2min;
[0061 ] 2)加入800yL LB液体培养基(不含抗生素），28°C轻摇5h(4~6h均可）；
[0062] 3)取菌体离心，除去上清液，剩余菌体重悬后涂布于AB培养基上（Kan 50mg/L， 虹作〇11^/1，组分见下表1)，28°(：倒置暗培养3天。
[0063] 表1 AB培养基
[0066] 2、浸染水稻愈伤组织，转基因阳性植株筛选、分化和鉴定，包括以下步骤：
[0067] 1)去壳种子用70%的乙醇浸泡lmin，无菌水冲洗4次(3~5次均可）；
[0068] 2)再用30%的NaC10(原液为有效氯10%，每50mL加一滴Tween-20)浸泡15min，无 菌水清洗5次；
[0069] 3)重复步骤2)，但NaCIO中不加 Tween-20;
[0070] 4)种子放置在垫有滤纸的已灭菌的培养皿中，将种子表面的水分吸干，转一次干 净的垫滤纸培养皿，将种子吹干；
[0071] 5)灭菌后的种子播种于N6D培养基上(组分见下表2)，32°C持续光照培养5天；
[0072] 表2 N6D培养基
[0074] 铁盐（100X )的配制方法为：将3.73g乙二铵四乙酸二钠Na2EDTA ? 2H20)和 2.78gFeS〇4.7H20分别溶解，混合并用，蒸馏水定容至1000mL，下同；
[0075] 肌醇(500X )的配制方法为:5g肌醇定容至100mL蒸馏水中，下同；
[0076] 6)用灭菌勺子刮掉AB培养基上的农杆菌菌落，并悬浮于AAM培养液中（含As，组分 见下表3)，使0D600约为0.1;
[0077] 表3 AAM培养液
[0079] 7)预培养的种子浸于农杆菌菌液中，轻轻晃动约1.5min，再用无菌滤纸吸去多余 的菌液，吹干；
[0080] 8)将种子接于N6D-AS共培养培养基上（组分见下表4)，培养基上预先垫一层浸有 AAM培养液的无菌滤纸；
[0081 ] 表4 N6D-As共培养培养基
[0083] 9)25。(：黑暗共培养3天；
[0084] 10)共培养后的种子用含400mg/L羧苄的无菌水冲洗5次，并用之浸泡30min，以彻 底去除农杆菌；
[0085] 11)用无菌滤纸吸去水分并吹干，接种于含50mg/L潮霉素 B和400mg/L羧苄的N6D-S 筛选培养基上(组分见下表5)，32°C持续光照培养两周；
[0086] 表5 N6D-S筛选培养基
[0088] 12)将生长旺盛的愈伤组织转移到含50mg/L潮霉素 B和250mg/L羧苄的RE-III培养 基上(组分见下表6)诱导分化，28°C持续光照两周；
[0089]表6 RE-III培养基
[0091] 13)转移分化出的幼苗至含50mg/L潮霉素 B和200mg/L羧苄的HF培养基上(组分见 下表7)诱导生根，28 °C每天16h光照两周；
[0092] 表7 HF培养基
[0094] 14)待试管苗生长稳定后将瓶口打开，加入lcm深的常温灭菌水，在温度28°C(25~ 30 °C均可），湿度> 50 %的环境中过渡培养4天(3此时间不宜过长，3~5天均可，否则会产生 污染），将褐化组织小心去除，根部培养基用水冲洗干净，注意不要造成根部损伤，然后移栽 到已经准备好的合适土壤中；
[0095] 15)提取水稻转基因再生苗叶片DNA，使用潮霉素引物进行PCR阳性鉴定，引物序列 Hyg-F、Hyg-I^nSEQIDNO.lO、10；f*;
[0096] Hyg-F：CGATTCCGGAAGTGCTTGAC；
[0097] Hyg-R:CGTCTGCTGCTCCATACAAG。
[0098] 培养基母液如N6大量元素（20 X )、N6微量元素（1000 X )、N6有机物（100 X )、MS大 量元素（20X)、MS微量元素（1000X)、MS有机物（100X)、AAM Macro(20X)、AAM Micro (1000X)、AAM 0rganic+Gly(200X)、AAM Amino Acid(lOX)的组成分别见下表8~17。
[0099] 表8 N6大量元素（20X)
[0101]表9 N6微量元素（1000 X)
[0104]表 10 N6有机物（100 X)
[0106] 表11 MS大量元素（20 X)
[0108]表 12 MS微量元素（1000 X)
[0110]表 13 MS有机物（100X)
[0112]表 14 AAM Macro(20X)
[0114]表 15 AAM Micro(lOOOX)
[0116]表 16 AAM 0rganic+Gly(200X)
[0118]表17 AAM Amino Acid(10X)
[0120] 试验例
[0121] 1、转基因植株0sPIL15表达量检测
[0122] 0sPIL15超表达植株表达量采用半定量法检测，0sPIL15干涉植株表达量采用荧光 定量法检测。转基因植株和非转基因野生型水稻花后12天胚乳使用TRIzol试剂 (Invitrogen, Carlsbad，CA, USA)提取总 RNA，取 lug 总 RNA 使用反转录酶（Promega, Madison, WI，USA)反转录。
[0123] 半定量使用Taq酶(康为世纪，北京)扩增，以OsActin为内参，采用1%琼脂糖凝胶 电泳检测，结果见图3。由图3可知，野生型WT和超表达植株0X-23中原始0sPIL15基因表达量 基本相当，而0sPIL15优化后的合成基因在野生型WT中无表达，在超表达株系0X-23中有较 高的表达量，表明基因0sPIL15在0X-23株系中实现了超表达。
[0124] 荧光定量使用20此定量体系，其中模板cDNA按1:20稀释后加5此，正反引物各加 〇.8yl，再加入4.2yL的ddH 20,荧光染料（SYBR Green qRT-PCR Master Mix;Toyobo)10yL， 使用CFX 96 Real Time System(BioRad，USA)定量检测，相对表达量采用2_AAeT法计算，结 果见图4。由图4可知，干涉株系RNAi-38中0sPIL15表达量比野生型WT显著降低，表明基因 0sPIL15在RNAi-38株系中实现了低表达。
[0125] 2、转基因植株籽粒表型分析
[0126] 分别选取超表达0sPIL15和干涉0sPIL15转基因株系中0sPIL15表达量提高和降低 的独立转基因株系，每个株系选取5株，每株随机选取30粒成熟收获后的籽粒，使用大米外 观品质检测仪(JMWT12，东孚久恒，北京)对籽粒粒长和粒宽进行测定，5次重复取平均值，结 果见图5~8。千粒重测定为随机选取1000粒种子称重，5次重复得到千粒重，结果见图9。
[0127] 由图5~6可知，超表达株系0X-26、0X_30的粒长比野生型极显著减小，超表达株系 0X-23、0X-31的粒长比野生型显著减小，而3个RNAi干涉株系的粒长均比野生型极显著增 大。
[0128] 由图7~8可知，4个超表达株系的粒宽均极显著小于野生型，而3个RNAi干涉株系 除RNAi-39的粒宽显著大于野生型外，其余两个株系均达到极显著水平。
[0129] 由图9可知，4个超表达株系的千粒重较野生型显著或极显著降低，而3个RNAi干涉 株系较野生型显著或极显著提高。
【主权项】
1. 水稻粒形调控蛋白0SPIL15,其特征在于：蛋白0SPIL15的氨基酸序列如SEQ ID NO.l 所示。2. 编码如权利要求1所述蛋白0sPIL15的基因。3. 根据权利要求2所述的基因，其特征在于:碱基序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所 不。 4.OsPILl5过表达载体，其特征在于：载体上插入有编码如SEQ ID NO.l所示氨基酸序 列的基因。5. 根据权利要求4所述的过表达载体，其特征在于:基因序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO. 4所示。 6. RNAi干涉载体，其特征在于:载体上插入有如SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13所示的基 因序列。7. 如权利要求2或3所述基因在调控水稻粒形中的应用。8. 如权利要求4或5所述过表达载体在调控水稻粒形中的应用。9. 如权利要求6所述干涉载体在调控水稻粒形中的应用。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，干涉载体在培育高产水稻品系以及提高 水稻产量中的应用。
【文档编号】C07K14/415GK105820225SQ201610340690
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】杜彦修, 季新, 赵全志, 孙红正, 张静, 李俊周, 彭廷
【申请人】河南农业大学