专利名称：利用调控蛋白基因提高阿维菌素的产量的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域以及微生物学领域，特别涉及一类与阿维菌素产量相关
的基因以及操作该类基因提高阿维菌素产量的方法。
背景技术：
阿维菌素(Avermectins， AVM)是一类广泛使用的农用抗生素，它由除虫链霉菌 (Str印tomyces avermitilis)产生，具有十六元大环内酯的化学结构，其分子根据C_5、 C22-23, C26位置上的结构差别可分为Ala、Alb、A2a、A2b、Bla、Blb、B2a、B2b八种组分。其 中Bla是最具活性的组分，被广泛应用于家畜寄生虫的感染治疗和农业虫害的防治，目前 已经成为一种非常重要的生物农药。 从阿维菌素作为一种广谱抗生素应用于实际生产以来，以提高菌种发酵产量的研 究工作一直未曾停止，其中使用最为频繁的是常规的诱变育种，但是这种方法有相当大的 随机性，而且菌种经长期使用诱变剂处理后，其生存能力会慢慢下降。通过对阿维菌素生物 合成的研究，可以发现其生物合成途径受特异的调控基因调控，而这些调控基因有可能存 在于阿维菌素生物合成基因簇之内，也有可能存在于生物合成基因簇之外。这些广泛存在 的全局性调控基因、各种调控因子与其调控蛋白以及与特异的调控基因相互影响，形成了 一个大型的调控网络来调控阿维菌素的产量。 目前，国际上对调控系统的研究主要集中在天蓝色链霉菌基因序列，而对除虫链 霉菌中调控基因调控抗生素的生产研究不多，因此发现新的调控阿维菌素生产的基因，通 过消除负调控基因，过量表达正调控基因，对提高阿维菌素的产量有着十分重要的应用意 义。
发明内容
本发明的目的是提供若干提高阿维菌素生产的基因及调控方法。 在本发明的一个方面，提供两种位于阿维菌素生物合成基因簇序列以外的调控蛋
白基因序列，通过在除虫链霉菌中敲除这两种调控蛋白基因可以提高阿维菌素的产量，所
述的调控蛋白基因选自avaL2基因(核苷酸序列表序列1)和avaRl基因(核苷酸序列表
序列2)，并且所述的基因来自除虫链霉菌基因组。 在另一优选例中，提供一种位于阿维菌素生物合成基因簇序列以外的调控蛋白基
因序列，通过在除虫链霉菌中敲除该基因可以使得阿维菌素的产量降低，所述的调控蛋白
基因选自avaR2基因，并且所述的调控蛋白基因选自除虫链霉菌基因组。 本发明的第二方面，提供一种提高除虫链霉菌中阿维菌素产量的方法，包括以下
步骤在除虫链霉菌基因组中敲除调控蛋白基因，并且诉述的调控蛋白基因选自avaL2基
因或avaRl基因。 本发明中所述的将目的调控蛋白基因在除虫链霉菌基因组中敲除包括以下步骤
(a)构建含有目标基因5'和3'旁侧序列和红霉素抗性基因的敲除载体。
(b)将含有基因取代载体的宿主菌株作为供体菌株，通过供体菌株-链霉菌接合
转移的方法导入到除虫链霉菌中，得到含有基因取代载体的除虫链霉菌转化子。
(c)转化子经高温诱导得到单交换突变株，再将单交换突变株传代后获得发生了
同源双交换的重组除虫链霉菌突变株。 (d)所述敲除载体中调控基因的5'端旁侧序列、红霉素抗性基因3' -5'序列和调 控基因3'端旁侧序列按上述顺序且按上述方向顺次连接。 用于构建敲除载体的出发载体为任意一种大肠杆菌-链霉菌穿梭载体，如 pKC1139， pKC505， pIJ653， pIJ8154，优选为pKC1139。 以pKC1139为出发载体构建的基因取代载体为pWJb309、pWJb360。
本发明的另一种优选例中，诉述的宿主细胞为大肠杆菌细胞。 本发明的第三个方面，提供一种调控蛋白调控阿维菌素产量的基因和降低阿维 菌素产量的方法，包括以下步骤在除虫链霉菌中敲除调控蛋白基因，并且所述基因选自 avaR2基因(核苷酸序列表序列3)。 在本发明的一个优选例中，所述的将目的调控基因在除虫链霉菌基因组上敲除包 括以下步骤 (e)构建含有目标基因5'和3'旁侧序列和红霉素抗性基因的敲除载体。
(f)将含有基因取代载体的宿主菌株作为供体菌株，通过供体菌株_链霉菌接合
转移的方法导入到除虫链霉菌中，得到含有基因取代载体的除虫链霉菌转化子。
(g)转化子经高温诱导得到单交换突变株，再将单交换突变株传代后获得发生了
同源双交换的重组除虫链霉菌突变株。 (h)所述敲除载体中调控基因的5'端旁侧序列、红霉素抗性基因3' -5'序列和调 控基因3'端旁侧序列按上述顺序且按上述方向顺次连接。 用于构建敲除载体的出发载体为任意一种大肠杆菌-链霉菌穿梭载体，如
pKC1139， pKC505， pIJ653， pIJ8154，优选为pKC1139。 以pKC1139为出发载体构建的基因取代载体为pWJb374。 本发明的另一优选例中，所述的宿主细胞为大肠杆菌细胞。 本发明的第四个方面，提供了一种生产阿维菌素的方法，包括下面步骤 (1):发酵本发明上述的敲除目的调控基因(包括负调控基因和正调控基因)的除
虫链霉菌； (2):从发酵产物中分离阿维菌素。 在本发明的一个优选例中，所述的调控蛋白基因均位于除虫链霉菌基因组中，且 只有一个拷贝，位于阿维菌素生物合成基因簇序列之外。 在本方明的第五个方面，提供所述的敲除调控蛋白基因的除虫链霉菌的用途，其 特征在于用于生产阿维菌素。 本发明的其它方面由于本发明的公开内容，对于本领域的技术人员而言是显而易 见的。
图1 :敲除avaL2基因置换质粒pWJb360的构建过程。
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图2 :avaL2基因置换突变菌株的基因型及Southern验证。经PvuII酶切后双交 换的突变株在1. lkb和1. 4kb区域显示信号。 图3 :avaL2基因置换突变菌株与野生型菌株发酵产物的分析对比。Bla代表阿维 菌素Bla组分。(A)HPLC图谱；(B)柱状对比图，1代表野生型，2代表avaL2基因置换突变 株。 图4 :敲除avaRl基因置换质粒pWJb309的构建过程。 图5 :avaRl基因置换突变菌株的基因型及Southern验证。经Ncol酶切后双交换 的突变株在3. 8kb区域显示信号。 图6 :avaRl基因置换突变菌株与野生型菌株发酵产物的分析对比。Bla代表阿维 菌素Bla组分。(A)HPLC图谱；(B)柱状对比图，1代表野生型，2代表avaRl基因置换突变 株。 图7 :敲除avaR2基因置换质粒pWJb374的构建过程。 图8 :avaR2基因置换突变菌株的基因型及Southern验证。经Ncol酶切后双交换 的突变株在9. 8kb区域显示信号。 图9 :avaR2基因置换突变菌株与野生型菌株发酵产物的分析对比。Bla代表阿维 菌素Bla组分。(A)HPLC图谱；(B)柱状对比图，1代表野生型，2代表avaR2基因置换突变 株。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，发现了一类可调控除虫链霉菌抗生素(阿维菌 素)生产的调控基因(包括正调控和负调控基因)，所述基因为avaL2基因和avaRl基因 (负调控基因)，以及avaR2基因(正调控基因)。将所述的负调控基因在除虫链霉菌基因 组中进行敲除，可大大提高阿维菌素的产量，而将所述正调控基因进行敲除，可大大降低阿 维菌素的产量。基于以上完成了本发明。在所述的调控基因中，三个基因均来自除虫链霉 菌(Str印tomyces avermitilis，简称S. avermitilis)本身的基因组中。如本发明所用到 的三个基因均编码可能的属于TetR家族的转录调控因子，均是可能的Y-丁酸内酯依赖的 调控蛋白，因此也称为调控蛋白基因。(Eriko Takano， g-Butyrolactones :Str印tomyces signallingmolecules regulating antibiotic production and differentiation. Current Opinion inMicrobiology 2006，9 :287_294) 在本发明中，所用的"调控基因"是指用于调节控制特定结构基因表达的基 因。正调控指可以提高或者维持结构基因表达的基因，负调控则是可以降低结构基因 表达的基因。在本发明中，从除虫链霉菌基因组中获得的所述avaL2基因(GenBank登 录号为BAC69979. 1 ;从除虫链霉菌基因组中获得的所述avaRl基因(GenBank登录号为 BAC71417. 1);从除虫链霉菌中得到的avaR2基因(GenBank登录号为BAC71414. l)，这些基 因均由外源导入敲除载体后被红霉素抗性基因所替代，形成除虫链霉菌突变株。
在本发明中，"除虫链霉菌"(Str印tomyces avermitilis)是一种能够产生阿维菌 素(avermectins AVM)的菌。 在本发明中，大肠杆菌-链霉菌穿梭载体是指一类能由大肠杆菌转到链霉菌中的 质粒，包括(但是不限于)pKC1139。
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在本发明中，"基因转移"是指将外源的遗传物质由供体菌导入到受体菌内的过 程，其可以通过转化、接合转移、转导、细胞融合等手段来实现。"接合转移"是指细菌通过性 菌毛相互连接沟通，将遗传物质(主要是质粒DNA)从供体菌转移给受体菌。
本发明敲除的负调控基因avaL2 (核苷酸序列表序列1)，具有以下的核苷酸序列 在本发明所述的avaRl (核苷酸序列表序列2)，具有以下的核苷酸序列
CGGACGTTGGAGTGA 本发明所述的avaR2 (核苷酸序列表序列3)，具有以下的核苷酸序列
GCGGAGACGCGGACCCCGGCGACCACCGCCGGATGA 如本发明所用，敲除上述基因包括对上述基因进行替换、关键残基点突、同框敲除 等对目标基因失活的手段。 本发明提供的质粒的构建方法，系由载体和在多克隆位点上加入敲除的目的基因旁侧序列和红霉素抗性基因序列组成，载体为大肠杆菌和链霉菌穿梭质粒，可以为 pKC1139、p0J260、pWHM3等及其类似的载体。
进一步的描述如下 本发明的负调控基因能够负向调控阿维菌素的生物合成，当将该类基因敲除后， 可以提高阿维菌素的产量。并且本发明人选择了合适的接合转移载体，即带有温敏型复制 子的质粒pKC1139，利用同源重组技术，得到了稳定的基因突变株。 在检测阿维菌素产量时，可通过测量出发菌株和改良菌株产生的有效组分 Bla (avermectin Bla，中文全名2， 6_双脱氧-4-0- (2， 6_双脱氧3-0-甲基-a-L-阿拉伯糖 基_吡喃己基)-3-0-甲基-a-L-阿拉伯糖基-吡喃己基[氧化]-3' ， 4' ， 6， 6'7， 10， 14， 15， 17&，20，20&，2013-十四氢-20，2013-双羟-5'，6，8，19-四甲基-6' -(l-甲丙基)螺旋[11， 15-甲撑-2H，13H，17H-呋喃]4，3，2-pq，2，6，[苯丙双氧环八癸炔]_吡喃-17-酮)的含 量为标准，检测阿维菌素的产量是否提高。 本发明中所用于实施例或其他内容所显示的成分用量、反应条件等数字均为大约 数值。因此除非文中特别注明，本说明书的上述数字参数均为近似值，其可根据所需得到的 本发明的结果而加以变化。 除特别说明外。文中所用到的专业术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。 此外，任何与所记载内容相似或者均等的方法及材料均可应用于本发明的方法之中。实 验中未注明的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York : Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述条件或者按照制造厂商所建 议的条件。 本发明的主要特点在于 (1)发现了一类与除虫链霉菌的阿维菌素产量密切相关的几个调控基因。
(2)发明敲除其中的负调控基因avaL2基因和avaRl基因可以大大提高除虫链霉 菌的阿维菌素的产量，敲除其中的证调控基因avaR2可以大大降低除虫链霉菌的阿维菌素 的产量。 (3)本发明采用接合转移的手段将中断质粒导入到受体菌中，诱导发生双交换，得 到了稳定的基因型突变株。 下面结合具体的实施例来进一步说明本发明。应该理解的是，所用实施例仅用于 说明本发明而不用于限制本发明的范围。 实施例中所用培养基，除特殊说明外，液体均用YEME培养基，固体均用MS培养基。
实施例一 敲除avaL2基因对阿维菌素(avermectin)产量的影响
1 :左右交换同源臂的获得 以S. avermitilis的基因组为模板，采用引物5'-ATT AAG CTT CGA CCGGAT CAT CGC GGT GAA C-3'和引物TTA CTC GAG GGC GGG GAC CGA AGC ATA AAAG克隆得到左臂约 2kb的PCR产物，利用酶切位点连入pGEM-7zf中，再用引物5' -AAT TCT AGA GGC CGG CCA CGG CCC GGT GAG—3'禾卩引净勿5' _AAT GAT ATCACG GTC ACC CGC TCC CGC CTG—3' f寻至U右臂 约2kb的PCR产物，利用酶切位点连入pSP72中。
2 :抗性基因片段的获得 红霉素抗性基因是通过利用酶切位点Xhol和Xbal从质粒pAGE_l中酶切所得，长约1. 8kb。 3 :重组质粒pWJb360的获得 将左臂从载体中用核酸内切酶Hindi 11和Xhol切出来，将右臂用核酸内切酶Xbal 和EcoRV切出来，与获得的抗性片段一起连入用HindIII和EcoRV切好的pKC1139中，具体 构建可见附图1。 4 :敲除avaL2基因突变株的获得和生物效价的评定将用于基因置换的重组质粒pWJb360转入到大肠杆菌ET12567中，通过大肠杆菌
和链霉菌之间的属间接合转移将重组质粒导入到链霉菌中，37t:整合后松弛诱导发生双交
换，筛选获得红霉素抗性而阿泊拉霉素敏感的双交换突变株。该突变菌株的基因型利用标 记的红霉素抗性基因的探针进行Southern杂交验证，基因型验证结果见图2。得到突变株。
在相同发酵条件下对比出发菌株和突变后的菌株产阿维菌素Bla的量分析。
将保存好的孢子解冻后，涂于平板培养基上，平板培养基配方为葡萄糖(国药集 团化学试剂有限公司)1. 5%、天门冬酰氨(华美生物工程公司)0. 05%、进口牛肉浸膏(中 国医药(集团)上海化学试剂公司)0.3%、磷酸二氢钾(天津市化学试剂六厂)O. 05%、琼 脂1.8%。 3(TC培养五天后，用打孔器取一小块放到种瓶内。 种子培养基配方为玉米淀粉3%、豆粕粉0.8%、花生饼粉1%、酵母浸提物 0.4%、氯化钴(中国医药(集团)上海化学试剂公司，l^的溶液)0.3^、淀粉酶4ii/g淀粉。 配制时先将玉米淀粉糊化(玉米淀粉用少量水溶解，加入淀粉酶，搅拌均匀，倒入 约1/2总量的沸水中，煮沸)，加入其他原料(也用冷水调匀)，定容后调pH值6. 8 7，分 装40ml/250ml三角瓶，121。C灭菌25min。 28°C ， 200rpm培养两天后，吸取1. 5ml到摇瓶中。
发酵培养基配方为玉米淀粉14%、豆粕粉2.8%、酵母粉1 %、钼酸钠 (1% )2. 2%。、硫酸锰(0. 1% )2. 3%。、硫酸铵(5% )5%。、氯化钴(1% )2%。。
配制时先将玉米淀粉用冷水溶解调匀，加入淀粉酶(1. 5 2单位没克淀粉)，水浴 加热，变稀后计时保温12min(在升温过程中，料液会由乳白色变为半透明浆糊状，此时开 始计时)，取出，加入其它原料(先用冷水调匀)，定容，调pH，起始pH值约6. 3，调至7. 5，然 后加入碳酸钙0. 8%。，搅拌均匀，边搅拌边分装30ml/250ml三角瓶，12rC灭菌25min。
摇瓶在28°C，200rpm的条件下培养十天，取lml菌液，加4ml甲醇，超声10min，离 心取上清，HPLC检测。 检测条件为检测波长UV = 245咖；柱子VARIAN 250/4. 6 SN 282566MICR0S0RB-MV 100-5 C18 R008620005 ;流动相条件v = lmL/min ;A溶液=H20 ;B溶液=CH30H ;洗脱条件为 85% B， 15% A，洗脱时间为20min。 分析HPLC结果可以看出，原始出发菌株阿维菌素的产量约为1321yg/ml，突变株 的产量为1550iig/ml，增产为17%。具体的HPLC图谱以及产量对比柱形图见附图3。
实施例2 :敲除avaRl对阿维菌素(avermectins) Bla产量的影响
1 :左右交换同源臂的获得 以S. avermitilis的基因组为模板，采用引物5 '-ATT AAG CTT ACC CCTTGG CGA CCG CCG TC-3'和引物5' -TTA TCT AGA CTC GAG TCG CTC CTG CCGCGC CAC AC-3'克隆得 到左臂约2kb的PCR产物，利用酶切位点连入pGEM-3zf中，再用引物5'-AAT TCT AGA GGCACG GAC GTT GGA GTG AC—3'和引物5' -TTA GAA TTC GTG CGG ATC GCG CGT TCC TG_3， 得到右臂约2kb的PCR产物，利用酶切位点连入pGEM-3zf中。
2:抗性基因片段的获得 红霉素抗性基因是通过利用酶切位点Xhol和Xbal从质粒pAGE-1中酶切所得，长 约1. 8kb。 3 :重组质粒pWJb309的获得 将左臂从载体中用核酸内切酶HindIII和XhoI切出，将右臂用核酸内切酶XbaI 和EcoRI切出，与获得的抗性片段一起连入用Hindi 11和EcoRI切好的pKC1139中，具体构 建可见附图4。 4 :敲除ava Rl基因突变株的获得和生物效价的评定将用于中断的重组质粒pWJb309转入到大肠杆菌ET12567中，通过大肠杆菌和链 霉菌之间的属间接合转移将重组质粒导入到链霉菌中，37t:整合后松弛诱导发生双交换， 筛选获得红霉素抗性而阿泊拉霉素敏感的双交换突变株。该突变菌株的基因型利用标记的 红霉素抗性基因的探针进行Southern杂交验证，基因型验证结果见图5。得到突变株。
发酵条件及HPLC检测方法同实施例1。 分析HPLC结果可以看出，原始出发菌株阿维菌素的产量约为1321yg/ml，突变株 的产量为1756ii g/ml，增产为33%。具体的HPLC图谱记柱形图对比可见附图6。
实施例3 :敲除avaR2对阿维菌素(avermectins)产量的影响
1 :左右交换同源臂的获得 以S. avermitilis的基因组为模板，采用引物5 '-GAA AAG CTT GAC GCCCCC TTC ATA G-3'和引物5'-CAC CTC GAG CTT GCT CTC GAA GTG-3'克隆得到左臂约2kb的PCR产 物，利用酶切位点连入pGEM-7zf中，再用引物5'-AATTCT AGA GCC GTA CGG CAG CCG CTC-3' 和引物5'-TAA GAA TTC TGC CCC TACGCC CTG GAC-3'得到右臂约2kb的PCR产物，利用酶 切位点连入pGEM-3zf中。
2:抗性基因片段的获得 红霉素抗性基因是通过利用酶切位点Xhol和Xbal从质粒pAGE-1中酶切所得，长 约1. 8kb。 3 :重组质粒pWJb374的获得 将左臂从载体中用核酸内切酶HindIII和XhoI切出，将右臂用核酸内切酶Xbal 和EcoRI切出，与获得的抗性片段一起连入用Hindi 11和EcoRI切好的pKC1139中，具体构 建可见附图7。 4 :敲除avaR2基因突变株的获得和生物效价的评定 将用于中断的重组质粒pWJb374转入到大肠杆菌ET12567中，通过大肠杆菌和链
霉菌之间的属间接合转移将重组质粒导入到链霉菌中，37t:整合后松弛诱导发生双交换，
筛选获得红霉素抗性而阿泊拉霉素敏感的双交换突变株。该突变菌株的基因型利用标记的 红霉素抗性基因的探针进行Southern杂交验证，基因型验证结果见图8。得到突变株。
发酵条件及HPLC检测方法同实施例1 。 分析HPLC结果可以看出，原始出发菌株阿维菌素的产量约为1321yg/ml，突变株 的产量为27ii g/ml，产量降低明显。具体的HPLC图谱及柱形图对比见附图9。
核苷酸序列表 〈110〉中国科学院上海有机化学研究所 〈120〉利用调控蛋白基因提高阿维菌素的产量 〈130〉说明书，权利要求书 〈160>3 〈170>PatentIn version 3.5 〈210>1 〈211>621 〈212>DNA 〈213>Streptomyces avermitilis 〈400〉 1gtggElgCCggc腿gg郷ggagcgtcatgccc朋gcaggcacgcgccctgcgtecctec60gaccgtgtactcgacgcggccgcctecgagttcgcccgatacggctecacg朋cgcg朋c120ctgcag朋catcgcggaccgcatcaggctgElCg朋gggElgcgctctecgggcatttcgcc180朋c朋ggaggaactggccgccgcgctggaccaccacctgtccgccacgctgggggtectg240ctcaccgaggcccggacatcgccccatccggcactgggccggctgcagtccctcgtcctc300ggtctgggccggctcttccggacggatctgcgggccctcgcggcgctgcggctcgcggcg360gagacggcccgttcgaccgcc朋gccgatecctctgctgacggagacgcacgacctcgtc420ctccagttggtgcgcgagac3C3gC3gg3ggggC3Ctgggacgcgtcgatctccaccagg■cctctggcggacctcatcgtggcggccctcttcggcacgttctggacggagaccgacacc540ggccacccagggtccgacgggaccgtcgacacgatgtgggaggccctggctcaggcgctc600ggcggcgccccggcccgctg621〈210>2〈211>705〈212>DNA〈213>Streptomyces avermitilis〈400>2gtggcgcggc3gg￡lgCg￡lgCcattcggacgcggcagacgattctggtcgccgcggccgag60gtgttcgacg3ggtggg3tecgaggcggcaaccatctccgacgtgctg朋gcgctcgggg120gtcacc朋gggggccctctecttccacttcacgtcg朋gcaggagctggcccaggccgtg180ctggccgagcaggtcgcctcccttccgcgcgtccccgagcaggagctg朋gctccagcag240tcgctggacgaggcgctgctgctcgcccatctgctcagggaaggcaccggcgatccgatc300gtccagggcagtgtgcggctgaccgtggaccagggctcgcCC3ggg3CC3tctcaaccgg360cgggtcccgatgcaggcctggaccgagcacacgcagtccctcttcgaagaggccagggcc420朋gggcg卿tcctgccccacgccgatgtggaagcgctcgccaagctgttcgtgggcgcg■ttcaccggcgtgcaggtcctctcgaggatcatgaccgggcgcgcggacctggcgg3gcgg540gtggccgacctcteccgccatctgatgccgtccttcgccatgccggggatcctggtccgc600ctggacttctccccggagcggggctcgcgggtgtecg朋gccgccatgaagC3gCggg3g660tcggcggcagcgagtecgacggacgcggcacggacgttgg3gtg3705
11
〈210>3 〈211>657 〈212>DNA 〈213>Streptomyces avermitilis 〈400>3gtg3Cg朋3Caggaacgcgccgcccgcacccgccacgccctcatccgctccgccgcccac60gccttcgaacggcagggcteC3C3C3ggCgaggctggccgacatcagcgcctgcgccggt120gtcagccccggcgcactgcacttccacttcg卿gc朋ggc卿ggtggcc郷gcggtg180g郷cggcggCgggggtgElgcctgcgccgggcggcctggctggcccagccgccgggcacg240aacgcgctgc朋cggctgacg朋cacgtcgcacgccctggccgagcgactgCgCgggg3C300gtcgtcgcccgcgcgggcttccggctgaactgcg朋tcggcgggcggcggcgcgctgaat360ctgctccggg朋tggC3g3CctgcgtggagcagctgctcgcggaggccgcCg3gg3gggg420ctgctggcccggcgcctcgtccgcgccgacacggtcagcgcggtggtggccgcgaccacc■ggtttcgaactgctcggccgccgggaccccgagtggctctccggccagtcgctggccgcg540ttctggcgggtectgctgccgcgcgcggcc3CggCggCggccctgaccgcggtggacccg600gacgggacgtgccccagccgggcgg卿cgcggaccccggcgaccaccgcCgg3tg3657
1权利要求
一类除虫链霉菌(Streptomyces avermitili)中A因子调控蛋白基因的用途，其特征在于对所述的基因的失活显著改变除虫链霉菌生产阿维菌素的能力；所述调控蛋白基因包括avaL2基因、avaR1基因或avaR2基因。
2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于将上市的avaL2基因或avaRl基因置换或中 断失活。
3. 如权利要求1和2所述的avaL2基因具有如下核苷酸序列GTGGAGCCGGCAAAGGAGGG
4.如权利要求1和2所述的avaRl基因具有如下核苷酸序列GTGGCGCGGCAGGAGCGAGC
5.如权利要求1所述的avaR2基因具有如下核苷酸序列GTGACGAAACAGGAACGCGCCGCCCGACCACCGCCGGATGA。
6.如权利要求2所述的用途，其特征在于所述的avaL2基因或avaRl基因置换或中断 失活包括如下步骤(1) :以Str印tomyces avermitilis的基因组为模板，采用PCR方法获得avaL2或 avaRl基因置换所须的左臂序列，包括上游序列及部分相应基因序列约2kb ;(2) :以Str印tomyces avermitilis的基因组为模板，采用PCR方法获得avaL2或avaRl基因置换所须的右臂序列，包括下游序列及部分相应基因序列约2kb ;(3) :将得到的左右臂序列和包含或不包含抗性基因片段通过相应的酶切位点克隆入 pKC1139载体中构建成基因置换重组质粒；(4) :将(3)获得的重组质粒以接合转移的方法转入Str印tomyces avermitilis中，经 整合、松弛培养诱导发生双交换及筛选鉴定后完成目标基因失活。
7.如权利要求1，2，6所述的用途，其特征在于提高产生阿维菌素的能力。
全文摘要
本发明公开了除虫链霉菌中一类调控蛋白基因的用途，对该类基因的失活可以显著改变除虫链霉菌生产阿维菌素的能力。所述调控蛋白基因包括avaL2基因、avaR1基因或avaR2基因，前二者的基因置换突变菌种可明显提高阿维菌素的产生能力，而后者的基因置换突变菌种可显著降低阿维菌素的产生能力。本发明还公开了利用这些基因构建产量提高的除虫链霉菌突变菌种的方法和应用，相应突变菌种发酵获得的阿维菌素产量与未经改造的菌株相比有大幅提高。
文档编号C12P19/62GK101724646SQ20091019674
公开日2010年6月9日 申请日期2009年9月29日 优先权日2009年9月29日
发明者唐功利, 王健博 申请人:中国科学院上海有机化学研究所