一种提高天然脱落酸发酵产量的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物发酵技术领域，涉及一种提高天然脱落酸发酵产量的新方法。
【背景技术】
[0002]脱落酸是植物五大天然生长调节剂之一。它在植物的生长发育中起多方面的作用，在农业上有广阔的应用前景，可以提高植物的抗旱和耐盐力，对开发利用低产田以及植树造林、绿化沙漠等有极高的价值；脱落酸还是抑制种子萌发的有效抑制剂，因此可以用于种子贮藏，保证种子、果实的贮藏质量；此外，脱落酸还能引起叶片气孔的迅速关闭，可用于花的保鲜，调节花期，促进生根等，在花卉园艺上有较大的应用价值。然而由于植物体中脱落酸含量极低，从中提取不可行；人工合成的外消旋型脱落酸是天然型和非天然型脱落酸的混合物，需拆分，不仅价格昂贵，而且生理活性低，极大地限制了它的研究应用。
[0003]为了解决和满足脱落酸应用于农业生产的需要，近年来，利用微生物发酵生产脱落酸受到关注，目前微生物发酵所用菌种以灰葡萄孢霉菌居多，例如，1982年，日本MarumoS等找到一种脱落酸产生菌-灰葡萄孢，该菌发酵7天可以积累52Pg/g的脱落酸；1993年，吴少伯等报道用灰葡萄孢固体发酵方法产生脱落酸产量仅为29ng/mL ;1995年，莫才清等报道从土壤中筛选出产脱落酸的真菌-灰葡萄孢霉菌，产量为18Pg/mL。为了提高灰葡萄孢霉菌发酵生产脱落酸的产量，人们对发酵培养基及发酵工艺进行了不同方面的优化及改进。例如，2007年，张卉等利用正交试验对脱落酸产生菌的发酵条件进行优化，确定出了使脱落酸产量提高的最佳组合，但其产量提升的幅度不是最高；2002年，郑珩等报道在发酵培养基中添加营养物质玉米粉、前体物质柠檬酸三钠以及改变葡萄糖与蔗糖的比例等可以提高灰葡萄孢霉菌发酵产脱落酸的产量，但所加入前体物质的浓度较高，使用量大，造成资源的浪费；公开号为CN101041837B的专利申请公开了一种在发酵过程中流加肌醇解除葡萄糖阻遏的工艺来制备天然脱落酸的方法，可使脱落酸的产量提高；公开号为CN1067724C的专利通过改造现有脱落酸产生菌，改变培养基配方，改液体批次发酵工艺为连续流加补料出料，添加关键底物的方法来提高脱落酸的产量；公开号为CN102399827B的专利申请公开了一种在发酵过程中流加乙酰辅酶A作为菌株合成脱落酸的前体物质，同时，添加生物表面活性剂吐温-20改善发酵液的溶氧状况来制备天然脱落酸的方法来提高脱落酸的产量，但肌醇和乙酰辅酶A价格相对昂贵，不利于节约成本。公开号为CN103409474A的专利申请公开了一种真菌固态发酵生产脱落酸的方法，与液体发酵相比，脱落酸产量明显提高。虽然以上现有技术在一定程度上提高了脱落酸的发酵产量，但发酵工艺繁琐，发酵产生的副产物较多，对氧的利用不充分；另外，添加的促进物质成本较高，不利于企业的后续推广；同时，脱落酸固态发酵操作复杂，不适于企业大规模的生产。
【发明内容】
[0004]本发明提供一种提高天然脱落酸发酵产量的方法，可以使菌株以较高的产物合成速率生产脱落酸，利于后续的工业化生产。
[0005]本发明所要解决的技术问题是菌体对氧的利用不充分，添加的发酵促进剂成本较尚，发酵液易粘桐。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案:
提供一种提高天然脱落酸发酵产量的方法，包括以下步骤:首先将能够产生脱落酸的灰葡萄孢霉菌接种在土豆葡萄糖琼脂(PDA)固体平板上活化培养4-5天，培养温度为25-28°C，然后将在平板上活化好的灰葡萄孢霉菌在种子培养基中培养48-72h，将种子液以5% ~10%的接种量接入液体发酵培养基，发酵培养9~10天产生脱落酸；所述的液体发酵培养基需要添加植物浸提液、丁二酸钠、钼酸铵中的一种或者两种以上组合。
[0007]本发明所述的提供一种提高天然脱落酸发酵产量的方法，其特征在于，在液体发酵培养基中添加植物浸提液、丁二酸钠、钼酸铵的一种或者两种以上组合。从而提高真菌发酵产天然脱落酸的产量。本发明中所用真菌为产天然脱落酸的灰葡萄孢霉菌，是我们从西红柿病果上分离筛选而得。
[0008]本发明所述的提供一种提高天然脱落酸发酵产量的方法，其特征在于，所用液体种子培养基的成分及含量如下，葡萄糖20g/L，MgS04.7H20 0.2g/L，KC1 0.5g/L，KH2P04
0.8g/L，维生素 B1 lmg/L,谷氨酸单钠盐 3.0g/L, FeS04.7H20 0.5mg/L，ZnS04.7H20 2.5mg/L，CuS04.7H20 4mg/L，用蒸馏水补足 1L。
[0009]本发明所述的提供一种提高天然脱落酸发酵产量的方法，其特征在于，所用的液体发酵培养基为ro液体培养基或专用液体发酵培养基；ro液体培养基的成分及比例如下，葡萄糖20g/L，土豆200g，洗净去皮，切块蒸煮后取其滤液，用蒸馏水补足1L ;专用液体发酵培养基的成分及含量如下，葡萄糖 20g/L，MgS04.7H20 0.2g/L，KC1 0.5g/L，CaC03 5g/L，KH2P04 0.8g/L，维生素 B1 lmg/L,谷氨酸单钠盐 3.0g/L, FeS04.7H20 0.5mg/L，ZnS04.7H20
2.5mg/L，CuS04.7H20 4mg/L，玉米粉 4g/L，用蒸馈水补足 1L。
[0010]本发明所述的提供一种提高天然脱落酸发酵产量的方法，其特征在于，所用植物浸提液为辣椒叶，番茄叶的浸提液，浸提时采用0.1M的磷酸盐缓冲液与粉碎的植物叶片组织按照重量比1: (0.02-0.2)在4°C下浸提12-24h，浸提后离心取其上清液作为浸提液，植物浸提液用孔径为0.22-0.45Mffl的膜过滤器过滤后加入液体发酵培养基中。
[0011 ] 液体发酵培养基中植物浸提液的加入量为2mL-10mL/L。
[0012]本发明所述的提供一种提高天然脱落酸发酵产量的方法，其特征在于，所用液体发酵培养基中丁二酸钠的浓度为l_15mM/L。
[0013]本发明所述的提供一种提高天然脱落酸发酵产量的方法，其特征在于，所用液体发酵培养基中钼酸铵的浓度为0.05-5mM/Lo
[0014]本发明所述的提供一种提高天然脱落酸发酵产量的方法，其特征在于，所用液体发酵培养基中丁二酸钠和钼酸铵的质量比为1: (0.2-12)。
[0015]本发明所述的提供一种提高天然脱落酸发酵产量的方法，对灰葡萄孢霉菌发酵生产天然脱落酸具有明显的促进作用，所添加的物质无毒，对环境无污染。其中，植物浸提液中的有效成分可以加速灰葡萄孢霉菌的生长，提高对氧的利用率，使菌株以较高的产物合成速率生产脱落酸；丁二酸钠作为前提物质，对灰葡萄孢霉菌发酵产天然脱落酸的产量有明显的提升作用；钼酸铵可以使发酵环境稳定，使发酵液粘度降低，促进脱落酸的合成；同时，本发酵工艺所添加物质来源广泛，成本较低，工艺简单，利于后续工业的生产应用。
【具体实施方式】
[0016]下列实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0017]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0018]下述实施例中所使用的菌种为灰葡萄孢霉菌，均为我们从西红柿病果上分离纯化而来。
[0019]实施例1
首先将保存的菌种在PDA平板上活化培养，将配制好的PDA培养基在121°C高压灭菌锅内灭菌30分钟后倒平板备用。然后将菌种在超净工作台中接种到固体平板上，在26-28°C下活化培养4-5天。将活化好的菌体用无菌接种环挑取到液体种子培养基中，打散摇匀，在28°C下摇瓶培养72h左右。
[0020]将种子培养基中培养好的菌种以5 %的接种量接入装有液体培养基的摇瓶进行发酵培养，PD液体培养基的成分及含量为:葡萄糖20g/L，土豆200g，洗净去皮后切成丁状，放入锅内在电磁炉上煮沸，定时30分钟，然后用四层纱布将煮好的土豆进行过滤，将其滤液用蒸馏水稀释到1L ;将辣椒叶片充分粉碎，按照0.1M的磷酸盐缓冲液与粉碎的辣椒叶片组织的重量比1:0.2浸提，浸提温度4°C，浸提时间为24h，离心后将其上清液用孔径为
0.45Pffl的膜过滤器过滤后备用；然后将配制好的ro液体培养基灭菌后分为两组，一组按10mL/L的用量加入辣椒叶浸提液，另一组不加辣椒叶浸提液作为对照；在28°C下以150转/分振荡发酵培养9天。
[0021 ] 通过高效液相色谱测得对照组脱落酸产量为4.65mg/L，加辣椒叶浸提液组脱落酸产量为29.8lmg/L,比对照组提高了 541.08%。
[0022]实施例2
菌种活化及种子培养方法同实施例1。将活化好的菌种以10%的接种量接入装有专用液体发酵培养基的摇瓶进行发酵培养，