专用液体发酵培养基的成分及含量为:葡萄糖20g/L，MgS04.7H20 0.2g/L，KCl 0.5g/L，CaC03 5g/L，KH2P04 0.8g/L，维生素 B1 lmg/L，谷氨酸单钠盐 3.0g/L, FeS04.7H20 0.5mg/L，ZnS04.7H20 2.5mg/L，CuS04.7H20 4mg/L，玉米粉4g/L，用蒸馏水补足1L。将辣椒叶片充分粉碎，按照0.1M的磷酸盐缓冲液与粉碎的辣椒叶片组织的重量比1:0.1浸提，浸提温度4°C，浸提时间为12h，离心后将其上清液用孔径为
0.45Pffl的膜过滤器过滤后备用；将配制好的专用液体发酵培养基灭菌后分为两组，一组按5mL/L的用量加入辣椒叶浸提液，另一组不加辣椒叶浸提液作为对照；在28°C下以150转/分振荡发酵培养9天。
[0023]通过高效液相色谱测得对照组脱落酸产量为7.07mg/L，加辣椒叶浸提液组脱落酸产量为23.89mg/L，比对照组提高了 237.91%。
[0024]实施例3
菌种活化及种子培养方法同实施例1。将活化好的菌种以10%的接种量接入装有专用液体发酵培养基的摇瓶进行发酵培养，专用液体发酵培养基的成分及含量为:葡萄糖20g/L，MgS04.7Η20 0.2g/L，KCl 0.5g/L，CaC03 5g/L，KH2P04 0.8g/L，维生素 B1 lmg/L，谷氨酸单钠盐 3.0g/L, FeS04.7H20 0.5mg/L，ZnS04.7H20 2.5mg/L，CuS04.7H20 4mg/L，玉米粉4g/L，用蒸馏水补足1L。将配制好的专用液体发酵培养基分为两组，一组加入丁二酸钠和钼酸钱，使丁二酸钠和钼酸钱在专用发酵培养基中的浓度分别为5mM/L和ImM/L，另一组则不加作为对照，灭菌后接入菌种；在28°C下以150转/分振荡发酵培养9天。
[0025]通过高效液相色谱测得对照组脱落酸产量为8.18mg/L，加丁二酸钠和钼酸铵组脱落酸产量为26.29mg/L，比对照组提高了 221.39%。
[0026]实施例4
菌种活化及种子培养方法同实施例1。将活化好的菌种以5 %的接种量接入装有ro液体培养基的摇瓶进行发酵培养，ro液体培养基的成分及含量为:葡萄糖20g/L，土豆200g，洗净去皮后切成丁状，放入锅内在电磁炉上煮沸，定时30分钟，然后用四层纱布将煮好的土豆进行过滤，将其滤液用蒸馏水稀释到1L ;将配制好的ro液体培养基分为两组，一组加入丁二酸钠和钼酸钱，使丁二酸钠和钼酸钱在液体培养基中的浓度分别为5mM/L和5mM/L，另一组则不加作为对照，灭菌后接入菌种；在28°C下以150转/分振荡发酵培养9天。
[0027]通过高效液相色谱测得对照组脱落酸产量为4.92mg/L，加丁二酸钠和钼酸铵组脱落酸产量为17.76mg/L，比对照组提高了 260.98%。
[0028]实施例5
菌种活化及种子培养方法同实施例1。将活化好的菌种以5%的接种量接入装有专用液体发酵培养基的摇瓶进行发酵培养，专用液体发酵培养基的成分及含量为:葡萄糖20g/L，MgS04.7H20 0.2g/L，KCl 0.5g/L，CaC03 5g/L，KH2P04 0.8g/L，维生素 B1 lmg/L，谷氨酸单钠盐 3.0g/L, FeS04.7H20 0.5mg/L，ZnS04.7H20 2.5mg/L，CuS04.7H20 4mg/L，玉米粉4g/L，用蒸馏水补足1L。将配制好的专用液体发酵培养基分为两组，一组加入丁二酸钠，使丁二酸钠在专用液体发酵培养基中的浓度为15mM/L，另一组则不加作为对照，灭菌后接入菌种；在28°C下以150转/分振荡发酵培养10天。
[0029]通过高效液相色谱测得对照组脱落酸产量为8.18mg/L，加丁二酸钠组脱落酸产量为35.18mg/L，比对照组提高了 330.07%。
[0030]实施例6
菌种活化及种子培养方法同实施例1。将活化好的菌种以8 %的接种量接入装有ro液体培养基的摇瓶进行发酵培养，ro液体培养基的成分及含量为:葡萄糖20g/L，土豆200g，洗净去皮后切成丁状，放入锅内在电磁炉上煮沸，定时30分钟，然后用四层纱布将煮好的土豆进行过滤，将其滤液用蒸馏水稀释到1L ;将西红柿叶片粉碎，按照0.1M的磷酸盐缓冲液与粉碎的西红柿叶片组织的重量比1:0.02浸提，浸提温度4°C，浸提时间为12h，离心后其上清液用孔径为0.22μπι的膜过滤器过滤后备用；将配制好的ro液体培养基分为两组，一组加入丁二酸钠，使丁二酸钠在液体培养基中的浓度为5mM/L，另一组则不加作为对照，灭菌后将西红柿叶浸提液按2mL/L的用量加入丁二酸钠组的液体培养基中，然后接入菌种；在28°C下以150转/分振荡发酵培养9天。
[0031]通过高效液相色谱测得对照组脱落酸产量为4.92mg/L，加丁二酸钠和西红柿叶浸提液组脱落酸产量为20.57mg/L，比对照组提高了 318.09%。
【主权项】
1.一种提高天然脱落酸发酵产量的方法，包括以下步骤:首先将能够产生脱落酸的灰葡萄孢霉菌接种在土豆葡萄糖琼脂(PDA)平板上活化培养4~5天，培养温度为25~28°C，然后将活化好的灰葡萄孢霉菌在种子培养基中培养48~72h，将种子液以5% ~10%的接种量接入液体发酵培养基，发酵培养9~10天产生脱落酸；所述的液体发酵培养基需要添加植物浸提液、丁二酸钠、钼酸铵中的一种或者两种以上组合。2.根据权利要求1所述的提高天然脱落酸发酵产量的方法，其特征在于，所用种子培养基的成分及含量如下，葡萄糖 20g/L，MgS04.7H20 0.2g/L，KCl 0.5g/L，KH2P04 0.8g/L，维生素 B1 lmg/L，谷氨酸单钠盐 3.0g/L，FeS04.7H20 0.5mg/L，ZnS04.7H20 2.5mg/L，CuS04.7H20 4mg/L，用蒸馏水补足 1L。3.根据权利要求1所述的提高天然脱落酸发酵产量的方法，其特征在于，所用的液体发酵培养基为ro液体培养基或专用液体发酵培养基。4.根据权利要求3所述的提高天然脱落酸发酵产量的方法，其特征在于，专用液体发酵培养基的成分及含量如下，葡萄糖20g/L，MgS04*7H20 0.2g/L，KCl 0.5g/L，CaC03 5g/L，KH2P04 0.8g/L，维生素 B1 lmg/L,谷氨酸单钠盐 3.0g/L, FeS04.7H20 0.5mg/L，ZnS04.7H202.5mg/L，CuS04.7H20 4mg/L，玉米粉 4g/L，用蒸馈水补足 1L。5.根据权利要求1所述的提高天然脱落酸发酵产量的方法，其特征在于，所用植物浸提液为辣椒叶、番茄叶的浸提液，浸提液用孔径为0.22-0.45Mffl的膜过滤器过滤后使用。6.根据权利要求5所述的提高天然脱落酸发酵产量的方法，其特征在于，采用0.1M的磷酸盐缓冲液与粉碎的植物叶片组织按照重量比1: (0.02-0.2)进行浸提，浸提温度4°C，时间为12~24h，浸提后离心取其上清液作为浸提液。7.根据权利要求5所述提高天然脱落酸发酵产量的方法，其特征在于，所用液体发酵培养基中植物浸提液的加入量为2mL~10mL/L。8.根据权利要求1所述提高天然脱落酸发酵产量的方法，其特征在于，所用液体发酵培养基中丁二酸钠的浓度为l~15mM/L。9.根据权利要求1所述提高天然脱落酸发酵产量的方法，其特征在于，所用液体发酵培养基中钼酸铵的浓度为0.05~5mM/Lo10.根据权利要求1所述提高天然脱落酸发酵产量的方法，其特征在于，所用液体发酵培养基中丁二酸钠和钼酸铵的质量比为1: (0.2-12)。
【专利摘要】本发明涉及一种提高脱落酸发酵产量的方法，属于微生物发酵技术领域。该方法包括以下步骤：将能够产生脱落酸的灰葡萄孢霉菌接种在土豆葡萄糖琼脂（PDA）固体平板上活化培养，将在平板上活化好的灰葡萄孢霉菌进行种子培养，将培养好的种子液接入液体发酵培养基进行发酵培养；在液体发酵培养基中添加植物浸提液、丁二酸钠、钼酸铵的一种或两种以上组合，从而提高真菌发酵产天然活性脱落酸的产量。本发明方法不仅可提高菌株对氧的利用率，而且还能够加速菌体的生长，使菌株以较高的产物合成速率生产脱落酸；同时本工艺所用材料来源广泛，降低了生产成本，简化了工艺流程，利于后续的工业应用。
【IPC分类】C12P7/42, C12R1/645
【公开号】CN105400833
【申请号】CN201510913272
【发明人】苏振峰, 王庆国, 李艳华, 贾梦奇, 王龙龙, 张兴荣
【申请人】山东营养源食品科技有限公司
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年12月11日