一种提高尼莫克汀产量的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物发酵领域，具体地说，涉及一种提高尼莫克汀产量的方法。
【背景技术】
[0002]有机化学农药发明于上世纪四十年代，它的出现极大地增强了人类控制病虫危害的能力，为挽回农作物产量损失作出了重大贡献，但是，有机化学农药普遍毒性较高、安全性低、对环境影响大，它的长期和大量使用已经带来了众所周知的环境污染、生态破坏和食品安全等一系列问题，严重影响了农业经济的可持续发展。在过去的十几年里，各国先后不同程度地减少了化学农药的用量，2003年12月欧盟正式禁止320种农药在欧盟的销售，其中涉及中国的达60多种，有氧乐果、三胜磷、甲氧菊酯、丙溴磷、稻瘟灵、恶双灵等化学合成的高毒性品种，2004年中国农业部发布公告:自本年6月30日起，不得在市场上销售含甲胺磷、对硫磷、甲基对硫磷、久效磷和磷铵5种高毒有机磷农药的复配产品。随着高毒化学农药逐步退出市场，生物农药的研究与应用得到了广泛关注。与化学农药相比，生物农药具有杀虫机制新颖，环境残留低，对人畜更安全等优点，是未来有害生物综合防治的理想绿色农药。
[0003]尼莫克汀(Nemadectin)是十六元大环内酯类抗生素,属于米尔贝霉素家族，以尼莫克汀为基础半化学合成的莫西克汀(Moxidectin)在驱线虫和杀寄生虫方面有着优良效果，是目前最有前途的广谱、高效、新型、无交叉感染的生物杀虫剂，被誉为当今活性最高的杀虫剂之一ο 该化合物由蓝灰链霉菌(Streptomyces cyaneogriseus sp.Noncyanogenus)发酵产生，分子式为C36H52O8,分子量为612.8，纯品为白色粉末，关于此药物在国外已有较多报道，而国内研究才刚刚起步，市场潜力巨大。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种提高尼莫克汀产量的方法。
[0005]为了实现本发明目的，本发明的一种提高尼莫克汀产量的方法，以保藏编号为CGMCC N0.8731 的蓝灰链霉菌(Streptomyces cyaneogriseus)BJX003 作为生产菌株,进行尼莫克汀的发酵生产，当发酵液中还原糖的浓度低于12-18g/L时，补加含有黄豆饼粉的葡萄糖溶液，并将还原糖的浓度控制在12-18g/L ;其中补料液中葡萄糖的浓度为300-400g/L，黄豆饼粉的浓度为75-125g/L，以水配制。
[0006]本发明提供的蓝灰链霉菌(Streptomyces cyaneogriseus)BJX003,现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC N0.8731，保藏日期2014年I月17曰。
[0007]前述的方法,发酵使用的发酵培养基为:葡萄糖40_60g/L、乳糖20_50g/L、酵母粉20-50g/L、磷酸氢二钾l_3g/L、七水硫酸镁0.5_2g/L、氯化钠8.5-12.5g/L和碳酸钙10-30g/L, pH 值 7.2，以水配制。
[0008]优选地，发酵培养基为:葡萄糖50g/L、乳糖35g/L、酵母粉35g/L、磷酸氢二钾2g/L、七水硫酸镁1.2g/L、氯化钠10g/L和碳酸钙20g/L。
[0009]发酵的条件为:26-30 °C，转速150-220rpm，通气比1:0.3-0.7，罐压
0.03-0.04MPa，溶氧控制在40%以上，发酵周期为192_264hr。
[0010]本发明具有以下优点:
[0011](一 )利用蓝灰链霉菌BJX003发酵生产尼莫克汀的过程中，补加的葡萄糖可为发酵过程提供充足的碳源；黄豆饼粉属于迟效氮源，在发酵早期由于菌体内的各种蛋白酶系形成并不完善，对其利用的能力较低，当进入发酵中后期，对其利用能力增强，此时补加黄豆饼粉，可为发酵过程提供充足的氮源。
[0012]( 二)采用本发明方法可使尼莫克汀产量从3200 μ g/mL左右提高至3400 μ g/mL左右。
【具体实施方式】
[0013]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0014]以下实施例中涉及的培养基和培养条件如下:
[0015]斜面培养基组成:可溶性淀粉50g/L、葡萄糖40g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、七水硫酸镁5g/L、氯化钠5g/L、碳酸钙lg/L和琼脂20g/L组成，pH值7.2，以水配制；115°C，灭菌20分钟。灭菌前以100g/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2。斜面培养条件:将蓝灰链霉菌BJX003接种到斜面培养基上，在28°C，环境相对湿度为50-60%条件下培养10-12天。
[0016]种子培养基组成:葡萄糖10g/L、麦芽糊精为20g/L、豆饼粉15g/L、酵母粉10g/L、硫酸镁lg/L、磷酸氢二钾lg/L，以水配制。种子培养基的pH值为7.2，121°C，灭菌30min。种子培养条件:挖取斜面培养好的菌苔Icm2，将其转接入盛有30mL灭菌的种子培养基的种子瓶中，在28°C，环境相对湿度为50-60 %，转速180-200rpm，旋转半径50mm的条件下，振荡培养44-48小时(至对数生长期)，得到摇瓶种子培养液。将摇瓶种子培养液按I % (v/v)接种量接到装有25L种子培养基的50L种子罐中，在28°C，转速200rpm，通气比1:0.5，罐压0.05MPa，溶氧控制在40%以上的条件下，培养20小时，得到种子培养液。
[0017]实施例1提高尼莫克汀产量的方法
[0018]对蓝灰链霉菌BJX003进行斜面培养、种子培养和发酵培养。
[0019]发酵培养方法:取种子培养液按5% (v/v)的接种量接种于装有25L发酵培养基的50L发酵罐中，在28°C，转速200rpm，通气比1:0.5，罐压0.03MPa,溶氧控制在40 %以上的条件下，发酵培养240小时，得到发酵液。发酵过程中，当发酵液中还原糖的浓度低于15g/L时，补加含有黄豆饼粉的葡萄糖溶液，并将还原糖的浓度控制在15g/L ;其中补料液中葡萄糖的浓度为350g/L，黄豆饼粉的浓度为100g/L，以水配制。
[0020]发酵使用的发酵培养基为:葡萄糖50g/L、乳糖35g/L、酵母粉35g/L、磷酸氢二钾2g/L、七水硫酸镁1.2g/L、氯化钠10g/L和碳酸钙20g/L，pH值7.2，以水配制。
[0021]实施例2提高尼莫克汀产量的方法
[0022]对蓝灰链霉菌BJX003进行斜面培养、种子培养和发酵培养。
[0023]发酵培养方法:取种子培养液按5% (v/v)的接种量接种于装有25L发酵培养基的50L发酵罐中，在26°C，转速180rpm，通气比1: 0.3，罐压0.04MPa,溶氧控制在40 %以上的条件下，发酵培养192小时，得到发酵液。发酵过程中，当发酵液中还原糖的浓度低于12g/L时，补加含有黄豆饼粉的葡萄糖溶液，并将还原糖的浓度控制在12g/L ;其中补料液中葡萄糖的浓度为300g/L，黄豆饼粉的浓度为75g/L。
[0024]发酵使用的发酵培养基为:葡萄糖40g/L、乳糖20g/L、酵母粉20g/L、磷酸氢二钾lg/L、七水硫酸镁0.5g/L、氯化钠8.5g/L和碳酸钙10g/L，pH值7.2，以水配制。
[0025]实施例3提高尼莫克汀产量的方法
[0026]对蓝灰链霉菌BJX003进行斜面培养、种子培养和发酵培养。
[0027]发酵培养方法:取种子培养液按5% (v/v)的接种量接种于装有25L发酵培养基的50L发酵罐中，在30°C，转速220rpm，通气比1:0.7，罐压0.03MPa,溶氧控制在40 %以上的条件下，发酵培养264小时，得到发酵液。发酵过程中，当发酵液中还原糖的浓度低于18g/L时，补加含有黄豆饼粉的葡萄糖溶液，并将还原糖的浓度控制在18g/L ;其中补料液中葡萄糖的浓度为400g/L，黄豆饼粉的浓度为125g/L。
[0028]发酵使用的发酵培养基为:葡萄糖60g/L、乳糖50g/L、酵母粉50g/L、磷酸氢二钾3g/L、七水硫酸镁2g/L、氯化钠12.5g/L和碳酸钙30g/L，pH值7.2，以水配制。
[0029]实施例4尼莫克汀的提取及产量检测
[0030]1、提取方法如下:
[0031]发酵液预处理:取Iml发酵液于离心管中，加入9ml甲醇，混合均匀后超声15分钟(超声功率200w)，于4000rpm离心15min，然后将上清液用0.22 μ m滤膜过滤，备用。
[0032]2、HPLC 分析:
[0033]采用安捷伦1100型高效液相
[0034]色谱仪，150_X4.6mm(i.d)不镑钢柱，内填 Reliasil C18 型号为 Wondasil 的C18反相柱，柱温25°C，取上述滤液，进样量20yL;以甲醇冰(体积比17:3)为流动相进行分离，流速lmL/min，利用UV检测器在波长240nm处检测并自动形成分离图谱。
[0035]结果表明，实施例1-3中尼莫克汀的发酵产量分别为3427 μ g/mL,3385 μ g/mL和3410 μ g/mL。
[0036]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1.一种提高尼莫克汀产量的方法，其特征在于，以保藏编号为CGMCC N0.8731的蓝灰链霉菌(Streptomyces cyaneogriseus)BJX003作为生产菌株,进行尼莫克汀的发酵生产，当发酵液中还原糖的浓度低于12-18g/L时，补加含有黄豆饼粉的葡萄糖溶液，并将还原糖的浓度控制在12-18g/L ;其中补料液中葡萄糖的浓度为300-400g/L，黄豆饼粉的浓度为75-125g/L。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵使用的发酵培养基为:葡萄糖40-60g/L、乳糖20-50g/L、酵母粉20_50g/L、磷酸氢二钾l_3g/L、七水硫酸镁0.5_2g/L、氯化钠8.5-12.5g/L和碳酸钙10-30g/L，pH值7.2，以水配制。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵使用的发酵培养基为:葡萄糖50g/L、乳糖35g/L、酵母粉35g/L、磷酸氢二钾2g/L、七水硫酸镁1.2g/L、氯化钠10g/L和碳酸钙20g/L。4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，发酵的条件为:26-30°C，转速150-220rpm,通气比1:0.3-0.7，罐压0.03-0.04MPa,溶氧控制在40 %以上，发酵周期为192-264hr。
【专利摘要】本发明提供一种提高尼莫克汀产量的方法，其以保藏编号为CGMCC？No.8731的蓝灰链霉菌(Streptomyces？cyaneogriseus)BJX003作为生产菌株，进行尼莫克汀的发酵生产，当发酵液中还原糖的浓度低于12-18g/L时，补加含有黄豆饼粉的葡萄糖溶液，并将还原糖的浓度控制在12-18g/L；其中补料液中葡萄糖的浓度为300-400g/L，黄豆饼粉的浓度为75-125g/L。采用本发明方法可使尼莫克汀产量从3200μg/mL左右提高至3400μg/mL左右。CGMCC No873120140117
【IPC分类】C12P17/18, C12R1/465
【公开号】CN105624229
【申请号】CN201410598718
【发明人】王书睿, 周贤龙
【申请人】牡丹江佰佳信生物科技有限公司
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2014年10月30日