专利名称：一种尼莫克汀的制备方法
技术领域：
本发明属于动物药品领域，涉及一种抗生素的制备方法，特别涉及一种通过发酵培养尼莫克汀产生菌，继而对发酵产物进行纯化，获得高纯度尼莫克汀的方法。
背景技术：
尼莫克汀(Nemadectin)是一种十六元大环内酯类抗生素，由蓝灰链霉菌 (Streptomycescyaneogriseus sp. Noncyanogenus)经发酵过禾呈生产。作为米尔贝霄素族的一员，尼莫克汀主要用于合成活性更强的驱虫药莫西克汀(Moxidectin)。欧洲专利EP0170006A2公开了一种尼莫克汀的生产培养基与发酵工艺。首先将蓝灰链霉菌接种于含葡萄糖1.0%、糊精2.0%、酵母浸出物0.5%、NZ胺(酪蛋白的酶促水解物)0. 5 %和碳酸钙0. 1 %的培养基中(注各物质的百分含量单位是g/mL，例如0. 1 %即 0. 001g/mL，指IOOmL溶液中含有0. Ig溶质，这是生化领域中将固体物质配制成溶液试剂时通用的浓度表示方法，下同，不再赘述)J8°C培养48-7池，作为一级种子；将一级种子接入同样的培养基，28°C培养48h，作为二级种子；然后将IL二级种子液接入含糊精1.0%、大豆蛋白胨1.0%、糖蜜1.0%、碳酸钙0. 的培养基30L中，于30°C发酵培养，发酵罐的空气流量30L/min，罐压8磅，搅拌500rpm，培养91h后放罐。该发明同时公开了发酵液中包括尼莫克汀及其结构类似物在内的发酵产物的分离纯化方法对发酵液加硅藻土为助滤剂过滤得到湿菌丝渣；用甲醇萃取湿菌丝渣；萃取液经浓缩后再用二氯甲烷萃取；收集二氯甲烷相经无水硫酸钠干燥、浓缩，再经硅胶柱层析得到尼莫克汀。该发明所描述的方法存在以下缺陷发酵过程产生大量的尼莫克汀结构类似物；发酵液因过滤困难使用了大量的助滤剂，产生大量的过滤废水，导致环境污染；使用甲醇萃取湿菌丝渣，甲醇的用量过大；以及， 使用一次性的硅胶分离尼莫克汀，导致尼莫克汀提取成本的增加。申请号为200810U6358. 3的中国专利申请公开了一种制备高纯度莫西克汀的方法，其中尼莫克汀的制备方法如下采用固液分离的方式处理发酵液，浸取后得到HPLC纯度在13% 18%之间的尼莫克汀提取液；然后用20 40目大孔树脂吸附提取液中的尼莫克汀，尼莫克汀对应树脂吸附量为10g/L ；再用有机溶剂与水的混合溶剂洗脱被吸附的尼莫克汀，洗脱液经浓缩处理后得到纯度约41% 45%的尼莫克汀初品。由于蓝灰链霉菌在长时间培养后菌丝容易断裂、自溶，使用固液分离的方式处理发酵液很困难，导致该发明的浸取纯度低、效率低，因此，随后经大孔树脂吸附纯化获得的尼莫克汀的纯度较低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高纯度的尼莫克汀制备方法。本发明的技术方案如下一种尼莫克汀的制备方法，将生产尼莫克汀的发酵液直接喷雾干燥，得到固体粉末；然后用有机溶剂萃取该固体粉末，将萃取液过滤后用大孔树脂吸附过滤液中的尼莫克汀；最后将大孔树脂吸附的尼莫克汀洗脱下来，对洗脱液进行萃取、浓缩、干燥，获得尼莫克
进一步的，在对蓝灰链霉菌进行发酵培养的发酵培养基中，碳源含量为20 110. Og/L,氮源含量为5 40. Og/L,硫酸镁含量为1 5g/L，硝酸钾含量为2 8g/L，发酵培养基的pH为6. 0 8. 0。其中，碳源可以是葡萄糖、麦芽糊精、可溶性淀粉、工业淀粉、乳糖、麦芽糖等中的一种或多种；氮源可以是黄豆粉、黄豆饼粉、豆粕粉、酵母粉、酵母浸出粉、 酵母自溶粉、麦芽浸出粉、玉米蛋白粉、棉籽粉等中的一种或多种；将配制好的发酵培养基于121°C灭菌30min，备用。以1 30的体积比将制备好的种子液接入发酵培养基，28°C培养200 250h，实现了工业化放大生产。对发酵液直接进行喷雾干燥的过程采用气流喷嘴式或离心喷嘴式喷雾干燥机，优选采用气流喷嘴式喷雾干燥机，将喷雾干燥机的气体进口温度控制在120 180°C，气体出口温度控制在100 120°C，塔内物料温度保持在60 90°C，塔内压力保持在250 350kPa，得到固体粉末(即固体发酵干燥菌粉)。喷雾干燥后获得的固体粉末可用其3-5倍重量浓度大于95%的乙醇进行回流萃取，得到萃取液(萃取液中尼莫克汀的HPLC纯度约50-65%)；然后将萃取液稀释至乙醇浓度为50-55%，用板框过滤机过滤；过滤液用大孔树脂柱进行层析，大孔树脂优选采用日本三菱化学生产的HP20SS大孔树脂，每升树脂能吸附约15g尼莫克汀。用60 80% (体积比)的乙醇进行洗脱，收集HPLC纯度大于85%的洗脱液进行减压浓缩以去除乙醇，再用二氯甲烷对浓缩液进行萃取，将萃取液减压浓缩至干得到尼莫克汀。本发明制备尼莫克汀的方法工艺简单、成本低、易操作，且所制备的尼莫克汀纯度高。本发明对发酵液采取直接喷雾干燥，得到的固体发酵干燥菌粉耐运输、易保藏，降低了尼莫克汀降解产物的产生，同时该菌粉易萃取，后续萃取时溶媒的消耗量少；优化的发酵培养基与发酵工艺提高了发酵单位和发酵主产物尼莫克汀组分含量；下游纯化工艺只使用了一种大孔树脂吸附，一次层析操作就能获得高纯度的尼莫克汀产品。总之，该尼莫克汀的制备方法具有高效、环保、经济效益显著等突出优点。
图1是实施例1的发酵液尼莫克汀HPLC测定图。图2是实施例1最终得到的尼莫克汀高纯度产品的HPLC测定图。图3是实施例1用75%的乙醇对吸附了尼莫克汀的HP20SS树脂柱进行解析的 HPLC解析曲线。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本领域的技术人员应当理解，实施例仅起到示例作用，而不以任何方式限制本发明的范围。实施例11、尼莫克汀的发酵生产过程发酵培养基的各组分及其含量为葡萄糖 4. 0%麦芽糖 7.0%黄豆粉 2.5%
酵母浸出粉0.5%硫酸镁0.3%硝酸钾0.5%将培养基调pH至7.0，然后于121°C灭菌30min，备用。将制备好的蓝灰链霉菌种子液(注种子液的菌浓度为18 对％，为离心后测得的菌沉淀的体积百分含量)IL接入30L已制备好的发酵培养基中，28°C培养214h。然后用 HPLC检测发酵液中尼莫克汀的纯度，具体方法是取5ml发酵液加入IOml甲醇，超声作用 30min，然后取上清液供HPLC分析。色谱柱为ODS C18，流动相为甲醇水=85 15(体积比)，检测波长为240nm，进样量为20 μ 1，流速为1. Oml/min。采用面积归一法，去除发酵液中的蛋白质、核酸、色素等吸收峰，计算得到发酵液中尼莫克汀的发酵单位为1. 78g/L，纯度大于55%，如图1所示。2、喷雾干燥过程对发酵液直接采用气流喷嘴式喷雾干燥机进行喷雾干燥，气体进口温度为170°C， 气体出口温度为110°c，塔内物料温度保持在70°C，塔内压力保持在250kPa，加料速度为 15L/h，得粒度40目 100目的固体发酵干燥菌粉。3、尼莫克汀的纯化过程将固体发酵干燥菌粉用3倍重量的浓度大于95%的乙醇回流萃取，得到尼莫克汀 HPLC纯度约55 %的萃取液。然后将萃取液用40 45 %的乙醇溶液稀释至乙醇浓度为50 % 后进行过滤，过滤液上树脂柱层析，树脂为HP20SS (三菱化学，日本)，每升树脂吸附15g尼莫克汀。用75%的乙醇进行洗脱，得到的解析曲线如图3所示，从图中可以看出洗脱过程中洗脱液体积与尼莫克汀浓度和纯度之间的关系，收集HPLC纯度大于85%的解析液并合并。将合并后的尼莫克汀HPLC纯度大于85%的洗脱液进行减压浓缩以去除乙醇，浓缩液用二氯甲烷进行萃取，对萃取液减压浓缩至干，得到尼莫克汀，经HPLC测定其纯度大于90% (注尼莫克汀HPLC纯度检测条件参照发酵液中尼莫克汀HPLC纯度检测条件)，如图2所
7J\ ο实施例21、尼莫克汀的发酵生产过程发酵培养基的各组分及其含量为可溶性淀粉2%
乳糖8%
棉籽粉3%
酵母自溶粉1%
硫酸镁0. 3%
硝酸钾0. 5%将培养基调pH至7.0，然后于121°C灭菌30min，备用。将制备好的蓝灰链霉菌种子液(注种子液的菌浓度为18 M%，V/V) IL接入 30L已制备好的发酵培养基中，28°C培养220h。采用与实施例1相同的方法，经HPLC测定发酵液中尼莫克汀的发酵单位为1.78g/L，纯度大于53%。2、直接喷雾干燥过程对发酵液直接采用气流喷嘴式喷雾干燥机进行喷雾干燥，气体进口温度为150°C，气体出口温度为110°c，塔内物料温度保持在80°C，塔内压力保持在230kPa，加料速度为 20L/h，得粒度60目 100目的固体发酵干燥菌粉。3、尼莫克汀的纯化过程将固体发酵干燥菌粉用4倍重量的浓度大于95%的乙醇回流萃取，得到HPLC纯度约63%的萃取液。然后将萃取液用40 45%的乙醇溶液稀释至乙醇浓度为50%后进行过滤，过滤液上树脂柱层析，树脂为HP20SS (三菱化学，日本)，每升树脂吸附15g尼莫克汀。用65%的乙醇进行洗脱。收集HPLC纯度大于85%的洗脱液合并进行浓缩以去除乙醇，浓缩液用二氯甲烷进行萃取，对萃取液减压浓缩至干，得到尼莫克汀，经HPLC测定其纯度大于94%。实施例31、尼莫克汀的发酵生产过程发酵培养基的各组分及其含量为可溶性淀粉1%
乳糖3%
棉籽粉3%
酵母自溶粉1%
硫酸镁0. 3%
硝酸钾0. 5%将培养基调pH至7.0，然后于121°C灭菌30min，备用。将制备好的蓝灰链霉菌种子液(注种子液的菌浓度为18 M%，V/V) IL接入 30L已制备好的发酵培养基中，28°C培养220h。采用与实施例1相同的方法，经HPLC测定发酵液中尼莫克汀的发酵单位为1. 66g/L，纯度大于50%。2、直接喷雾干燥过程和尼莫克汀纯化过程同实施例2，尼莫克汀产品经HPLC测定其纯度大于91 %。
权利要求
1.一种尼莫克汀的制备方法，将生产尼莫克汀的发酵液直接喷雾干燥，得到固体粉末； 然后用有机溶剂萃取该固体粉末，将萃取液过滤后用大孔树脂吸附过滤液中的尼莫克汀； 最后将大孔树脂吸附的尼莫克汀洗脱下来，对洗脱液进行萃取、浓缩、干燥，获得尼莫克汀产品。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，对蓝灰链霉菌进行发酵培养获得所述发酵液，所采用的发酵培养基含有20 110. Og/L的碳源、5 40. Og/L的氮源、1 5g/L 的硫酸镁和2 8g/L的硝酸钾，ρΗ6· 0 8. 0。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述碳源选自葡萄糖、麦芽糊精、可溶性淀粉、工业淀粉、乳糖和麦芽糖中的一种或多种。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述氮源选自黄豆粉、黄豆饼粉、豆粕粉、酵母粉、酵母浸出粉、酵母自溶粉、麦芽浸出粉、玉米蛋白粉和棉籽粉中的一种或多种。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，发酵培养是在条件下培养200 250h。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述喷雾干燥采用气流喷嘴式或离心喷嘴式喷雾干燥机，气体进口温度控制在120 180°C，气体出口温度控制在100 120°C， 塔内物料温度保持在60 90°C，塔内压力保持在250 350kPa，得到固体粉末。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，采用浓度大于95%的乙醇对固体粉末进行回流萃取。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，喷雾干燥得到的固体粉末用其3-5倍重量的浓度大于95%的乙醇进行回流萃取，将萃取液稀释至乙醇浓度为50-55%后进行过滤，再用大孔树脂吸附过滤液中的尼莫克汀。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述大孔树脂采用日本三菱化学生产的HP20SS大孔树脂。
10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，采用60 80%的乙醇对大孔树脂吸附的尼莫克汀进行洗脱，收集HPLC纯度>85%的洗脱液进行减压浓缩以去除乙醇，浓缩液再用二氯甲烷进行萃取，再将萃取液减压浓缩至干，得到尼莫克汀产品。
全文摘要
本发明公开了一种尼莫克汀的制备方法，将生产尼莫克汀的发酵液直接喷雾干燥，得到固体粉末；然后用有机溶剂萃取该固体粉末，将萃取液过滤后用大孔树脂吸附过滤液中的尼莫克汀；最后将大孔树脂吸附的尼莫克汀洗脱下来，对洗脱液进行萃取、浓缩、干燥，获得尼莫克汀纯品。该方法对发酵液采取直接喷雾干燥，得到的固体发酵干燥菌粉耐运输、易保藏，降低了尼莫克汀降解产物的产生，同时该菌粉易萃取，萃取溶媒的消耗量少，整个工艺简单、成本低、易操作，且所制备的尼莫克汀HPLC纯度很高，达到90％以上。
文档编号C07H1/06GK102336796SQ20101023784
公开日2012年2月1日 申请日期2010年7月27日 优先权日2010年7月27日
发明者何勇崴, 刘会明, 刘省伟, 别一, 岳光, 赵德, 郭明 申请人:北大国际医院集团有限公司, 北大国际医院集团重庆大新药业股份有限公司, 北大方正集团有限公司