一种利用壳聚糖提高纤维素酶产量的方法
【专利摘要】本发明涉及到提高纤维素酶的方法，通过向发酵体系当中添加一种产酶促进剂壳聚糖，使得产酶得到提高。所述添加剂壳聚糖为经过脱乙酰化的动物甲壳，添加量为0.5g/L～2.0g/L。通过添加壳聚糖，能使纤维素酶酶活提高50％～60％。而且，壳聚糖本身来源广泛价格低廉容易获得，不仅降低了生产成本，而且了提高生产效率，因此在生产纤维素酶工业中具有良好的应用前景。
【专利说明】
一种利用壳聚糖提高纤维素酶产量的方法
技术领域
[0001]本发明属于酶发酵技术领域，是涉及到在发酵过程中添加一种物质壳聚糖提高纤维素酶酶活的方法。
技术背景
[0002]纤维素酶是几种单酶复合物的简称，其具有将木质纤维素降解成葡萄糖，进而发酵生产其他产物能力，因此具有广阔的前景。在通过生物发酵工艺将木质纤维素发酵成生物燃料乙醇或者其他工业产品的生产过程中占据重要地位。因此，纤维素酶的生产成本和效率也成为能否实现生物质能源以及其他产品替代化石能源的关键因素之一。
[0003]纤维素酶生产工艺一般采用液体深层次发酵，即在开始的时候，一次性投入适量的碳源、氮源、微量元素以及其他生长因子等，并控制发酵过程中的温度、溶氧、转速、PH等为微生物创造一个最佳的生长产酶条件。进而获得具有较高酶活力的纤维素酶。在发酵过程中，除了控制一些参数外，还需要向发酵体系当中添加一定量的氮源以及其他物质，以期达到诱导产酶和促进酶的分泌等，进而提高滤纸酶活。而在发酵前期如果加入足量的营养物质，则会导致菌体生长过盛，以至于后期不能满足产酶需求。而在发酵过程中添加，则能够使菌体进入稳定期，进而进入产酶期，最终得到高滤纸酶活。而在发酵过程中，补加固体物料由于增加染菌几率，不适合大量补加。而在发酵过程中添加一定量的其他诱导物也能起到促进产酶分泌的作用。
[0004]此外往发酵培养体系当中添加一些其他物质能够促进产酶提高，当往发酵体系当中添加诱导物时，诱导物会穿过细胞壁，进入细胞内部，与合成纤维素酶基因的DNA结合，从而诱导纤维素酶基因，使其表达大大提高，进而提高纤维素酶酶活。而当往发酵体系当中添加表面活性剂时，能够破坏细胞壁表面的结构，改变细胞壁的构型，进而加大了内容物流出的可能进而提高纤维素酶酶活。
【发明内容】
[0005]本发明的目的主要是:提供一种在发酵过程中添加壳聚糖，进而促进酶的表达和促进产酶的分泌。在产酶阶段向发酵体系当中添加壳聚糖，在壳聚糖被纤维素酶水解同时，壳聚糖可能作用于纤维素酶基因诱导酶的表达;其次，壳聚糖本身带有一定的电荷，进而影响细胞壁的表面结构，对酶的分泌有一定的促进作用。进而获得较高的滤纸酶活。
[0006]本发明的技术方法提高纤维素酶的过程如下:
[0007](I)培养基的配置:以纤维素物料作为唯一碳源，以玉米浆、蛋白胨、硫酸铵、氨水等其中的一种或几种为氮源配置培养基。在发酵摇瓶当中250mL的摇瓶装液量控制在50mL，于121°C 灭菌 20min;
[0008](2)接种与发酵:待灭菌后等却到室温，按照2%?6% (v/v)的接种量接种种子液，并添加所需的铁、钴、猛、锌等微量元素I?5mg/L;
[0009](3)添加壳聚糖:在发酵的第O?2天后待生物量增长到一定阶段开始进入产酶时期，加入壳聚糖溶液。壳聚糖的添加量控制在0.5g/L?2g/L。
[0010]步骤(I)所述的纤维素物料是经过热水预处理后再经粉碎的稻草。
[0011]步骤(2)所述的微量元素是按照一定比例配置成母液并经过过滤除菌的微量元素溶液，所接种的菌种为木霉属、曲霉属中的一种或两种。
[0012]步骤(3)所述壳聚糖的来源为节肢动物的外壳、低等植物或菌的细胞壁;节肢动物为蟹壳、虾壳或昆虫;低等植物为藻类。并用稀硫酸、盐酸、或者冰醋酸中的一种或几种组合溶解壳聚糖所得的一定浓度的壳聚糖溶液。
[0013]本发明具有以下优点:
[0014](I)培养基初始浓度除纤维素物料外都比较低，这样能够使得前期少量营养被菌体吸收利用以满足生长需求；
[0015](2)微量元素经过过滤除菌低温保藏，能够使得微量元素的化合价不发生改变；
[0016](3)壳聚糖添加量少，对滤纸酶活提高影响明显，能够提高50%?60%的滤纸酶活。降低了纤维素酶生产过程当中的成本。提高了生产效率。
【附图说明】
图1是不同时间添加壳聚糖FPA和蛋白含量变化曲线图；
图2是在发酵96h添加不同含量壳聚糖时FPA和蛋白含量变化曲线；
图3是添加壳聚糖类似物对FPA和蛋白含量变化的影响曲线。
【具体实施方式】
[0017]下面结合具体实施例，进一步阐释本发明。应理解，这些实施例仅用来阐述本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可对本发明做各种改动和修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0018]实施例1
[0019]以里氏木霉RUT-C30为发酵菌株
[0020](I)用PH4.5?5.5的柠檬酸缓冲液与壳聚糖混合，配置成50g//L的壳聚糖母液，置于冰箱中备用；
[0021](2)在摇瓶中，以经过预处理后再经粉碎的稻草作为唯一碳源配置培养基，其培养基组分为:玉米浆2g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸铵3g/L，尿素0.3g/L，葡萄糖0.2g/L，预处理草30g/L，MgS〇4 0.3g/L，FeS〇4.7H205.0mg/L,MnSO4.H2Ol.6mg/L,ZnSO4.7H201.4mg/L，CoCl2.6H203.7mg/L。装液量为50/250111匕121°(:灭菌20min;
[0022](3)降温至30°C后，接种已经培养好的里氏木霉RUT-C30种子液4%(v/v)于30°C，180r/min恒温培养;
[0023](4)在发酵的第48h、72h、96h、120h分别向发酵液当中添加配置好的母液1.0mL，继续摇瓶发酵，每隔24h取样一次，直到发酵结束为止；
[0024](5)分别取离心并用pH4.8的柠檬酸缓冲液稀释后的上清液0.5mL，加入ImL缓冲液，充分混匀后用来测定滤纸酶活和蛋白含量。测得酶活在96h添加壳聚糖酶活达到最高值为2.78U/mL。酶活曲线和蛋白含量如图1所示。
[0025]从图1可以看出，在不同时间添加壳聚糖对纤维素酶酶活力的提高都有着明显的作用。能够有效地促进酶的表达和分泌，在第四天添加酶活最高达到2.78U/mL，比对照提高了50.2%。
[0026]实施例2
[0027]以里氏木霉RUT-C30为发酵菌株
[0028](I)重复实施例1中的步骤(I)?(3);
[0029](2)在实施例1中的最优添加时间即第四天分别向发酵液当中添加0.5g/L、l.0g/LU.5g/L、2.0g/L的壳聚糖溶液；
[0030](3)重复实施例1中的步骤(5)，发现，当添加量为1.5g/L的时候，酶活最高达到2.75U/mL。酶活曲线和蛋白含量如图2所示。
[0031]由图2可以看出，添加不同量的壳聚糖对酶活都有促进作用，只是作用强度不同当添加量为1.5g/L的时候，酶活达到最高为2.77U/mL，比起对照组酶活提高了46.6%。
[0032]实施例3
[0033]以里氏木霉RUT-C30为发酵菌株
[0034](I)重复实施例1中的步骤(I)?(3);
[0035](2)在实施例1中的最优添加时间即第四天分别向发酵液当中添加1.5g/L的壳聚糖、2kd壳寡糖、6kd壳寡糖、羧甲基壳聚糖、几丁质五种物质；
[0036](3)重复实施例1中的步骤(5)，发现，当添加壳聚糖的时候，酶活最高达到2.75U/mL。酶活曲线和蛋白含量如图3所示。
[0037]由图3可以看出，当添加壳聚糖时，酶活要比添加其他几种物质都要高，添加其他几种物质对酶活也有促进作用，只不过促进作用不如壳聚糖明显。而添加壳聚糖酶活最高，比对照组提高了 25 %。
【主权项】
1.一种利用壳聚糖提高纤维素酶产量的方法，其特征在于:所述添加剂为壳聚糖类物质，其添加量为0.2g/L?3g/L。具体操作步骤如下: (1)培养基的配置:以各种预处理的农林纤维质物料作为碳源，以玉米浆、硫酸铵、氨水等其中的一种或几种作为氮源配置培养基。于121°C灭菌20min; (2)接种与发酵:待灭菌后等却到室温，按照2%?6%(v/v)的接种量接种种子液，并添加所需的微量元素I?5mg/L; (3)添加壳聚糖:在发酵的第O?2天后待生物量增长到一定阶段开始进入产酶时期，加入壳聚糖； (4)测定酶活:将发酵完成的发酵液离心取上清用pH4.0?5.5的柠檬酸缓冲液稀释，加入底物滤纸测定酶活并比较酶活高低。2.根据权利要求1所述一种提高纤维素酶产量的方法，其特征在于:所述纤维素酶来源于真菌和细菌，如毛霉属、木霉属、曲霉属和嗜热芽孢杆菌。3.根据权利要求1所述的预处理方法包括稀酸、稀碱、蒸汽爆破、离子液、液态热水、有机溶剂预处理的一种或几种。4.根据权利要求1所述一种提高纤维素酶产量的方法，其特征在于:所述壳聚糖来源于甲壳类动物或者昆虫外壳，并经过脱乙酰化处理，脱乙酰程度为80%?95%。5.根据权利要求4所述的壳聚糖，其特征在于:壳聚糖不仅仅局限于壳聚糖本身，还包括经过水解、加羧甲基以及未去除乙酰化等处理的不同分子量的壳寡糖、羧甲基壳聚糖、几丁质等一系列壳聚糖结构类似物及其衍生物。6.根据权利要求2所述纤维素酶，是指水解纤维素和半纤维素的一些酶类，包括内切纤维素酶、外切纤维素酶、葡萄糖苷酶、木聚糖酶、木糖苷酶及侧链水解酶类，也涉及辅助酶类，包含ΑΑ9、纤维二糖脱氢酶辅助酶这些纤维素酶的一种或它们的混合。7.根据权利要求2所述纤维素酶，涉及酸性、碱性和中性纤维素酶类。8.根据权利要求1所述，添加壳聚糖等物质，使得纤维素酶得到较大程度的提高，滤纸酶活达到4?10U/mL。
【文档编号】C12R1/885GK105838696SQ201610265921
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月26日
【发明人】孙付保, 苏存生, 张震宇, 张世敏, 王春迪
【申请人】江南大学