提高脂肪酸衍生物的产量的制作方法

专利名称：：提高脂肪酸衍生物的产量的制作方法
技术领域：
：本发明提供基因工程细胞和^f敛生物以及它们的使用方法，所述微生物产生来自脂肪酸生物合成途径的产物(即脂肪酸衍生物)。这类产物特别适合作为生物燃料。相关申请的交叉引用本申请要求享有2007年3月28日提交的美国临时申请序列号60/908,547、2007年11月21日提交的美国临时申请序列号60/989,798以及2007年5月18号提交的PCT申请PCT/US2007/011923的优先权，将这些申"i青均通过引用全文并入本文。
背景技术：
：随着技术的发展，与之相伴的是对燃料来源的依赖性的增加。这类燃料来源正变得日益有限和难以获得。随着化石燃料以空前的速度被烧掉，世界上的燃料需求可能不久以后就将超过目前的燃料供给。因此，现在致力于利用可再生能源，诸如日光、水、风和生物质(biomass)。利用生物质产生非石油来源的新的燃料资源(即生物燃料)已成为一种可供选择的方案。生物燃料是一种由烷烃和酯类构成的可生物降解的、清洁燃烧的燃料。生物柴油即是一种示例性的生物燃料。生物柴油可以采用纯的形式(被称为"纯，，生物柴油)，或者以任何浓度与常规的石化柴油混合用于大部分内燃柴油发动机中。与基于石油的柴油相比，生物柴油提供了包括燃烧过程中排放量(例如，一氧化碳、硫、芳香烃、烟灰颗粒)下降在内的许多有趣和有吸引力的有益特点。因其基于可再生的生物材料，生物柴油还能维持平衡的二氧化碳循环。生物柴油无毒、可完全生物降解，而且因为燃点高，易燃性低因此非常安全。此外，生物柴油提供良好的润滑性能，24/人而减少发动才几的磨损。目前生产生物柴油的方法涉及将来自植物油原料的三酰甘油进行酯交换，植物油原料，比如在欧洲是油菜，在北美是大豆，在东南亚是棕榈油。因此工业规模的生物柴油生产在地理和季节上局限于植物油原料的产地。酯交换过程产生脂肪酯(fattyesters)混合物，其可以作为生物柴油。酯交换过程中的一种不希望的副产品是甘油。要作为生物柴油使用，必须从上述异质产物中进一步纯化脂肪酯。这最终会增加生物柴油的产量，但增加了脂肪酯生产的成本和所需能量。而且，植物油原料不是高效的能量来源，因为它们需要广大的种植面积。例如，因为只有菜子油产生用于生物柴油，油菜生物质的其他部分不被使用，从油菜产生生物柴油的产量仅有1300L/公项。此外，某些植物油原料，比如油菜和大豆的种纟直需要经常进行农作物轮种以防止土地养分耗尽。因此，需要在经济和能量方面高效的生物燃料，以及由可再生能量来源比如生物质生产所述生物柴油的方法。发明概述本发明涉及从重组细胞中产生脂肪酸衍生物。通常，通过表达或超表达编码脂肪酸衍生物酶的至少一个基因来产生脂肪酸衍生物。此外，可以对重组细胞中编码酰基辅酶A(CoA)脱氬酶的基因进行修饰，从而使该基因的表达弱化。本发明的一个方面提供了重组细胞，所述重组细胞包含至少下述之一(a)至少一个编码脂肪酸衍生物酶的基因，修饰该基因，从而使其超表达；和(b)编码酰基辅酶A脱氬酶的基因，修饰该基因，从而使其表达弱化。所述修饰的编码脂肪酸衍生物酶的基因可以是编码酰基辅酶A合酶、好u酯酶、酯合酶、醇酰基转移酶、醇脱氬酶、酰基辅酶A还原酶或脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶的基因。在一个实施方案中，修饰的基因编码酰基辅酶A合酶、-琉酯酶和酯合酶。在某些实施方案中，酰基辅酶A合酶和硫酯酶以及/或者酯合酶是修饰的。在某些实施方案中，细胞还包含编码转运蛋白的基因。本发明的重组或宿主细胞可以是S良酒酵母(Sflcc/^ramyc&scwevWae)、解脂假丝酵母(C朋fiWa/*o/_y"ca)、大肠杆菌(五.co//)、节杆菌(J^r/2ra6"c妙)、粘红酵母(iAodotora/(2g7w〃m."力、不动杆菌(v4cz7^由c—、解月旨假丝酵母、布朗葡萄藻(5o,，coc價6聽m》、弗尼斯氏弧菌(H力n.o/wrmh")、藤黄微球菌(M/cracocciw/wtew力、嗜麦芽窄食单胞菌OS^wofrapAowowwma/Zo//7/a)或者枯草芽孢杆菌(5acz7/wwZj"/z';y)细月包，例如节杆菌AK19、不动杆菌G4c/"e/oZ^"wsp.)菌才朱M-1、大肠杆菌B、大肠杆菌C、大肠杆菌K或者大肠杆菌W细胞。在其他实施方案中，重组细胞是蓝细菌(Cy朋oZj""er/力细胞，例如集胞蓝菌(5^wec/oqyW^sp.)PCC6803或细长聚3求菌0S^zec/jococcwe/o"gWi)PCC7942细胞。还有一些实施方案中，重组细胞是植物、动物或人细胞。可选地，重组细胞是来自细菌、酵母或丝状真菌的孩吏生物细月包。本发明第二方面提供了能产生脂肪酸衍生物的重组细胞，其中所述细胞经修饰从而包括至少一个编码脂肪酸衍生物酶的外源核酸序列。所述外源核酸序列可以编码酰基辅酶A合酶、石危酯酶、酯合酶、醇酰基转移酶、醇脱氢酶、酰基辅酶A还原酶或脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶。在某些实施方案中，细胞经修饰从而包括至少两个编码脂肪酸书f生物酶的外源核酸序列，例如第一外源核酸序列编码酰基辅酶A合酶，第二外源核酸序列编码硫酯酶或酯合酶。在其他实施方案中，编码脂肪酸衍生物酶的基因经修饰从而优化用于在重组细胞内表达的密码子。在一个实施方案中，重组细胞包含修饰的编码酰基辅酶A合酶的基因，如/adi)、/adi:、5Z^/0丄_y//I、尸/7-WW、￡^W50W、/adZ)/、/aJi)2、iPC/074、/adZXD35、/adDD"、/adp，或编码蛋白质ZP一01644857的基因。酰基辅酶A合酶基因的实例有来自结核分枝杆菌(M/^wc"/ow、)HR7Rv的fadDD35[NP—217021]、来自枯草芽孢杆菌的yhfL[NP—388908]、来自铜绿々支单胞菌(尸.aen^'"o^/)PA01的fadDl[NP_251989]、来自嗜麦芽窄食单胞菌R551-3的编码蛋白质ZP—01644857的基因或者来自酿酒酵母的/aa^[NP—012257]。在第二个实施方案中，重组细胞包含修饰的编码硫酯酶的基因，如/e"、'&"、ZesB、、/a,52、、/"M"/7、/a"或/a"/。在第三个实施方案中，重组细胞包含修饰的编码酯合酶的基因，如获得自不动杆菌(fwe励ac/erspp.)、博克岛食烷菌(袭聽'voraxZo^:wmeww^)、才以南芥(y4ra6zV/o/wiZ力a"awa)、酉良酒酵母、智人(77omo■sa/^eAw)、西蒙^寻木(57m附ow^sz.(3cAz.weww's)、高山#皮孑包審(A/oW/ere〃aa/p/we)、弯曲隐球菌(Oy/7/ococcMScwrrato)、J/cam.vomx:ya^W7'51、博克岛食烷菌、不动杆菌(v4c/"^o^c/ersp.)HOl-N或混浊红球菌(i/zo^cocciwo;aci^)的酯合酶基因。酯合酶基因的实例包括wflx/Wga"即来自西蒙得木、不动杆菌菌抹ADP1、博克岛食烷菌、铜绿假单胞菌、Fww础a"e/v'ade"^、拟南芥或真养产械軒菌(^4仪"/—"^ew加j!7/ms)的双功能酯合酶/酰基辅酶A:二酰甘油酰基转移酶。在一个实施方案中，本发明的重组细胞还包含；^A、；咖i:、aceEF、/a6"、/aW)、/aK、ac/7P和/a6F基因中的至少一个，基因经过修饰以便表达或超表达。在第二个实施方案中，重组细胞还包含fadE、gpsA、ldhA、pflB、adhE、pta、poxB、ackA和ackB基因中的至少一个，基因经修饰，其表达弱化。在第三个实施方案中，重组细胞还包含plsB和sfa的至少一个〗务饰的基因。在其他实施方案中，编码酰基辅酶A脱氢酶的基因缺失。本发明的重组细胞相对非重组细胞，例如否则相同的非重组细胞或者种系和表型类似的细胞，产生更多的酰基辅酶A。本发明还提供了本文公开的重组细胞所产生的组合物。包含由重组细胞产生的脂肪酸衍生物的组合物包含少于或者等于约50ppm的砷，约30ppm、约25ppm,或者在约10-50ppm的砷；少于或等于约200ppm的钙、约150ppm的钩、约119ppm的4丐或者约50-200ppm的钙；少于或等于约200ppm的氯、约150ppm的氯、约119ppm的氯或者在约50-200ppm的氯；少于或等于约50ppm的铜、约30ppm的铜、约23ppm或者约10-50ppm的铜；少于或等于约300ppm的铁、约200ppm的铁、约136ppm的铁或者约50-250ppm的铁；少于或等于约50ppm的铅、约25ppm的铅或者约10-50ppm的铅；少于或等于约50ppm的锰、约30ppm的锰、约23ppm的锰或者约10-50ppm的锰；少于或等于约50卯m的镁、约30ppm镁、约23ppm的镁或者约10-50ppm的镁；少于或等于约0.5ppm的汞、约O.lppm的汞、约0.06ppm的汞或者约0.01-0.2ppm的汞；少于或等于约50ppm的钼、约30ppm的钼、约Mppm的钼或者约10-50ppm的钼；少于或等于约2%的氮；约1%的氮、约0.5%的氮或者约0.1-1%的氮；少于或等于约200ppm的钾、约150ppm的钾、约103卯m或者约50-200卯m的钾；少于或等于约300ppm的钠、约200ppm的钠、约140ppm的钠或者约50-300ppm的钠；少于或等于约1ppm的碌"少于或等于约1%的>5克，约0.14%的硫或者约0.05-0.3%的硫；少于或等于约50ppm的锌、约30ppm的锌、约23ppm的锌或者约10-50ppm的锌；或者少于或等于约700ppm的磷、约500ppm的磷、约350ppm的磷或者约100:00ppm的磷。在一个方面，由本发明的重组细胞产生的组合物所包含的脂肪酸，在碳链中从所述脂肪酸书f生物还原末端的7位(在C;和Cs之间)有双键。在某些实施方案中，组合物包含Cs-C25脂肪酯，或d。-C2。脂肪酯，或者C!2-C!8脂肪酯。在其他实施方案中，所述脂肪酸衍生物包含直链脂肪酸书f生物、支链脂肪酸衍生物和环状部分。仍然在一些实施方案中，脂肪酸衍生物是不饱和(例如单不饱和)或饱和的。在其他方面，组合物包含由醇和酰基辅酶A产生的脂肪酯，其中所述醇的长度为至少约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约10个、约12个、约14个、约16个或约18个碳；酰基辅酶A的长度为至少约2个、约4个、约6个、约8个、约10个、约12个、约14个、约16个、约18个、约20个、约22个、约24个或约26个碳。在某些实施方案中，产生脂肪酯的醇和酰基辅酶A差别约2个、约4个、约6个、约8个、约10个、约12个或约14个碳原子。在一个实施方案中，由本发明的重组细胞产生的组合物其现代>5友分婆史(fractionofmoderncarbon)为约1.003到约1.5。本发明的其他方面提供了在重组细胞中产生脂肪酸衍生物的方法，所述方法包括a)获得重组细胞；b)培养重组细胞，以及c)产生脂肪酸衍生物。本发明的其他方面提供了提高重组细胞中脂肪酸衍生物产量的方法，所述方法包括将编码脂肪酸书f生物酶的外源核酸导入重组细胞，表达所述外源核酸，其中该核酸在重组细胞内的表达使脂肪酸衍生物的产量相对非重组细胞得以提高，所述非重组细胞如，否则相同的非重组细胞或具有类似谱系和表现型的细胞。在某些实施方案中，所述外源核酸编码酰基辅酶A合酶、石克酯酶或酯合酶。在其他实施方案中，将编码酰基辅酶A合酶、辟b酯酶和酯合酶的外源核酸导入重组细胞。在其他实施方案中，提供了在重组细胞中提高脂肪酸衍生物产生水平的方法，所述方法包括将核酸构建体导入宿主细胞，所述核酸构建体包含a)编码核酸衍生物酶的核酸序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:6、SEQIDNO:9或SEQIDNO:13,和b)用于所述核酸序列表达的调节序列；表达所述核酸序列；以及获得脂肪酸衍生物。本发明仍然在其方面提供了包含编码脂肪酸衍生物酶的核酸序列的重组构建体，其中所述核酸序列经修饰超表达所述编码脂肪酸衍生物酶的基因。在一个实施方案中，核酸序列经修饰超表达编码酰基辅酶A合酶、硫酯酶或酯合酶的基因。在第二个实施方案中，核酸序列经修饰超表达(l)编码酰基辅酶A的基因，和(2)编码硫酯酶或酯合酶的基因。在第三个实施方案中，核酸序列经修饰超表达编码(l)酰基辅酶A、(2)硫酯酶和(3)酯合酶的基因。在第四个实施方案中，构建体还包含编码酰基辅酶A脱氢酶的核酸序列，该核酸序列经^修饰使酰基辅酶A脱氢酶的表达弱化。本发明还提供了包含这些重组构建体的载体。在某些实施方案中，所述载体还包含结构基因以便对转化的细胞进行选择。本发明另一方面提供了提高宿主细胞中脂肪酸衍生物产量的方法，所述方法包含用核苷酸序列转化宿主细胞，从而宿主细胞表达或超表达脂肪酸衍生物酶基因，其中宿主细胞内的脂肪酸衍生物产量相对未经转化的细胞得以提高。在这样的方法中，可以收获宿主细胞并裂解以获得所产生的脂肪酸衍生物。可选地，用编码转运蛋白的核苷酸序列转化宿主细胞，宿主细胞将脂肪酸衍生物释放到胞外。29本发明的再一方面提供了包含编码脂肪酸衍生物酶的核酸序列的载体，其中所述核酸序列可操纵地连接于能在宿主细胞中发挥作用的启动子，该核酸序列包含编码酰基辅酶A合酶的第一核酸序列和编码硫酯酶或酯合酶的第二核酸序列。所述载体还可以包含编码转运蛋白的核酸序列。在一个实施方案中，第二核酸序列编码硫酯酶，且载体还包含编码酯合酶的第三核酸序列。在第二个实施方案中，载体还包含编码转运蛋白的核酸序列。本发明还有一方面提供了产生脂肪酸衍生物的方法，包括(a)提供包含本发明的载体的宿主细胞；和(b)培养宿主细胞以产生脂肪酸衍生物。在某些实施方案中，由宿主细胞培养物收集上清液从而获得已产生的脂肪酸衍生物。本发明也提供了通过此类方法产生的脂肪酸衍生物。一方面，根据本发明产生的脂肪酸衍生物可以用作生物燃料组合物。所述脂肪酸衍生物可以用作生物柴油、脂肪醇、脂肪酯、三酰甘油、汽油或喷气燃料(jetfuel)。另一方面，本发明的重组细胞所产生的组合物包含脂肪酯或游离脂肪酸。例如，在一个实施方案中，游离脂肪酸的重量百分比是至少约1%、约2%、约3%、约4%、约5%、约6%、约7°/。、约8%、约9%、约10%、约15%、约20%或者约25%。在另一个实施方案中，所产生的脂肪酯的重量百分比是至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%或约90%。在另一个实施方案中，脂肪酯与游离脂肪酸的比率是约10:1、约9:1、约8:1、约7:1、约5:1、约2:1或约1:1。在一个实施方案中，根据本发明所产生的组合物包括脂肪酯，其中所述脂肪酯是十二酸乙酯、十三酸乙酯、十四酸乙酯、十五酸乙酯、顺式-9-十六烯酸乙酯、十六酸乙酯、十七酸乙酯、顺式-ll-十八烯酸乙酯、十八酸乙酯或者其组合中的至少一种。在第二个实施方案中，根据本发明所产生的组合物包括游离脂肪酸，其中所述游离脂肪酸是十二酸、十四酸、十五酸、顺式-9-十六烯酸、十六酸、顺式-ll-十八烯酸或者其的组合中的至少一种。这些实施方案的组合物还可以用作生物燃料，例如，作为生物柴油、脂肪醇、脂肪酯、三酰甘油、汽油或喷气燃料。在某些实施方案中，本文公开的组合物含有的d2游离脂肪酸相对全部游离脂肪酸的重量百分比是至少约5%、10%或15%。在其他实施方案中，本文公开的组合物含有的c14游离脂肪酸相对全部游离脂肪酸的重量百分比是至少约20%、30%或40%。在其他实施方案中，本文公开的组合物含有的C15游离脂肪酸相对全部游离脂肪酸的重量百分比是至少约1%或2%。在其他实施方案中，本文/>开的组合物含有的(:16游离脂肪酸相对全部游离脂肪酸的重量百分比是至少约20%、30%或40%。在其他实施方案中，本文公开的组合物含有的ds游离脂肪酸相对全部游离脂肪酸的重量百分比是至少约15%、20%或25%。在某些实施方案中，本文公开的组合物含有的d2脂肪酯相对全部脂肪酯的重量百分比是至少约1%、2%或3%。在其他实施方案中，本文公开的组合物含有的C14脂肪酯相对全部脂肪酯的重量百分比是至少约10%、15%或20%。在其他实施方案中，本文^S开的组合物含有的C^脂肪酯相对全部脂肪酯的重量百分比是至少约30%、40%或50%。在其他实施方案中，本文公开的组合物含有的ds脂肪酯相对全部脂肪酯的重量百分比是至少约20%、30%或40%。附图简述图1是鉴定可以超表达或弱化从而使脂肪酸衍生物产量增加的各种基因的表格。这个表格还鉴定了可以经调节从而改变脂肪酸衍生物产物结构的各种基因。这些基因中的某些用于改变脂肪酸衍生物结构的基因，也能增加脂肪酸衍生物的产生。图2是说明FAS生物合成途径的图示。图3是说明p氧化途径的图示，包括由以下酶催化的步骤(1)酰基辅酶A合酶(EC6.2.1-);(2)酰基辅酶A脱氬酶(EC1.3.99.3);(3)烯酰-辅酶A水合酶(EC4.2.1.17);(4)3-羟丁酰辅酶A差向异构酶(EC5丄2.3);和(5)3-酮脂酰-辅酶A硫解酶(EC2.3.1.16)。这个(3氧化途径的最后反应释放乙酰辅酶A和短了两个碳的酰基辅酶A脂肪酸，准31备好再进行P氧化反应。图4的示意图显示根据所提供的底物产生脂肪酯的生物合成途径。图5的示意图显示产生脂肪醇的生物合成途径。图6的示意图显示产生脂肪酯的生物合成途径。图7描述了实施例5描述的菌林的脂肪醇产生，所述菌林共转化有pCDFDuet-l-fadD-acrl和含有各种硫酯酶基因的质粒。鉴定了饱和的C1()、C12、C14、C!6和ds脂肪醇。困8描述了脂肪醇从生产菌林(productionstrain)的释放。当菌抹培养在37^,约50%所产生的脂肪醇从细胞中释放。图9A-D描述了表达醇乙酰转移酶(AATs,EC2.3.1.84)的生产宿主(productionhost)和表达酯合酶(EC2.3.1.20、2.3.1.75)的生产宿主产生的辛酸辛酯(CsC8)的GS-MS谱。图9A显示菌抹C41(DE3，A/afi五/pHZ1.43)/pRSETB+pAS004.114B)的乙酰乙酯提取物的GC-MS镨，其中pHZ1.43质粒表达ADP1酯合酶(EC2.3.1.20、EC2.3.1.75)。图9B显示菌抹C41(DE3，A/W￡/pHZ1.43)/pRSETB+pAS004.114B)的乙酰乙酸酯提取物的GC-MS谱，其中pHZI.43质粒表达SAAT。图9C显示菌抹C41(DE3，A/^/五/pHZ1.43)/pRSETB+pAS004.114B)的乙酰乙酯提取物的GC-MS谱，其中pHZ1.43质粒不含有ADP1(酯合酶)或者SAAT。图9D显示C41(DE3，z//"6ffi/pHZ1.43)/pRSETB+pAS004.114B)所产生的QC8的质谱和裂解模式(fragmentationpattern),其中pHZ1.43质粒表达SAAT。图10显示当来自不动杆菌ADPl(WSadpl)的酯合酶与来自萼距花(Cw;A^AooA^/a"a)的硫酯酶基因在生产宿主中共表达时，产生的乙酯的分布。图11描述了各种酯合酶在25。C产生的乙酯。所述乙酯由携带各种酯合酶的重组大肠杆菌菌林产生。重组菌抹是1.C41(DE3，4/^fi^4/^^)/pETDuet-l-/wA+pCDFDuet-l-fadD以及lpHZ1.43;2.pHZ1,97—377;3.pHZ1.97—atfA2;4.pHZ1.97—376;5.pHZl.97一atfAl;6.没有质粒(对照)。图12描述了各种大肠杆菌菌抹产生的脂肪酸乙酯(FAEE)的酰基组成。所述重组菌4朱是1.C41(DE3，4^^E4/^i)/pETDuet-l-^sA+pCDFDuet-l-fadD以及lpHZ1.43;2.pHZ1，97—377;3.pHZ1.97—atfA2;4.pHZ1.97—376;5.pHZ1.97一atfAl;6.没有质粒(对照)。图13描述了各种酯合酶在37。C制备的乙酯。乙酯是由携带各种酯合酶基因的重组大肠杆菌菌抹产生的。所述重组菌抹是1.C41(DE3，4/^^4A^i)/pETDuet-l-^A+pCDFDuet-l隱fadD以及lpHZ1.43;2.pHZl,97—377;3.pHZ1.97—atfA2;4.pHZl.97—376;5.pHZ1.97—atfAl;6.没有质粒(对照)。图14显示了转化体C41(DE3，4/^/￡4/^")/pETDuet-1國&sA+pCDFDuet-1-fadD+pHZ1.97—atfA2t的三个单菌落产生的游离脂肪酸(FFA)和脂肪酸乙酯(FAEE)的浓度。FFA被转化为脂肪酸乙酯(FAEE),经GC/MS定量。图15的示意图显示了FabA和FabB的对照区。FadR和FabR共有结合部位用粗体显示。垂直箭头指示可以进行突变从而改变/a^4表达的位点。括弧指出了每个位点建议的碱基。构成典型大肠杆菌启动子-35和-10区的两个区域如括弧所示。还显示了使启动子与共有启动子序列更接近的建议突变。图16A和16B是GC/MS分析的色谱。图16A描述转化了质粒pCDFDuet-l画fadD-WSadpl、pETDuet-l-，tesA的大肠杆菌菌4朱LS9001培养物的乙基4是取物色谱。图16B显示用作参照的棕榈酸乙酯和油酸乙酯的色谱。图17是质粒pOP-80的图谱。图18是SEQIDNO:l，pOP-80质粒的的全长DNA序列。图19是SEQIDNO:2，大肠杆菌密码子优化的y^/Z)"基因(登录号NP—217021)的DNA序列。图20是SEQIDNO:3，大肠杆菌密码子优化的/^/ZX基因(登录号NP—251989)的DNA序列。图21是SEQIDNO:4，基于保存在NCBI的登录号为NC一000964的DNA序列的BsyhfLBspHIF引物。图22是SEQIDNO:5，基于保存在NCBI的登录号为NC—000964的DNA序列的BsyhfLEcoR引物。图23是SEQIDNO:6，来自枯草芽孢杆菌的基因的DNA序列。图24是SEQIDNO:7，基于保存在NCBI的登录号为NC—001141的DNA序列的Scfaa3pPciF引物。图25是SEQIDNO:8，基于保存在NCBI的登录号为NC—001141的DNA序列的Scfaa3pPcil引物。图26是SEQIDNO:9，来自酿酒酵母FAA3基因的DNA序列(NP—012257)。图27是SEQIDNO:10,基于保存在NCBI的登录号为NZ—AAVZ01000044的DNA序列的Smprk59BspF引物。图28是SEQIDNO:ll,基于保存在NCBI的登录号为NZ—AAVZ01000044的DNA序列的Smprk59HindR引物。图29是SEQIDNO:12,PrkBsp引物。图30是SEQIDNO:13，编码来自嗜麦芽窄食单胞菌R551-3的ZP—01644857蛋白质序列的DNA序列。图31是SEQIDNO:14，来自嗜麦芽窄食单胞菌ATCC17679的ZP—01644857的蛋白质序列。缩写和术i吾提供下列关于术语和方法的解释是为了更好的描述本发明，并指导本领域普通技术人员实施本发明。本文使用的单数形式"一种(a或an)"或者"这种(the)"包括复数含义，除非上下文明确的另外指出。例如，提及"一种细胞"或"这种细胞"包括一个或多数个这类细胞。措辞"或除非上下文明确的另外指出。例如短语"硫酯酶活性或者脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶活性"是指硫酯酶活性、脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶活性或者脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶活性和硫酯酶活性两者的组合。此外，贯穿本说明书，可以以基因或酶的缩写名称来提及基因或酶，但应当理解为这种缩写的基因或酶名称代表一类基因或酶。例如，"/a《W是指编码酶"FadD"的基因，以及编码酰基辅酶A合酶(EC6.2.1,)的基因。这种基因名称包括所有编码相同肽和具有相同生理功能的同源酶的基因。这种酶名称包括所有催化相同基本化学反应或者有相同活性的肽。图1提供了各种缩写的基因和肽名称、对其活性的描述、以及它们的酶学分类号。这些可用于鉴定具有相关活性的该类酶的其他成员及其相关基因，以用于产生脂肪酸衍生物。除非另外解释，所有本文使用的技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常的理解具有相同的含义。尽管与本文描述的类似或者等同的方法和材料可用于本发明的实施或者试验，但下文描述了适合的方法和材料。所述材料、方法和实例只是说明性的，而不是用于限制。根据下面的发明详述和权利要求，本发明的其他特征是明显的。登录号贯穿本说明书的登录号来源于美国国立卫生研究院维护的NCBI数据库(国立生物技术信息中心)。所述登录号如该数据库在2007年3月27日提供的。酶学分类号(EC):EC编号由国际生物化学与分子生物学联合会命名委员会(NC-IUBMB，http:〃www.chem.qmu1.ac.uk/iubmb/enzyme)建立。本文提供的EC编号来自京都基因与基因组百科全书(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomics)维护的KEGGLigand数据库，该数据库由东京大学部分资助。所述EC编号是2007年3月27日由该数据库提供的。弱化减弱、减少或消除。在一个实例中，降低特定的酶对不是馈)的;灵敏度:从而使得所述酶活性不受化:物存在的影响。在另一个实例中，/flW/基因的表达是温度敏感的，可以改变其序列从而降低对温度波动的敏感性。当需要支链氨基酸时，可以将/aW/基因的表达弱化。在另一个实例中，经过修饰活性更低的酶可以称作弱化的。可以利用对编码酶的序列进行功能性修饰来弱化该酶的表达。序列修饰可以包括例如将基因序列或控制该基因序列的转录或翻译的序35列突变、缺失或插入一或多个核苷酸，所述修饰减少或者抑制基因产物的产生，或者导致基因产物没有功能。例如，大肠杆菌中/flW的功能性缺失減轻了脂肪酸生物合成途径的抑制，允许大肠杆菌产生更多的不饱和脂肪酸(UFAs)。在某些情况下，功能性缺失被描述成敲除突变还有其他方法可以弱化酶的表达。例如，弱化可以通过以下技术实现:修饰编码如上所述基因的序列；将基因置于活性较低的启动子的控制下；表达针对目的基因的干扰RNA、核酶或反义序列；通过改变物理或化学环境，比如温度、pH或溶液浓度，从而使得基因或基因产物不能达到最佳活性；或者通过本领域已知的任何其他技术。。生物燃料术语"生物燃料"是指来源于生物质的任何燃料。生物质是可以转化为生物燃料的生物材料。生物质的一个示例性来源是植物材料。例如，玉米、甘蔗和柳枝稷可以作为生物质。生物质的另一个非限制性实例是动物材料，例如牛粪。生物质还包括工业、农业、林业和家庭废料。这类可以作为生物质的废料的实例是发酵废料、稻草、木材、污水、垃圾和剩饭。生物质还包括碳源，比如碳水化合物(例如糖)。生物燃料可以取代基于石油的燃料。例如，生物燃料包括在运输燃料(例如汽油、柴油、喷气燃料等)、加热燃料以及发电燃料之内。生物燃料是一种可再生能源。生物燃料的非限制性实例是来源于生物质的生物柴油、烃(例如烷烃、烯烃、炔或芳香烃)、以及醇。生物柴油生物柴油是一种生物燃料。生物柴油可以作为来源于石油的柴油的替代品。生物柴油可以采用纯的形式(被称为"纯"生物柴油)，或者以任何浓度与常规的石化柴油混合用于内燃柴油发动机中。生物柴油可以由烃或酯类构成。在一个实施方案中，生物柴油由脂肪酯，比如脂肪酸曱酯(FAME)或脂肪酸乙酯(FAEE)构成。在优选的实施方案中，构成这些FAME和FAEE的脂酰部分的碳链长度为约8-20、10-18或者12-16个^_。用作生物柴油的脂肪酯可能含有饱和或不饱和的碳链。生物原油(biocrude):生物原油是一种生物燃冲+。生物原油可以作为来源于石油的燃料的替代品。此外，生物原油和石油原油一样，均可以转化为其他燃料，例如汽油、柴油、喷气燃料或燃料油(heatingoil)。而且，生物原油与石油原油一样，可以转化为其他工业上有用的化学品，用于例如制药、化妆品、消费品、工业加工等。生物原油可以包括例如烃、烃产品、脂肪酯以及/或者脂肪族酮。在优选的实施方案中，生物原油由烃，例如脂肪(例如，烷烃、烯烃、炔)或芳香烃构成。碳源通常指适合作为原核或者简单真核细胞生长的碳源的底物或者化合物。碳源可以是各种形式，包括但不限于多聚体、碳水化合物、酸、醇、醛、酮、氨基酸、肽、气体(例如CO和C02)等。这些包括，例如，各种单糖，如葡萄糖、果糖、甘露糖和半乳糖；寡糖，如果糖-寡糖和半乳糖-寡糖；多糖，如木糖和阿拉伯糖；二糖，如蔗糖、麦芽糖和松二糖；纤维素物质，如甲基纤维素和羧曱基钠纤维素；饱和或者不饱和的脂肪酸酯，如琥珀酸酯、乳酸酯和乙酸酯；醇，如乙醇等，或者它们的混合物。此外，碳源还可以是光合作用产物，包括但不限于葡萄糖。流体浊点在该温度，溶解的固体不再完全可溶，聚集为第二相，使流体看上去浑浊。这个术语与结果不同的几种应用有关。在石油工业中，浊点指的的是这样的温度，在该温度下，蜡或其他重烃在原油、提炼油或燃料中结晶，形成浑浊的外观。固化蜡的存在会影响流体的流动性能、堵塞滤清器/喷射器等的倾向、蜡在凉的表面上的沉积(例如管道或热交换器污垢)，甚至与水的乳化特性。浊点是在冷的操作温度时，油堵塞滤清器或小孔的趋势的指标。非离子表面活性剂或乙二醇溶液的浊点是混合物开始分相并出现两个相，因此变得浑浊的温度。这一性态是含有聚环氧乙烷链的非离子表面活性剂的特性，聚环氧乙烷链在水中表现出相对温度性态的反向溶解，因此随着温度提高在某个点会"变浊(cloudout)"。表现这一性态的乙二醇被称为"浊点乙二醇"，并用作页岩抑制剂。盐度会影响浊点，在盐分越高的流体中浊点通常越低。降^f氐浊点的添加剂可以加入组合物使如上所述的溶液的浊点降37低或下降的添加剂。可检测的其存在(existence或presence)能够得以确定的。例如，利用以下提供的方法，来自反应物的产物的产生(例如ds脂肪酸的产生)是可检测的。内源的用于本文提及核酸分子和特定的细胞或者孩史生物时，"内源的"是指位于细胞内的且不是利用重组工程技术导入细胞的核酸序列或者肽。例如，当细胞最初从自然界分离时，已经存在于所述细胞中的基因。即使调控序列，诸如能够激活转录或者翻译的启动子或者增强子序列已经通过重组技术被改变，基因仍被认为是内源的。酯合酶酯合酶是能够产生脂肪酯的肽。更具体地说，酯合酶是能够将硫酯转化为脂肪酯的肽。在优选的实施方案中，酯合酶将硫酯、酰基辅酶A转化为脂肪酯。在可选的实施方案中，酯合酶利用硫酯和醇作为底物产生脂肪酯。酯合酶能够利用短链和长链酰基辅酶A作为底物。此外，酯合酶能够利用短链和长链醇作为底物。酯合酶的非限制性实例是蜡合酶、蜡-酯合酶、酰基辅酶A:醇转酰基酶、酰基转移酶和脂酰辅酶A:脂肪醇酰基转移酶。示例性的酯合酶分类到酶分类号EC2.3.1.75中。图l提供了示例性的GenBank登录号。外源的用于本文提及核酸分子和特定的细胞时，"外源的"是指不是来源于自然界发现的特定细胞的任意核酸分子。例如，"外源DNA"可以指插入樣i生物基因组DNA序列的DNA序列，或者导入孩l生物的染色体外核酸序列。因此，一旦非天然存在的核酸分子被导入细胞，则其净皮认为是外源的。对特定细胞来说，天然存在的核酸分子也可以是外源的。例如，一旦从大肠杆菌DH5ct细胞分离的完整编码序列被导入第二个大肠杆菌DH5ot细胞，则该编码序列对于第二个细胞来说是外源核酸，即使它们都是DH5a细胞。表达基因中的可遗传信息，诸如DNA序列被转变为功能性基因产物，诸如蛋白或RNA的过程。基因表达过程中的多个步骤可以被调节，包括转录步骤、翻译步骤以及所产生的蛋白质的翻译后修饰。基因调控使细胞能够控制其结构和功能，是任何生物细胞分化、形态发生和多样性以及适应性的基础。基因调控还可以作为进化改变的基础，因为对基因表达的时机、位置和量的控制对生物中基因的功能(作用)有深远的影响。表达的基因包括被转录为信使RNA(mRNA)然后被翻译为蛋白质的基因，以及被转录为RNA类型的基因，所述RNA类型如不被翻译为蛋白质的转移RNA(tRNA)、核醣体RNA(rRNA)和调节RNA)。脂肪酯脂肪酯属于酯类。在优选实施方案中，脂肪酯是任何由脂肪酸制备的酯，例如脂肪酸酯。在一个实施方案中，脂肪酯含有A側(即连接在羧酸氧上的碳链)和B侧(即包含亲本羧酸酯的碳链)。在优选实施方案中，当脂肪酯来源于脂肪酸生物合成途径时，A侧来自醇，B侧来自脂肪酸。任何醇都可以用于形成脂肪酯的A侧。例如，醇可以来源于脂肪酸生物合成途径。可选地，可以通过非脂肪酸生物合成途径来产生醇。而且，醇可以是外源提供的。例如在脂肪酯是由生物产生的情况下，醇可以在发酵液中提供。可选地，在脂肪酯是由同时能产生醇的生物产生的情况下，可以提供外源的羧酸，诸如脂肪酸或乙酸u包含A侧或B侧的碳链可以是任意长度。在一个实施方案中，酯的A侧在长度上为至少约1、2、3、4、5、6、7、8、10、12。、14、16或18个碳。酯的B侧在长度上为至少约4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26个碳。A侧和/或B侧可以是直链或支t连。支链可以有一或多个分支点。此外，支链可以包括环形分支。再者，A侧和/或B侧可以是々包和或不々包和的。如果是不々包和的，A侧和/或B侧可以有一或多个不々包和位点。在一个实施方案中，脂肪酯是通过生物合成制备的。在这个实施方案中，首先脂肪酸被"激活"。"激活的"脂肪酸的非限制性实例是酰基辅酶A、酰基-ACP和酰基磷酸酯。酰基辅酶A可以是脂肪酸生物合成或降解的直接产物。此外，可以由游离脂肪酸、辅酶A和腺香核苷酸三磷酸(ATP)合成酰基辅酶A。产生酰基辅酶A的酶的实例是酰基辅酶A合酶。脂肪酸;波激活后，可以容易地转移到受体亲核分子上。示例性的200880009283.9说明书第17/96页亲核分子是醇、巯醇或磷酸酯。在另一个实施方案中，所述脂肪酯可以来源于脂酰基硫酯和醇。在一个实施方案中，所述脂肪酯是蜡。蜡可以来源于长链醇和长链脂肪酸。另一个实施方案中，脂肪酯是脂肪酸硫酯，例如脂酰辅酶A。在其他实施方案中，所述脂肪酸酯是脂肪酰基泛酸酯、酰基载体蛋白(ACP)或者脂肪磷酸酯。脂肪酯有很多用途。例如，脂肪酯可以用作生物燃料或表面活性剂。脂肪酸衍生物术语"脂肪酸衍生物"包括部分由生产宿主生物的脂肪酸生物合成途径产生的产物。"脂肪酸衍生物"还包括部分由酰基-ACP或酰基-ACP衍生物产生的产物。脂肪酸生物合成途径包括脂肪酸合酶，其可以按照本文的描述进行工程改造产生脂肪酸衍生物，以及在一些实例中其可以与其他酶一起表达，产生具有所需碳链特性的脂肪酸衍生物。示例性的脂肪酸衍生物包括例如短链和长链醇、烃以及脂肪醇和酯，包括蜡、脂肪酸酯或脂肪酯。脂肪酸衍生物酶(fattyacidderivativeenzymes):在脂肪酸衍生物产生过程中表达或超表达的所有酶在文中均统称为脂肪酸衍生物酶。这些酶可以是脂肪酸生物合成途径的一部分。脂肪酸衍生物合酶的非限制性实例包括脂肪酸合酶、硫酯酶、酰基辅酶A合酶、酰基辅酶A还原酶、醇脱氢酶、醇乙酰转移酶、脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶以及酯合酶。脂肪酸衍生物酶将底物转化为脂肪酸衍生物。在某些实例中，底物可以是脂肪酸衍生物，脂肪酸衍生物酶将其转化为不同的脂肪酸AT生物。脂肪醇形成肽能够催化酰基辅酶A转化为脂肪醇的肽，包括脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶(FAR,EC1.1.1*)、酰基辅酶A还原酶(EC1.2.1.50)或者醇脱氢酶(EC1.1.1.1)。此外，本领域普通技术人员应当理解某些脂肪醇形成肽也能催化其他反应。例如，某些酰基辅酶A还原酶肽除了脂肪酸以外，也接受其他底物。因此，这类非特异性的肽也包括在内。编码脂肪醇形成肽的核酸序列在本领域内是已知的，公众可以获取这类肽。图1中提供了示例性的GenBank登录号。40现代碳分数现代碳分数(fM)是由国家标准和技术研究院(NIST)标准参考物质(SRMs)4990B和4990C定义的，分别称为草酸标准HOxI和HOxII。基本概念涉及14C/12CA同位素比率HOxI(参考AD1950)的0.95倍。这大概等同于经衰变修正的前工业革命时代的木头。对于当前的生物圈(植物材料)而言，fM约为1.1。烃包括含有碳(C)元素和氢(H)元素的化合物。所有烂均由碳骨架以及该骨架上连接的氢原子构成。有时，该术语被用作术语"脂肪烃"的简称。基本上存在3种类型的烃(l)芳香烃，其具有至少约一个芳香环；(2)饱和烃，亦称为烷，其缺少双键、三键或者芳香键；和(3)不饱和烃，其在碳原子之间具有一个或者多个双键或者三键，包括烯烃(例如二烯)和炔。分离的"分离的"生物学组分(诸如核酸分子、蛋白或者细胞)是已经基本上与该组分天然存在的其他生物学组分中分离或者纯化出来的生物学组分，如其他染色体和染色体外DNA序列；染色体和染色体外RNA;以及蛋白质。已经被"分离的，，核酸分子和蛋白包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子和蛋白。该术语还包含在生产宿主细胞中通过重组表达制备的核酸分子和蛋白，以及化学合成的核酸分子和蛋白。在一个实例中，分离的是指这样的天然存在的核酸分子，该核酸序列和3'端的序列)不再相邻。微生物包括来自古细菌域、细菌域和真核生物域的原核和真核微生物物种，后者包括酵母和丝状真菌、原生动物、藻类或者更高等的原生生物。术语"微生物细胞"和"微生物(microbes)"可以与名词微生物(microorganism)互换使用。核酸分子涵盖RNA和DNA序列，其包括但不限于cDNA、基因组DNA和mRNA。该名词包括合成的核酸分子，诸如那些化学合成或者重组产生的核酸分子。核酸分子可以是双链或者单链的。单链时，核酸分子可以是有义链或者反义链。此外，核酸分子可以是环状或者线性的。可操作地连接当第一核酸序列与第二核酸序列具有功能关系时，第一核酸序列即是可操作地连接第二核酸序列。例如，如果启动子处于能够影响编码序列的转录或者表达的位置，则所述启动子是可操作地连接所述编码序列。通常，可操作地连接的DNA序列是相邻的，并且将两个蛋白编码区连接到相同的阅读框内。转录为串联的单个信使RNA的分离基因的结构用操纵子表示。例如在质粒载体中，将基因紧邻地置于单个启动子的转录调节下，则构成合成操纵子。ORF(可读框)不含任何终止密码子的一系列编码氨基酸的核普酸三联体(即密码子)。这些序列通常^c翻译为肽。超表达当肽在重组宿主细胞中的浓度比它在相同物种的非重组宿主细胞中的浓度高时。利用本领域已知的任何方法均可以实现超表达。例如，引起超表达可以通过改变宿主细胞基因组DNA序列的调控序列、向基因组DNA序列导入一或多个编码序列、改变与基因表达的调控有关的一或多个基因(例如，使阻抑物基因缺失或者产生活跃的激活剂)、导入染色体外核酸序列、通过导入稳定序列来增加转录的RNA的稳定性，以及这些方法的组合。过量产生肽的重组微生物的实例包括表达编码酰基辅酶A合酶9(EC6.2.1,)的核酸序列的孩i生物。其他实例包括在硫酯酶肽(EC3.1.2,)的内源编码序列上游导入了外源启动子序列的微生物。超表达还包括基因的翻译速率高于该基因的内源翻译速率。4会测超表达的方法在本领域内公知的。例如可以利用rtPCR来评价转录的RNA水平，以及利用SDS-PAGE凝胶分析来评价蛋白水平。分配系数分配系数P定义为化合物在有机相中的平衡浓度除以平衡时水相(例如发酵液)中的浓度。在本文描述的两相系统的一个实施方案中，有机相由产生过程中的脂肪酸衍生物形成。但是在某些实例中，可以比如通过提供一层辛烷来促进产物的分离提供有机相。描述两相系统时，分配系数P通常以logP来讨论。logP为1的化合物将以10:1分配到有机相中。logP为-l的化合物将以1:10分配到有才几相中。通过选4奪合适的发酵液和有机相，高logP值的脂肪酸衍生物即使在发酵罐中的浓度非常低，也会分离到有机相中。生产宿主生产宿主是用于产生本文所述产品的细胞。正如本文所公开的，生产宿主经修饰从而表达或超表达所选基因，或者所选基因的表达被弱化。生产宿主的非限制性实例包括植物、动物、人、细菌、酵母或丝状真菌细胞。启动子和增强子真核生物中的转录调控信号包含"启动子"和"增强子"元件。启动子和增强子由短的DNA序列构成，这些序列与参与转录的细胞蛋白特异性地相互作用(Maniatis"a/.，Scz'ewce236:1237,1987)。已经从包括酵母、昆虫、哺乳动物和植物细胞的基因的大量真核生物来源分离到了启动子和增强子元件。还从病毒中分离到启动子和增强子元件。在原核生物中也发现了类似的控制元件，比如启动子和增强子。选择特定启动子和增强子取决于用于表达目的蛋白的细胞类型。某些真核和原核启动子和增强子的生产宿主范围广范，而其他的〗又在有限的生产宿主细^^中有功能(参见例如，Voss&a/.,7Vew心所oc/^m.Sc/"11:287，1986以及Maniatis等，1987,同前)。术语"启动子元件"、"启动子"或者"启动子序列"是指象开关一样激活基因的表达的DNA序列。如果基因被活化，就说它被转录或者参与转录。转录涉及由基因合成mRNA。因此，启动子充当转录控制元件，并且为基因转录为mRNA提供起始位点。纯化的名词"纯化的"是指通过例如提取或分离从自然环境中移走的分子。"基本上纯的"分子60%不含至少约、优选不含至少约75%,更优选不含至少约卯°/。与其天然结合的其他成分。本文中使用的术语"纯化的"或者"纯化"也指从样品中除去污染物。例如，除去污染物可以导致样品中目的脂肪酸衍生物的百分比提高。例如，在植物、细菌、酵母或哺乳动物生产宿主细胞中表达脂肪酸衍生物之后，通过除去生产宿主细胞蛋白质使脂肪酸衍生物得以纯化。纯化后，提高了样品中脂肪酸的百分比。术语纯化的并不要求绝对的纯；它只是作为一个相对的名词。因此，例如,纯化的脂肪酸衍生物制品是指其中的产物比位于其细胞环境内的产物浓度更高的制品。例如，纯化的脂肪酯是指和与之相伴的细胞组分(例如，核酸、脂、糖和其他肽)基本上分离的脂肪酯。在另一个实例中，纯化的脂肪酯制品是指基本上不含污染物(诸如那些发酵后可能存在的污染物)的脂肪酯制品。例如，当按重量计至少约50%的样品由脂肪酯组成时，脂肪酯是纯化的。在另一个实例中，当至少约60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、98%或者99%或者更高重量比的样品由脂肪酯组成时，脂肪酯是纯化的。重组体重组核酸分子具有非天然存在的序列，具有将两个否则是分开的序列片段通过人工组合制备的序列，或者以上两者。例如可以通过化学合成或者通过诸如遗传工程技术人工操作核酸分子的分离片段，实现这种人工组合。重组体还用于描述这样的核酸分子，这些核酸分于已进行过人工操作，但包含的调控序列和编码区与分离所述核酸的生物中见到的相同。重组蛋白是来源于重组核酸分子的蛋白质。重组或转化细胞是通过例如分子生物学技术导入了重组核酸分子，诸如酰基辅酶A合酶编码核酸序列的细胞。转化涵盖将核酸分子导入比如细胞的所有技术，包括但不限于用病毒载体进行转染、接合、用质粒载体进行转化，以及通过电穿孔、脂质体转染和微粒枪轰击(particlegunaccelemtion沐导入棵DNA。序列同一性用序列间共有的序列同一性来表示两个核酸序列或者两个氨基酸序列之间的相似性。序列同一性一般以同一性百分比来表示。同一性百分比越高，两个序列越相似。用于本发明，术语"同一性"和"相似性，，可以互换。比对序列以进行比较的方法是本领域公知的。各种程序和比对算法描述于Smith&Waterman,力dv.^p;/.Tl/aA.2:482,1981;Needleman&Wunsch，Afo/.丑/o厶48:443,1970;Pearson&Lipman,iVoc.TVaf/.颠AScZ腦85:2444,1988;Higgins&Sharp,G匿73:237244,1988;Higgins&Sharp,G"/OS5:151-153,1989;Corpetetal，M/c/dc爿c^We廳Ar/z16:10881-10890，1988;Huangetal.，05/058:155-165,1992;以及Pearsonetal"Me/Zzot^&飾/ecw/a^5油gy24:307-331,1994中。Altschuletal"Mo/,肠/.215:403-410,1990提供了对序列表达方法和同源性计算的详细考虑。200880009283.9说明书第22/96页NCBI基础局部序列比对搜索工具(BasicLocalAlignmentSearchTool,BLASTTM;Altschuletal.，Mo/.215:403-410,1990)可以从包括国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD)在内的多个来源获取，与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx4关用。BLASTTM可以由互联网上的NCBI网址接入。如本文所用的，序列同一性通常是用设定为默认参数BLASTTM软件的确定。例如，可以利用blasto(2.0版本)软件，使用默认参数(例如，期望值=10，矩阵=BLOSUM62,筛选(filter)=DUST(TatusovandLipmann,inpreparationasofDecember1,1999;和HancockandArmstrong,Compiit.Appl.Biosci.10:67-70,1994),缺口存在罚分(gapexistencecost)=ll，每残基缺口罚分(perresiduegapcost)=1，以及人比率=0.85)。比较两个多肽时，可以使用blastp(2.0版本)软件，默认参数(例如，期望值=10,筛选=SEG(WoottonandFederhen,Com/w/^sz'wC7em旨jK17:149-163,1993)，矩阵-BLOSUM62，缺口存在罚分=11,每残基缺口罚分=1，1=0.85)来确定两个核酸序列之间的序列同一性。对于核酸序列的比较，采用RT,ASTtm程序的"Blast2序列"功能(Blastn)，使用设定为默认参数(打开缺口的罚分(costtoopenagap)[默认值=11];延伸缺口罚分[默认值=1];期望值(E)[默认值=10.0];字长[默认值=11];单线描述值(numberofone-linedescriptions)(V)[默认值=100];显示的比对数(B)[默认值=100])的默认的BLOSUM62矩阵。当用这个方法进行评价时，与参照序列相似性越高的核酸序列会显示增加的序列同一性百分比，如至少约45%，至少约60%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约98%，或至少约99%的序列同一性。对于超过约30个氨基酸的氨基酸序列的比较，采用BLASTtm程序的"Blast2序列"功能，使用设定为默认参数(例如，缺口存在罚分为11,以及每残基缺口罚分为1)的默认BLOSUM62矩阵。当比对短肽(例如，少于约30个氨基酸)时，比对应当利用Blast2序列功能，采用设定为默认参数(例如，打开缺口罚分为9,延伸缺口罚分为l)的PAM30矩阵进行。当用这个方法进行评价时，与参照序列相似性越高的蛋白45质会显示增加的同一性百分比，如至少约35%、至少约45%、至少约50%、至少约60%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约98%，或至少约99%的序列同一性。表面活性剂能够降低溶解有该物质的液体之表面张力的物质。它们通常由水溶性的头部和烃链或尾部组成。水溶性头部是亲水性的，可以是离子的或者非离子性的。烃链是疏水性的。表面活性剂被用于大量产品，包括去污剂和清洁剂，还可用作纺织品、皮革和纸的辅剂，用于化工工艺、化妆品和药物、食品业以及农业。此外，它们还可以用于辅助提取和分离处于难以接近环境的原油或者作为水乳胶。根据用途的不同有4类表面活性剂。阴离子表面活性剂具有去污剂样活性，通常用于清洁用途。阳离子表面活性剂包含长链烃，通常被用于处理蛋白和合成的多聚体或者作为织物柔软剂和护发素的成分。两性表面活性剂也包含长链经，一般用于洗发剂。非离子型表面活性剂通常用于清洁产品。合酶合酶是催化合成过程的酶。本文所用该术语包括合酶和合成酶。转运蛋白协助一或多个化合物进和/或出生物或者细胞器的运动的蛋白质。在某些实施方案中，生产宿主功能性地表达编码ATP结合盒(ABC)转运蛋白的外源DNA序列，从而所述生产宿主将脂肪酸衍生物运输到培养基中。许多生物中都有ABC转运蛋白，诸如秀丽隐杆线虫(Caewor/za6d"^e/egaws)、才以南芥、真养产石成4干菌(J/ca/Zgew&sew《，/ms)(后来重新命名为i"/Wom.flew的//zfl)或红平红球菌(i^odococc^eo^Ara;o//s)。ABC转运蛋白的非限制性实例包括CER5、AtMRP5、AmiS2和AtPGPl。在优选实施方案中，ABC转运蛋白是CER5(例如AY734542).在其他实施方案中，所述转运蛋白是选自下述的外排蛋白来自大肠4干菌的AcrAB、ToIC、或AcrEF或者来自77^nwoj7"ec/ococa^e/owg^t^BP誦I的t111618、till619和t1110139。在其他实施方案中，转运蛋白是选自黑腹果蝇CDm^;/n7flme/awoga^w)、秀丽隐杆线虫、结核分枝杆菌或酉良酒酵母或任何本领46域/〉知的任一哺乳动物FATPs的脂肪酸转运蛋白(FATP)。在允许产生产物的条件下允许生产宿主产生所需产物的任何发酵条件，所述产物如酰基辅酶A，或脂肪酸衍生物，如脂肪酸、烃、脂肪醇、蜡或者脂肪酯。发酵条件通常包含许多参数。示例性的条件包括但不限于，温度范围、通气水平和培养基成分。上述条件的每一项单独和组合时允许生产宿主生长。示例性的培养基包括培养液或者凝胶。通常，培养基包括可以被微生物直接代谢的碳源，如葡萄糖、果糖、纤维素等等。此外，可以在培养基中可以使用促进碳源的流通(例如，将淀粉或纤维素解聚成可发酵的糖)及随后的代谢的酶。为了确定培养条件是否允许产物生成，将生产宿主培养约4、8、12、24、36或者48小时。在培养过程中或者培养后，收集并分析样品以确定培养条件是否允许产物生成。例如，可以检测培养生产宿主的样品或者培养基中的生产宿主是否存在所需产物。当分析产物是否存在时，可以使用诸如但不限于TLC、HPLC、GC/FID、GC/MS、LC/MS、MS以及以下实例提供的测定。载体被导入细胞从而产生转化细胞的核酸分子。载体可以包括允许其在细胞中复制的核酸序列，诸如复制原点。载体还可以包括一种或多种选择性记基因和本领域已知的其他基因元件。蜡蜡由脂肪酯构成。在优选实施方案中，脂肪酯含有由中到长》1链构成的A侧和B侧。除了脂肪酯以外，蜡可以包含其他成分。例如，蜡也可以包含烃、甾醇酯、脂肪醛、醇、酮、p-二酮、三酰甘油等。发明详述许多细胞或微生物可以利用脂肪酸作为能量来源，因此含有代谢脂肪酸产生能量的p-氧化途径。令人惊讶的是，发现超表达具有酰基辅酶A合酶活性(p-氧化途径中第一个发现的酶活性)的肽，和/或弱化(3-氧化途径中的其他基因，会在维持细胞或微生物的生存力的同时，提高所产生的酰基辅酶A的量。同样，超表达具有酰基辅酶A合酶活47性的肽，结合超表达形成脂肪酸衍生物的肽，可以提高脂肪酸衍生物的产量。脂肪酸衍生物可用作生物燃料和特种化学品(specialtychemicals),后者可以用于制备其他产品，诸如营养补充剂、多聚体、石蜡替代品和个人护理用品。此外，本文公开的教导使得可以产生具有特定分枝点、饱和度以及碳链长度的脂肪酸衍生物。可以用作生产宿主来产生脂肪酸衍生物的微生物的非限制性实例包括细菌、酵母菌或丝状真菌。其他合适的生产宿主的非限制性实例包括植物、动物或人细胞。可以由本文所述的生产宿主来产生醇(短链、长链、支链或不饱和的)。这些醇可以直接作为燃料或者可以用于产生脂肪酯。脂肪酯单独或者与本文描述的其他脂肪酸衍生物组合作为燃料。同样，由本文所述的生产宿主产生的烃可以作为生物燃料。这些烃基燃料可以设计成含有分枝点、限定的饱和度和特定的碳链长度。当单独用作生物燃津+或者与其他脂肪酸衍生物组合时，烃可以与添加剂或其他传统燃料(例如，醇、来源于三甘油酯的柴油和基于石油的燃料)组合。Knothe,Fwe/iVoc簡72g7fec/mo/ogy86:1059-1070，2005中描述了各种脂肪酸酯的十六烷值(CN)、粘度、熔点和燃烧热，该文献通过引用全文并入本文。利用本文提供的教导，可以将生产宿主工程改造为产生Knothe所述的任何脂肪酯。I.脂肪酸衍生物的制备和提高产量的修饰可以将用于产生酰基辅酶A和/或脂肪酸衍生物的生产宿主进行重组修饰从而包括超表达肽的核酸序列。例如，可以修饰生产宿主来提高酰基辅酶A的产量，减少脂肪酸衍生物和脂肪酸生物合成途径中的中间体如酰基辅酶A的代谢，或者减少脂肪酸生物合成途径中特定点的反馈抑制。除了修饰本文描述的基因外，也可以将其他细胞资源转为过量产生脂肪酸，例如可以弱化乳酸酯、琥珀酸酯和/或乙酸酯途径，而过超表达乙酰辅酶A羧化酶(acc)。对本文描述的生产宿主的修饰可以通过基因组改变、添加重组表达系统或者其组合来实现。图2-图6展示了所涉及的脂肪酸生物合成途径。以下A-G部分描述了这些途径中的步骤。途径中的不同步骤由不同酶催化。每个步骤都是超表达基因产生更多酶，从而驱使产生更多脂肪酸和脂肪酸衍生物的潜在位点。该途径所需的编码酶的基因也可以重组加入缺乏该基因的生产宿主。最后，为了提高目的产品的产量，可以弱化或阻断会与产生脂肪酸和脂肪酸衍生物的途径竟争的步骤。A.乙酰辅酶A-丙二酰辅酶A到酰基-ACP脂肪酸合酶(FAS)是一组催化酰基链起始和延伸的肽(Marrakchiafl/.'历oc/^抓'ca/Soc/W乂30:1050-1055,2002)。酰基载体蛋白(ACP)与FAS途径中的酶一起控制所产生的脂肪酸的长度、饱和度和分支情况。该途径中的步骤由脂肪酸生物合成(/a的和乙酰辅酶A羧化酶(flcc)基因家族的酶催化。根据期望的产物，可以弱化或者超表达这些基因中的一或多个(有关每个酶的酶活性的详细描述及其酶学分类号，参见图1)。1.脂肪酸生物合成途径乙酰辅酶A或丙二酰辅酶A到酰基ACP生产宿主中的脂肪酸生物合成途径4吏用前体乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A(图1)。该途径中的步骤由脂肪酸生物合成(/^>)和乙酰辅酶A羧化酶(acc)基因家族的酶催化。HeathW/Vog.丄—40(6):467-97(2001)中描述了这个途径，在此将该文献通过引用全文并入。乙酰辅酶A^皮乙酰辅酶A羧4b酶(Acc,由四个分开的基因ac^5CD编码的多亚基酶)羧化，形成丙二酰辅酶A。丙二酸基团由丙二酸-辅酶A:ACP转酰基酶(FabD)转移给ACP形成丙二酰ACP。然后发生缩合反应，丙二酰ACP与乙酰辅酶A结合形成p-酮脂酰ACP。卩-酮脂酰ACP合酶III(FabH)启动FAS循环，而P-酮脂酰ACP合酶I(FabB)和P-酮脂酰ACP合酶II(FabF)参与随后的循环。接下来重复这一轮步骤，直到制成合适长度的饱和脂肪酸。首先p-酮脂酰ACP被NADPH还原形成P-羟酰ACP。这个步骤由P-酮脂酰ACP还原酶(FabG)催化。然后|3-羟酰ACP脱水形成反式-2-烯酰-ACP。(3-羟酰ACP脱水酶/异构酶(FabA)或(3-羟酰ACP脱水酶(FabZ)催化这个步骤。NADPH依赖性反式-2-烯酰-ACP还原酶I、II或III(分别为Fabl、FabK和FabL)还原反式-2-烯酰-ACP，形成酰基ACP。(3-酮脂酰-ACP合酶I或P-酮脂酰-ACP合酶II(分别为FabB和FabF)催化的丙二酰-ACP和酰基-ACP的缩合起始随后的循环。2.修饰脂肪酸生物合成途径以提高酰基ACP产量可以对生产宿主生物进行工程改造以过量产生乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A。这类生产宿主生物包括植物、动物或人细胞。微生物，如细菌、酵母菌或丝状真菌，可以用作生产宿主。可以作为生产宿主的微生物的非限制性实例包括大肠杆菌、酿酒酵母、解脂假丝酵母、大肠杆菌、节杆菌AK19、粘红酵母、不动杆菌(A7'"^^fl"wsp.)菌林M-l、解脂假丝酵母和其他产油微生物。可以对生产宿主组合或者单独地进行几种不同的修饰以实现乙酰辅酶A/丙二酰辅酶A/脂肪酸和脂肪酸衍生物产量的提高。例如，为了提高乙酰辅酶A产量，可以在生产宿主中表达以下基因中的一或多个/^/、p朋^:、ace五F(编码丙酮酸盐和酮戊二酸脱氢酶复合体中的Elp脱氳酶成分和E2p二氢石克辛酰胺酰基转移酶成分)、/aW/、/aW)、/a6G、acpP,/a6F。在其他实例中，可以在生产宿主中表达其他编码脂肪酰辅酶A还原酶和醛脱羰基酶的DNA序列。本领域公知的是，可以构建含有一或多个以上提及的基因的质粒，其中，这些基因受到组成型或者否则是可调控的启动子的控制。这些基因的示例性GenBank登录号是pW(BAB34380，AAC73227,AAC73226)、;aw^:(又称为coaA,AAC76952)、(AAC73227，AAC73226)、/aW/(AAC74175)、/WD(AAC74176)、/a6G(AAC74177)、(AAC74178)、/"6尸(AAC74179)。此外，可以通过用条件复制的或者不复制的质粒转化，所述质粒含有相应基因的无效突变或者缺失突变，或者通过取代启动子或增强子序列，可以降低或者敲除工程微生物中/加五、gp^、W/l4、p/7Z)、ad/^、；/a、；ox8、acL4和/或acA:5的表达水平。这些基因的示例性GenBank登录号是(AAC73325)、gM」(AAC76632)、W/l4(AAC74462)、；j76(AAC73989)、fl^五(AAC74323)、pM(AAC75357)、尸ox8(AAC73958)、ac^(AAC75356)和acA:S(BAB81430)。所得到的50工程生产宿主在合适的环境下生长时，乙酰辅酶A产量水平增加。而且，通过用全新合成的质粒中包括的accvl&0)(例如登录号AAC73296，EC6.4.1.2)工程改造生产宿主，可以影响丙二酰辅酶A的过量产生。在全新合成的质粒中再包含编码酯酶的DNA序列(例如，登录号CAA89087、CAA98876)可以实现脂肪酸的过量产生。结果，在某些实例中，乙酰辅酶A羧化酶被超表达使得其胞内浓度相对天然表达水平提高至少约2倍，优选至少约5倍，或者更优选至少约10倍。此外，可以利用p&5(例如，登录号AAC77011)D311E突变提高可用的酰基辅酶A的量。此外，可以在生产宿主中包含sfa基因(FabA的抑制基因，例如登录号AAN79592)的过超达以提高单不饱和脂肪酸的产量(Rockda/.，丄5a"en'o/ogy178:5382-5387,1996)。B.酰基-ACP到脂肪酸1.脂肪酸生物合成途径酰基ACP到脂肪酸如上文所述，乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A经过几个步骤的加工形成酰基ACP链。酶sw-甘油-3-磷酸酰基转移酶(PlsB)催化酰基基团从酰基ACP或酰基辅酶A到甘油-3-磷酸的sn-1位点的转移。因此，PlsB是磷脂合成即脂肪酸途径的一部分中的关键调节酶。抑制PlsB会导致长链酰基ACP水平增加，这个反馈将抑制该途径中的早期步骤(例如，accABCD、fabH和fabl)。通过例如斩u酯酶超表达将这个调控解偶联，使得脂肪酸产量增加。^s和/W基因家族表达硫酯酶。Fabl在体外也被长链酰基辅酶A抑制。2.修饰脂肪酸生物合成途径产生需要的脂肪酸为了工程改造产生均质脂肪酸衍生物群体的生产宿主，可以使一或多个内源基因弱化或功能性缺失，结果，可以表达一或多种硫酯酶。例如，可以通过弱化使用C1S:I-ACP的硫酯酶ds(例如，登录号AAC73596和P0ADA1)并表达使用d。-ACP的硫酯酶C,。(例如，登录号Q39513)来产生do脂肪酸衍生物。这样产生相对均质的、碳链长度为10的脂肪酸衍生物群体。在另一个实例中，可以通过弱化产生非C14脂肪酸的内源硫酯酶并表达登录号Q39473的硫酯酶(其使用Cw-ACP)来产生Cm脂肪酸衍生物。仍然在另一个实例中，通过表达使用C12-ACP的硫酯酶(例如登录号Q41635)并弱化产生非C,2脂肪酸的硫酯酶来产生Cu脂肪酸衍生物。利用本领域已知的方法，例如在细胞裂解后利用i文射性前体、HPLC和GC-MS,可以-睑证乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A和脂肪酸的过量产生。表1列出了可用于请求保护的方法和生产宿主的疏酯酶的非限制性实例。表l:>琉酯酶<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>承Mayer"a/"皿C尸/赠5油gy7:1-11，2007.C.脂肪酸到酰基辅酶A1.脂肪酸转化为酰基辅酶A酰基辅酶A合酶(ACS)通过一个两步机制将游离脂肪酸酯化成酰基辅酶A。游离脂肪酸首先借助ATP焦磷酸解作用转化成酰基AMP中间体(腺香酸)。然后腺苷酸中被活化的羰基碳与辅酶A的巯基偶合，释放出AMP和酰基辅酶A终产物。参见ShockeyWa/，尸/a欣尸/o^zV/.129:1710-1722，2002。大肠杆菌ACS酶FadD和脂肪酸转运蛋白FadL是脂肪酸摄取系统的关键成分。FadL介导脂肪酸向细菌细胞内的运输，FadD介导酰基辅酶A酯的形成。当没有其他碳源可以利用时，细菌摄取外源脂肪酸，将其转化为酰基辅酶A酯，该物质与转录因子FadR结合，抑制fad基因的表达，这类基因编码负责脂肪酸转运(FabL)、激活(FadD)和p氧化(FadA、FadB、FadE和FadH)的蛋白。当有替代的碳源可以利用时，细菌合成脂肪酸作为酰基ACP,用于磷脂的合成，但它们不是P氧化的底物。因此，酰基辅酶A和酰基ACP均为脂肪酸的独立来源，会产生不同的终产物。参见Cavigliadfl/.,J.C&m.279(12):1163-1169，2004。2.提高脂肪酸转化为酰基辅酶A的修饰可以利用已知的肽工程改造生产宿主来产生各种长度的可以转化为酰基辅酶A的脂肪酸。一种制备脂肪酸的方法涉及增加一种或者多种酰基辅酶A合酶肽(EC6.2.1,)的表达或者表达它们更具活性的形式。表2列出了能够被表达从而产生酰基辅酶A和脂肪酸衍生物的酰基辅酶A合酶。这些酰基辅酶A合酶经检—险能够优化使用脂肪酰辅酶A作为底物的任何途径。利用生物信息学和合成基因，在生产菌抹中表达了异源/fl^D基因，并评价了它们产生生物柴油和可能的生物原油的能力。表2:酰基辅酶A合酶<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>根据它们与大肠杆菌FadD的相似性，选择以下同源基因进行合成和评价来自结核分枝杆菌H37Rv的/adDZ)35[NP—217021],来自枯草芽孢杆菌的y//I[NP—388908]、来自铜绿假单胞菌PAOl的/a,[NP一251989]，来自酿酒酵母的/a^D同源物Faa3p[NP—012257]。可以用于产生酰基辅酶A以及脂肪酸衍生物的其他来自真核生物的脂肪酸酰基辅酶A合酶包括Shockeyda/.,P/aW.P/^w'o/.129:1710-1722，2002(拟南芥)、Caviglia&a/.,丄編.CTz亂279:1163-1169，2004(鼠)以及Knoll"fl/.，丄編.CA亂269(23):16348-56,1994(酵母)中描述的那些。编码这些合酶的基因序列是本领域已知的。参见例如Johnson&a/.，丄Szo/.CAem.269:18037-18046，1994;Shockeya/.,尸/flwA尸力;as/0/.129:1710-1722，2002jBlack&a/.,丑Zo/CAem.267:25513-25520,1992。这些真核酰基辅酶A合酶尽管与大肠杆菌/a^)序列没有高同源性，^f旦在/^/Z)敲除的大肠杆菌中可以补充FadD活性。D.酰基辅酶A到脂肪醇1.酰基辅酶A到脂肪醇的转化酰基辅酶A被NADH依赖性酰基辅酶A还原酶(例如，Acrl)还原为脂肪醛。然后脂肪醛^皮NADPH依赖性醇脱氬酶(例如，YqhD)还原为脂肪醇。可选地，脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶(FAR)催化酰基辅酶A还原为脂肪醇和CoASH。FAR使用NADH或NADPH作为这个四电子还原反应中的辅助因子。尽管产醇FAR反应经由醛中间体进行，但并不释放游离醛。因此，生醇FAR与执行酰基辅酶A的二电子反应并产生游离脂肪醛作为产物的那些酶完全不同(参见ChengandRussell，J.Chem.，279(36):37789—37797,2004;MetzWa/"户/^w'o/.，122:635-644,2000)。2.提高酰基辅酶A转化为脂肪醇的修饰可以利用已知的多肽工程改造生产宿主以便由酰基辅酶A产生脂肪醇。一种制备脂肪醇的方法涉及增加脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶(由基因如来自FAR的acrl，EC1.2.1.50/1.1.1编码)或者酰基辅酶A还原酶(EC1.2.1.50)和醇脱氢酶(ECl.l.l.l)的表达或者表达它们更具活性的形式。图1提供了示例性的GenBank登录号。可以将脂肪醇描述为烃基表面活性剂。为了产生表面活性剂，修饰生产宿主使得它能由可再生碳源产生表面活性剂。这类生产宿主包括第一外源DNA序列和第二外源DNA序列，所述第一外源DNA序列编码能够将脂肪酸转化为脂肪醛的蛋白，所述第二外源DNA序列编码能够将脂肪醛转化为醇的蛋白。在某些实例中，第一外源DNA序列编码脂肪酸还原酶。在一个实施方案中，第二外源DNA序列编码哺乳动物微粒体的醛还原酶或者长链醛脱氢酶。在另一个实例中，第一和第二外源DNA序列来自于节杆菌04w/iraZ^"wK^"、粘红酵母、不动杆菌C4c7'""oZ)flc化rsp.)菌抹M-l或者解脂假丝酵母。在一个实施方案中，第一和第二异源DNA序列都来自于不动杆菌(Jc/"Wo^"ersp.)菌抹M-l抹或者解脂假丝酵母的多酶复合物。编码将脂肪酸转化为长链醇且，可用于表面活性剂制备的蛋白的异源DNA序列的其他来源包括但不限于，高山被孢霉(ATCC32222)、弯曲1%3求菌(CVj^ococcwsci/n^^ws,又牙尔为j/n.ofn'cw/wcwnY^WAM)、J/cfl"/voraxya&"ws(T9T=DSM12718-ATCC700854)、不动杆菌(^c/"e/o6a"wsp.)HOl-N(ATCC14987)和混浊红J求菌(PD630DSMZ44193)。在一个实例中，脂肪酸衍生物是饱和的或者不饱和的表面活性剂产物，其碳链长度为约6个到约36个碳原子、约8个到约30个碳原子、约10到约26个碳原子、约12到约20个碳原子或者约12到约16个碳原子。在另一个实例中，表面活性剂产物的碳链长度为约10到约18个碳原子或者约12到约14个碳原子。用于产生表面活性剂的合适宿主可以是真核或者原核微生物。示例性的宿主包括已被工程改造表达乙酰辅酶A羧化酶的节杆菌(^W/^o6flc&。JA:19、粘红酵母、不动杆菌(」c/"e/o6a"ersp.)菌才朱M-l、拟南芥、解脂假丝酵母，酿酒酵母和大肠杆菌。也可以使用先天具有合成高水平的脂和油形式的表面活性剂前体的宿主，如经工程改造表达乙酰辅酶A羧化酶的混浊红球菌、节杆菌j〖19、粘红酵母和大肠杆菌，以及其他油质细菌、酵母和真菌。E.脂肪醇到脂肪酯可以利用已知的多肽工程改造生产宿主以产生各种长度的脂肪酯。一种制备脂肪酯的方法包括增加一种或者多种醇O-乙酰基转移酶肽(EC2.3丄84)的表达或者表达其更具活性的形式。这些肽通过将乙酰辅酶A和醇转化为辅酶A和酯催化醇的乙酰化。在某些实例中，醇O-乙酰基转移酶肽可以与选定的硫酯酶肽、FAS肽和脂肪醇形成肽联合表达，从而可以控制碳链长度、饱和度和分枝度。在某些情况下，可以共表达Md操纵子以便产生支链脂肪酸前体。本文使用的醇O乙'酰基转移酶肽包括属于酶分类号EC2.3.1.84的肽，以及能够催化乙酰辅酶A和醇转化形成辅酶A和酯的任意其他肽。此外，本领域普通技术人员理解醇O-乙酰基转移酶肽能催化其他反应。例如，某些醇(9-乙酰基转移酶肽除了脂肪醇或者乙酰辅酶A硫酯外，还会接受其他底物，诸如其他醇和其他酰基辅酶A硫酯。因此这类非特异性或者特异性不同的醇O-乙酰基转移酶肽也包括在内。醇(9-乙酰基转移酶肽的序列是公开提供的。图1提供了示例性的GenBank登录号。用于表征具体醇(9-乙酰基转移酶肽活性的测定是本领域公知的。还可以对O-乙酰基转移酶进行工程改造，-使它们具有新的活性以及对供体酰基基团或者受体醇部分的新的特异性。可以通过本领域记载的合理的进化方法产生工程酶。F.酰基辅酶A到脂肪酯1.脂肪酯的产生脂肪酯由酰基辅酶A:脂肪醇酰基转移酶(例如酯合酶)合成，该酶将长链脂肪醇经由酯键与脂酰辅酶A连接。已知酯合酶及其编码基因可以来自希蒙得木植物和细菌不动杆菌菌4朱ADP1(以前称为醋酸4丐不动杆菌04c/"Wo6ac&rca/coace"cw"ADP1)。细菌酯合酶是双功能酶，显示出酯合酶活性以及由二酰甘油底物和脂酰辅酶A形成三酰甘油的能力(酰基辅酶A:二甘油酰基转移酶(DGAT)活性)。基因wflxA/ga"扁码酯合酶和DGAT。参见Chengefl/.，《/.所o/.C/2em.279(36):37798—37807,2004;KalscheuerandSteinbuchel,丄所o/.C/z缝278:8075-8082,2003。酯合酶还可以用于产生本文所述的某些能够作为燃料如生物柴油的脂肪酯。2.产生脂肪酯的修饰可以利用已知的多肽，对由酰基辅酶A和醇产生包括蜡在内的脂肪酯进行工程改造。一种制备脂肪酯的方法包括提高一或多种酯合酶(EC2.3.1.20,2.3.1.75)的表达,或者是表达其更具活性的形式。公众可获得酯合酶肽序列。图1中提供了示例性的GenBank登录号。美国专利第7118896号中提供了鉴定酯合酶活性的方法，在此将该专利通过引用全文并入。在具体实例中，如果需要的产物是酯基生物燃料，则修饰生产宿主从而其由可再生能源产生酯。这类生产宿主包括编码酯合酶的外源DNA序列，其被表达即赋予所述生产宿主由可再生能源合成饱和的、不饱和的或者支链脂肪酯的能力。在某些实施方案中，生物还可以表达编码以下示例性蛋白的DNA序列脂肪酸延伸酶、酰基辅酶A还原酶、酰基转移酶、酯合酶、脂酰转移酶、二酰甘油酰基转移酶、酰基辅酶A蜡醇酰基转移酶。在可选的实施方案中，所述生物表达编码双功能酯合酶/酰基辅酶A:二酰甘油酰基转移酶的DNA序列。例如，所述双功能酯合酶/酰基辅酶A:二酰甘油酰基转移酶可以选自来自西蒙得木、不动杆菌菌4朱ADP1(以前称为醋酸钙不动杆菌ADP1)、博克岛食烷菌、铜绿假单胞菌、i^m/z'Z)acte/v'a&"Ws、拟南芥或真养产碱杆菌(后重新命名为ia/Wom'fle^ra;/ia)的多酶复合体。在一个实施方案中，脂肪酸延伸酶、酰基辅酶A还原酶或者蜡合酶来自真养产碱杆菌(后重新命名为ia/Wom'aew/ra//(3)或其他在文献中已知能产生酯诸如蜡或脂肪酯的生物的多酶复合体。编码可用于产生脂肪酯的酯合成蛋白的异源DNA序列的另外来源包括，但不限于高山被孢霉(例如，ATCC32222)、弯曲隐球菌(又称为4pz'ofn'cwwicwrra^附)、J/cam'vonwc乂a^ewsz》(侈'H口T9T=DSM12718=ATCC700854)、不动4干菌菌才朱HOl-N(例如ATCC14987)和混浊红J求菌(例如PD630，DSMZ44193)。用于产生脂肪酯的有用生产宿主可以是真核或者原核微生物。产生脂肪酯的生产宿主的非限制性实例包括酿酒酵母、解脂假丝酵母、大肠杆菌、节杆菌爿尤79、粘红酵母、不动杆菌菌抹M-1、解脂假丝酵母和其他产油微生物。在一个实例中，使用来自不动杆菌ADP1基因座AA017391的酯合酶(在Kalscheuer和Steinbuchel,Sw/.C/zem.278:8075-8082,2003中有描述，在此将该文献通过引用并入)。在另一个实例中，使用来自希蒙得木基因座AAD38041的酯合酶。任选地，使用酯输出蛋白(exporter),如FATP家族的成员，可以用来协助酯释放入胞外环境。可以使用的酯输出蛋白的非限制性实例是来自黑腹果蝇基因座NP—524723的脂肪酸(长链)转运蛋白CG7400-PA同种型A。G.酰基ACP、酰基辅酶A到烃1.来自特定微生物的烃已知多种微生物产生烃，如烷、烯烃和类异戊二烯。这些烃中许多来源于脂肪酸生物合成。通过控制天然生产宿主中与脂肪酸生物合成相关的基因，可以控制这些烃的产生。例如，在布朗葡萄藻中，经由脂肪醛的脱羰作用可以实现烃的生物合成。脂肪醛由脂酰辅酶A还原酶还原脂酰硫酯产生。因此，通过工程改造布朗葡萄藻表达特定基因，如控制脂肪酸的链长的硫酯酶，所述脂肪酸进入烷生物合成途径，可以控制烷终产物的结构。在布朗葡萄藻中表达产生支链脂肪酸生物合成的酶将产生支链烷。导入影响脂肪酸去饱和的基因将产生烯烃。这些基因的组合还可以进一步控制生成的烃的最终结构。为了产生更高水平的天然或者工程改造的烃，可以表达、超表达或者弱化参与脂肪酸及其前体生物合成或者降解为其他产物的基因。这些方法中的每一种都可用于在弗尼斯弧菌(h力n'oy^m'sw'0Ml和其他通过脂肪醇的还原产生烷的弗尼斯弧菌菌抹中产生烷。除了弗尼斯弧菌外，可以使用其他利用脂肪酸途径的产烷生物。这些方法中的每一种还可用于由藤黄微球菌、嗜麦芽窄食单胞菌、/eogfl/kocc^s(ATCC8456)和相关微生物的许多菌抹产生烯烃。这些微生物产生来源于脂肪酸前体头对头缩合的长链烯烃。利用本文描述的方法控制脂肪酸前体的结构和水平将形成不同链长、分支和饱和水平的烯烃。还可以利用蓝细菌作为生产宿主产生脂肪酸衍生物，如脂肪醇、脂肪酸酯和烃。例如集胞蓝菌PCC6803和细长聚球菌PCC7942可以作为生产宿主，并且可以利用常规的分子生物学技术进行工程改造(Thiel,awa/拜^o/c"woZ)a"en'a,1TheMolecularBiologyofGyanobacteria,AdvancesinPhotosynthesisandRespiration581-611(KluwerAcademicPublishers1994》Koksharova&Wolk,4pp厶M/cra^o/.5/o&c/mo/.，58:123-137,2002)。可以在这些生物中容易地鉴定分离到脂肪酸生物合成基因(参见表18)。并且，许多蓝细菌是烃如十七烷的天然生产者，因此含有可以被解除调控和超表达的烃生物合成基因，结合对其脂肪酸生物合成基因的操做，从而提高烃产量。与其他细菌不同，某些蓝细菌(例如，集胞蓝菌PCC6803)的酯中含有多不饱和的脂肪酸(Mumta，尸/fl""e〃尸/o^'o/.,33:933-941，1992)，因此具有产生多不饱和的脂肪酸衍生物的固有能力。最重要的是，蓝细菌是光合生物，通过采集阳光和固定二氧化碳来合成其全部细胞碳。所以，蓝细菌中产生的脂肪酸衍生物直接来源于co2。2.来自伯醇还原的烃还可以利用还原伯醇的进化氧化还原酶产生烃。已知脂肪伯醇可用于在樣史生物如弗尼斯弧菌Ml(Park,/5a"enW.,187:1426-1429,2005)中产生烷。可以用于由脂肪醇产生烃的氧化还原酶的一个实例是NAD(P)H依赖性氧化还原酶。合成的NAD(P)H依赖性氧化还原酶可以利用进化工程产生，并在生产宿主中表达以产生脂肪酸衍生物。使脂肪醇还原酶"进化"从而具有所需活性的过程是公知的(KolkmanandStemmer，旭/5/o化c/mo/.19:423-8,2001;NessWa/"yUv/Voto'wCTem.55:261-92,2000;MinshullandStemmer,CwrrQp/C7emSzo/.3:284-90，1999;HuismanandGray,CwrrOpzwAug;13:352-8,2002;以及美国专利发明者胡志浩,费尔南多·瓦勒申请人:Ls9公司