脂肪酸组合物的制作方法
【专利说明】
[0001] 本发明申请是基于申请日为2012年7月20日、申请号为201280035948.X(国际申请 号为PCT/US2012/047731)、名称为"脂肪酸组合物"的发明专利申请的分案申请。
[0002] 和本申请一起提交的电子递交序列表（"sequencelisting.txt，5,136字节，2011 年7月20日创建"）的内容W其整体通过引用并入本文。
技术领域
[0003]本发明设及经分离微生物W及其菌株和突变体、生物质、微生物油、组合物和培养 物;生产微生物油、生物质和突变体的方法;和使用经分离微生物、生物质、培养物和微生物 油的方法。
【背景技术】
[0004]基于碳链的长度和饱和特征，将脂肪酸分类。基于链中存在的碳数目，脂肪酸被称 为短链、中等长度链或长链脂肪酸；当碳原子之间不存在双键时称为饱和脂肪酸，当存在双 键时被称为不饱和脂肪酸。当仅存在一个双键时，不饱和长链脂肪酸是单不饱和的，当存在 多于一个双键时，是多不饱和的。
[000引基于脂肪酸的甲基端的第一个双键的位置，将多不饱和脂肪酸(PUFA)分类：ω-3 (η-3)脂肪酸在第Ξ个碳处含有第一个双键，而ω-6(η-6)脂肪酸在第六个碳处含有第一个 双键。例如，二十二碳六締酸r'DHA")是具有22个碳的链长度和6个双键的ω-3长链多不饱 和脂肪酸化C-PUFA)，通常命名为"22: 6η-3"。其他ω-3LC-PUFA包括二十碳五締酸ΓΕΡΑ")， 命名为"20: 5η-3"、ω-3二十二碳五締酸r'DPAη-3")，命名为"22: 5η-3"。0齡和ΕΡΑ已被称 作"基本'脂肪酸。ω-6LC-PUFA包括花生四締酸TARA")，命名为"20: 4η-护和ω-6二十二碳 五締酸r'DPAη-护），命名为"22: 5η-护。
[0006]由于位于细胞膜中，ω-3脂肪酸是影响细胞生理功能的重要的生物学分子，它能 调节生物活性化合物的产生与基因表达，并起到生物合成底物的作用。Roche，Η.Μ.， Proc.Nu化.5〇。.58:397-401(1999)。例如，0齡在人类大脑皮层中构成约15%至20%的脂 质，在视网膜中构成30%至60%的脂质，在睾丸与精子中富集，并且是母乳中的一个重要组 分。Berg自，J.P.和Barnathan'G..Adv.Biochem.Eng.Biotechno1.96:49-125(2005)oDHA在 脑中构成至多97%的ω-3脂肪酸，且在视网膜中构成至多93%的ω-3脂肪酸。此外，DHA是 胎儿与婴儿发育W及维持成人认知功能所必需的。（参考文献同上。）因为在人体中无法从 头合成ω-3脂肪酸，因此运些脂肪酸必须从营养来源获取。
[0007]亚麻仁油与鱼油被认为是良好的ω-3脂肪酸膳食来源。亚麻仁油不含有Ε Ρ A、 DHA、DPA或ARA，但却含有亚麻酸(C18:3n-3)，其是使机体能够制造EPA的一种结构单元。然 而有证据显示代谢转换的速率缓慢且多变，特别在健康不佳的那些个体中。根据具体的种 及其饮食，鱼油在脂肪酸组成的类型与水平方面存在显著的差异。例如，与野生鱼类相比， 水产养殖所饲养的鱼的ω-3脂肪酸水平较低。此外，鱼油具有含环境污染物的风险，并且可 能与稳定性问题和鱼的腥臭或味道有关。
[000引破囊壶菌是破囊壶菌目（Τ虹austochyhiales)的微生物。破囊壶菌包括裂殖壶菌 属（Schizochy1:;rium)与破囊壶菌属（Thraustochy1:;rium)的成员，并且已经确认为包括DHA 与EPA在内的ω-3脂肪酸的一种替代来源。参见第5130242号美国专利。与相应的鱼油或微 藻油相比，由运些海生异营性微生物所生产的油通常具有较简单（simpler)的多元不饱和 脂肪酸谱(profiles)sLewis,Τ.Ε.iMar.Biotechnol. 1:580-587(1999)。已报导破囊壶菌种 的菌株所生产的ω-3脂肪酸，在该生物体所生产的总脂肪酸中占很高的百分比。第5130242 号美国专利；Huang，J.等的J.Am.Oil.Chem.Soc. 78 :605-610( 2001) ;Huang，J.等的 Mar.Biotechnol. 5:450-457(2003)。然而，分离的破囊壶菌在所生产的LC-PUFA的种类和量 方面不同，运使得一些先前所述的菌株在培养中可能具有不期望的ω-6脂肪酸水平和/或 会表现低的生产力。因此，一直存在对展现出高生产力和所期望的LC-PUFA分布的微生物的 分离的需求。
【发明内容】
[0009 ] 本发明设及WATCC登录号ΡΤΑ-10212保藏的种的经分离的微生物。
[0010] 本发明设及具有WATCC登录号ΡΤΑ-10212保藏的种的特征的经分离的微生物。
[0011] 本发明设及包含下述18srRNA的经分离的微生物，所述18srRNA包含沈QIDNO: 1多核巧酸序列或与SEQIDNO: 1具有至少94%同一性的多核巧酸序列。
[0012] 本发明设及包含18srRNA多核巧酸序列的经分离的微生物，所述18srRNA多核巧 酸序列与WATCC登录号PTA-10212保藏的微生物的18srRNA多核巧酸序列具有至少94%同 一性。
[0013] 本发明设及WATCC登录号PTA-10208保藏的种的经分离的微生物，其中由微生物 生产的总脂肪酸包含W重量计超过约10%的二十碳五締酸。
[0014] 本发明设及具有WATCC登录号PTA-10208保藏的种的特征的经分离的微生物，其 中由微生物生产的总脂肪酸包含W重量计超过约10%二十碳五締酸。
[0015]本发明设及生产甘油Ξ醋组分的经分离的微生物，其中甘油Ξ醋组分的二十碳五 締酸含量为W重量计至少约12%。
[0016] 在一些实施方式中，本发明的经分离的微生物是突变菌株。
[0017] 本发明设及WATCC登录号口了4-10212、口了4-10213、口了4-10214、口了4-10215、口了八-10208、PTA-10209、PTA-10210 或PTA-10211 保藏的经分离的微生物。
[0018] 本发明设及包含本发明的微生物的任一种或其混合物的生物质。
[0019] 本发明设及分离的生物质，其中W重量计生物质干细胞重量的至少约20%是脂肪 酸，其中W重量计脂肪酸的超过约10%是二十碳五締酸，且其中脂肪酸包含W重量计各低 于约5%的花生四締酸和二十二碳五締酸n-6。在一些实施方式中，W重量计脂肪酸的至少 约25%是二十二碳六締酸。
[0020] 在一些实施方式中，本发明设及包含甘油Ξ醋的分离的生物质，其中W重量计甘 油Ξ醋的至少约12%是二十碳五締酸。
[0021] 在一些实施方式中，本发明设及本发明的分离的生物质的任何一种，其中脂肪酸 还包含W重量计各低于约5%的油酸、亚油酸、亚麻酸、二十碳締酸和芥酸。
[0022] 本发明设及包含本发明的微生物的任一种或其混合物的分离的培养物。
[0023]本发明设及用于非人类动物或人类的包含本发明的微生物或生物质的任一种或 其混合物的食用产品、化妆品或药物组合物。
[0024]本发明设及下述微生物油，所述微生物油包含W重量计至少约20%的二十碳五締 酸和W重量计各低于约5%的花生四締酸、二十二碳五締酸n-6、油酸、亚油酸、亚麻酸、二十 碳締酸、芥酸和十八碳四締酸的。在一些实施方式中，微生物油还包含W重量计至少约25% 的二十二碳六締酸。
[0025]发明设及下述微生物油，所述微生物油包含W重量计至少约10%的甘油Ξ醋组 分，其中甘油Ξ醋组分中W重量计至少约12%的脂肪酸是二十碳五締酸，其中甘油Ξ醋组 分中W重量计至少约25%的脂肪酸是二十二碳六締酸，和其中甘油Ξ醋组分中W重量计低 于约5%的脂肪酸是花生四締酸。
[0026]本发明设及用于非人类动物或人类的包含本发明的微生物油的任一种的食用产 品、化妆品或药物组合物。在一些实施方式中，食用产品是婴幼儿配方。在一些实施方式中， 婴幼儿配方适于早产儿。在一些实施方式中，食用产品是牛奶、饮料、治疗性饮品、营养饮品 或其组合。在一些实施方式中，食用产品是非人类动物或人类产品的添加剂。在一些实施方 式中，食用产品是营养补充剂。在一些实施方式中，食用产品是动物饲料。在一些实施方式 中，动物饲料是水产养殖饲料。在一些实施方式中，动物饲料是家养动物饲料、动物园动物 饲料、耕畜饲料、家畜饲料或其组合。
[0027]本发明设及生产包含ω-3脂肪酸的微生物油的方法，所述方法包括:在培养物中 培养本发明的经分离的微生物的任一种或其混合物W生产包含ω-3脂肪酸的油。在一些实 施方式中，所述方法还包括提取油。
[0028]本发明设及生产包含ω-3脂肪酸的微生物油的方法，所述方法包括从本发明的生 物质的任一种中提取包含ω-3脂肪酸的油。在一些实施方式中，使用有机溶剂提取方法(例 如己烧提取)来提取微生物油。在一些实施方式中，使用无溶剂提取方法来提取微生物油。 [0029]本发明设及由本发明的方法生产的微生物油。
[0030]本发明设及用于生产本发明的生物质的方法，其包括:在培养物中培养本发明的 经分离的微生物的任一种或其混合物W生产生物质。
[0031]本发明设及由本发明的方法生产的生物质。
[0032]本发明设及用于生产本发明的突变菌株的方法，其包括:对本发明的微生物的任 一种进行诱变处理并分离突变菌株。
[0033]本发明设及本发明的经分离的微生物、生物质或微生物油的任一种或其混合物用 于制造治疗炎症或其相关病况(condition)的药物的用途。
[0034]本发明设及本发明的经分离的微生物、生物质或微生物油的任一种或其混合物用 于治疗炎症或其相关病况的用途。
[0035]本发明设及用于治疗炎症或其相关病况的本发明的经分离的微生物、生物质或微 生物油的任一种或其混合物。
[0036]本发明设及用于治疗需要的个体的炎症或其相关病况的方法，其包括给个体施用 本发明的经分离的微生物、生物质或微生物油的任一种或其混合物和药学上可接受的载 体。
[0037]本发明设及经分离的微生物W及其菌株和突变体，W及其生物质、微生物油、组合 物和培养物。本发明设及从本发明的微生物生产微生物油、生物质和突变体的方法和使用 微生物、生物质和微生物油的方法。本文描述的微生物是高生产力的并产生独特的脂肪酸 谱，所述脂肪酸谱部分特征为高水平的ω-3脂肪酸，特别是高水平的EPA。
[0038]具体地，本发明设及如下各项：
[0039] 1. -种微生物油，其包含ω-3多不饱和脂肪酸，所述ω-3多不饱和脂肪酸包含W 重量计占ω-3多不饱和脂肪酸总量的约含90%量的二十二碳六締酸和二十碳五締酸，其中 二十碳五締酸的量为W重量计占二十二碳六締酸和二十碳五締酸总量的从约19 %至约 55%，且二十二碳六締酸的量为W重量计占二十二碳六締酸和二十碳五締酸总量的从约 35% 至约 71%。
[0040] 2.根据项1所述的油，其中所述二十碳五締酸的量为W重量计占二十二碳六締酸 和二十碳五締酸总量的从约19%至约43%，且所述二十二碳六締酸的量为W重量计占二十 二碳六締酸和二十碳五締酸总量的从约35%至约47%。
[0041] 3.根据项1所述的油，其中所述二十碳五締酸的量为W重量计占二十二碳六締酸 和二十碳五締酸总量的从约27%至约54%，且所述二十二碳六締酸的量为W重量计占二十 二碳六締酸和二十碳五締酸总量的从约36%至约63%。
[0042] 4.根据项1所述的油，其中所述二十碳五締酸的量为W重量计占二十二碳六締酸 和二十碳五締酸总量的从约26%至约38%，且所述二十二碳六締酸的量为W重量计占二 十二碳六締酸和二十碳五締酸总量的从约52%至约64%。
[0043] 5.根据项1所述的油，其中所述二十碳五締酸的量为W重量计占二十二碳六締酸 和二十碳五締酸总量的从约28%至约36%，且所述二十二碳六締酸的量为W重量计占二十 二碳六締酸和二十碳五締酸总量的从约54%至约62%。
[0044] 6.根据项1-5任一项所述的油，其中所述油包含每克油从约120mg至约220mg的二 十碳五締酸和每克油从约240mg至约450mg的二十二碳六締酸。
[0045] 7.根据项1-5任一项所述的油，其中所述油包含每克油从约130mg至约195mg的二 十碳五締酸和每克油从约320mg至约480mg的二十二碳六締酸。
[0046] 8.根据项1-5任一项所述的油，其中所述ω-3多不饱和脂肪酸还包含W重量计占 ω-3多不饱和脂肪酸总量的约0%至约10%量的二十二碳五締酸。
[0047] 9.根据项8所述的油，其中所述油包含每克油约150mg至约300mg的二十碳五締酸； 每克油从约200mg至约400mg的二十二碳六締酸；和每克油从约0至约55mg的二十二碳五締 酸。
[0048] 10.根据项1-9任一项所述的油，其中所述油由裂殖壶菌属种生产。
[0049] 11.根据项任一项所述的油1-10,其中所述油包含W重量计各少于约5%的花生四 締酸、二十二碳五締酸n-6、油酸、亚油酸、亚麻酸、二十碳締酸、芥酸和十八碳四締酸。
[0050] 12.根据项1-11任一项所述的油，其中所述油包含W重量计至少约10%的甘油Ξ 醋组分，其中所述甘油Ξ醋组分中W重量计至少约12%的脂肪酸是二十碳五締酸，其中所 述甘油Ξ醋组分中W重量计至少约25%的脂肪酸是二十二碳六締酸和其中所述甘油Ξ醋 组分中W重量计少于约5%的脂肪酸是花生四締酸。
[0051] 13. -种包含ω-3多不饱和脂肪酸的微生物油，所述ω-3多不饱和脂肪酸包含W 重量计占ω-3多不饱和脂肪酸总量的约含90%量的二十二碳六締酸和二十碳五締酸，和W 重量计占ω-3多不饱和脂肪酸总量的约ο%至约2%量的二十二碳五締酸;其中W重量计二 十碳五締酸的量为二十二碳六締酸和二十碳五締酸总量的从约10%至约25%，W重量计二 十二碳六締酸的量为二十二碳六締酸和二十碳五締酸总量的从约75%至约90%。
[0052] 14.根据项13所述的油，其中所述油包含每克油为从约55mg至约150mg的二十碳五 締酸;每克油为从约410mg至约540mg的二十二碳六締酸和每克油为从约0至约12mg的二十 二碳五締酸。
[0053] 15.根据项1-6和8-13任一项所述的油，其中所述ω-3多不饱和脂肪酸总量为每克 油至少约400mg。
[0054] 16.根据项1-6和8-13任一项所述的油，其中所述二十二碳六締酸和二十碳五締酸 总量为每克油约400mg。
[0055] 17.根据项1-14任一项所述的油，其中所述ω-3多不饱和脂肪酸总量为每克油从 约 400mg至约 750mg。
[0056] 18.根据项任一项1-14所述的油，其中所述ω-3多不饱和脂肪酸总量为每克油至 少约500mg。
[0057] 19.根据项任一项1-14所述的油，其中所述二十二碳六締酸和二十碳五締酸总量 为每克油约500mg。
[0058] 20.根据项1-19任一项所述的油，其中所述油具有W重量计总ω-3多不饱和脂肪 酸的选自 1:1至1:1.5、1:1至1:2、1:1.5至1:2、1:1至1:2.5、1:2至1:2.5和1:4至1:7 的ΕΡΑ: DHA比率。
[0059] 21.-种口服剂型，其包含根据项1-20任一项所述的油。 巧060] 发明详述
[0061]本发明设及经分离的微生物及由其所衍生的菌株。由本发明的经分离的微生物所 "衍生"的菌株可W是天然衍生的或人工衍生的，比如突变体、变体或重组菌株。本文中使用 时，术语"分离的"并不一定反映分离物已被纯化的程度，而是指从天然形式或天然环境中 分离（isolation)或隔离（separation)。分离物可包括但不限于分离的微生物、分离的生物 质、分离的培养物、分离的微生物油及分离的序列（比如本文中所公开的分离的多核巧酸序 列）。本文中使用时，术语"微生物'包括但不限于术语"微藻"、"破囊壶菌"及与本文中所述 的任一种保藏微生物相关的分类学分类。与本发明的任一种微生物(包括本文中所述的保 藏微生物）相关时所用的术语"破囊壶菌目"（"Thraustochytriales")、"破囊壶菌" ("thraustochytrid")、''裂殖壶菌属"（"Schizochytrium")及。破囊壶菌属" TThraustochytrium")基于囊括可获得的系谱信息的当前分类学分类，并且在本申请递交 日后修订分类学分类的情况下不意图其限制作用。
[0062] 在一些实施方式中，本发明设及WATCC登录号PTA-10212保藏的种的经分离的微 生物。与ATCC登录号PTA-10212相关的分离的微生物在本文中也称为破囊壶菌属种 (Thraustoch}rtriumsp.)ATCCPTA-10212,即破囊壶菌属菌种27797。与ATCC登录号PTA-10212相关的经分离的微生物是在布达佩斯条约(BudapestTreaty)下于2009年7月14日保 藏于美国维吉尼亚州20110-2209马纳沙斯(Manassas)大学大道化niversityBoulevard) 10801号的美国典型培养物保藏中屯、(AmericanTypeQiltureCollection)的专利保藏库 (PatentD邱ositoiT)。在一些实施方式中，本发明设及WATCC登录号PTA-10212保藏的经 分离的菌株。在一些实施方式中，本发明设及WATCC登录号PTA-10212保藏的经分离的菌 株。
[0063]在一些实施方式中，本发明设及具有WATCC登录号PTA-10212保藏的种的特征的 经分离的微生物或由其所衍生的菌株。WATCC登录号PTA-10212保藏的种的特征可W包括 其生长性质与表型性质(表型性质的例子包括形态学性质和繁殖性质）、其物理性质和化学 性质（比如干重和脂质谱）、其基因序列及其组合，其中所述特征使运些种区别于先前鉴定 过的种。在一些实施方式中，本发明设及具有WATCC登录号PTA-10212保藏的种的特征的经 分离的微生物，其中所述特征包括:包含SEQIDNO: 1的多核巧酸序列或与SEQIDNO: 1的 同一性为至少94%、95 %、96 %、97 %、98 %或99 %的多核巧酸序列的18srRNA，WATCC登录 号PTA-10212保藏的种的形态学性质与繁殖性质，W及WATCC登录号PTA-10212保藏的种的 脂肪酸谱。在一些实施方式中，本发明的分离的微生物具有与WATCC登录号PTA-10212保藏 的微生物基本相同的生长特征。在一些实施方式中，本发明的分离的微生物具有与WATCC 登录号PTA-10212保藏的微生物基本相同的生长性质。在一些实施方式中，本发明设及经分 离的微生物，其包含具有SEQIDNO: 1的多核巧酸序列或与SEQIDNO: 1的同一性为至少 94%、95%、96%、97%、98%或99%的多核巧酸序列的183诚酷。在一些实施方式中，本发 明设及经分离的微生物，其包含与WATCC登录号PTA-10212保藏的微生物的18srRNA多核 巧酸序列的同一性为至少94 %的18srRNA多核巧酸序列。
[0064] 在一些实施方式中，本发明设及WATCC登录号PTA-10212保藏的微生物的突变菌 株。在进一步的实施方式中，该突变菌株是WATCC登录号PTA-10213(即破囊壶菌属菌种 27797-2)、PTA-10214(即破囊壶菌属菌种27797-13)或PTA-10215(即破囊壶菌属菌种 27797-20)保藏的菌株。与ATCC登录号PTA-10213、PTA-10214及PTA-10215相关的微生物是 在布达佩斯条约（BudapestTreaty)下于2009年7月14日保藏于美国维吉尼亚州20110-2209马纳沙斯(Manassas)大学大道(UniversityBoulevard) 10801号的美国典型培养物保 藏中屯、(AmericanTypeQiltureCollection)的专利保藏库（PatentDepository)。
[0065] 在一些实施方式中，本发明设及WATCC登录号PTA-10208保藏的种的经分离的微 生物。与ATCC登录号PTA-10208相关的分离的微生物在本文中也称为裂殖壶菌属种 (Schizoch^riumsp)ATCCPTA-10208,即裂殖壶菌属菌种27173(9.l)-3-E。与ATCC登录号 PTA-10208相关的微生物是在布达佩斯条约(BudapestTreaty)下于2009年7月14日保藏于 美国维吉尼亚州20110-2209马纳沙斯(Manassas)大学大道(UniversityBoulevard) 10801 号的美国典型培养物保藏中屯、（AmericanTypeCultureCollection)的专利保藏库 (PatentD邱ositoiT)。在一些实施方式中，本发明设及WATCC登录号PTA-10208保藏的经 分离的菌株。
[0066] 在一些实施方式中，本发明设及WATCC登录号PTA-10208保藏的种的经分离的微 生物，其中由微生物生产的总脂肪酸包含W重量计超过约10%、超过约11 %、超过约12%、 超过约13%、超过约14%、超过约15%、超过约16%、超过约17%、超过约18%、超过约19% 或超过约20%的EPA。在一些实施方式中，本发明设及WATCC登录号PTA-10208保藏的种的 经分离的微生物，其中由微生物生产的总脂肪酸包含W重量计约10%至约55%、约10%至 约50%、约10%至约45%、约10%至约40%、约10%至约35%、约10%至约30%、约15%至约 55 %、约15 %至约50%、约15 %至约45 %、约15%至约40 %、约15 %至约35%、约15 %至约 30 %、约20 %至约55 %、约20 %至约50 %、约20 %至约45 %、约20 %至约40 %、约20 %至约 35 %或约20 %至约30 %的EPA。
[0067]在一些实施方式中，本发明设及具有WATCC登录号PTA-10208保藏的种的特征的 经分离的微生物，其中由微生物生产的总脂肪酸包含W重量计超过约10%的二十碳五締 酸。WATCC登录号PTA-10208保藏的微生物的特征包括其生长性质与表型性质（表型性质的 例子包括形态学性质和繁殖性质）、其物理性质和化学性质（比如干重和脂质谱）、其基因 序列及其组合，其中所述特征使运些种区别于先前鉴定过的种。在一些实施方式中，本发明 设及具有WATCC登录号PTA-10212保藏的种的特征的经分离的微生物，其中所述特征包括： 包含SEQIDN0:2的多核巧酸序列的18srRNA，WATCC登录号PTA-10208保藏的种的形态学 性质与繁殖性质，W及WATCC登录号PTA-10208保藏的种的脂肪酸谱。在一些实施方式中， 本发明的分离的微生物具有与WATCC登录号PTA-10208保藏的那些微生物基本相同的物理 和化学性质。
[006引在一些实施方式中，本发明设及WATCC登录号PTA-10208保藏的微生物的突变菌 株。在进一步的实施方式中，该突变菌株是WATCC登录号PTA-10209(即裂殖壶菌属菌种 27173(9.l)-3-E#2)、PTA-10210(即裂殖壶菌属菌种27173(9.l)-3-E#4)或PTA-10211(即裂 殖壶菌属菌种27173(9.1)-3-E#8)保藏的菌株。与ATCC登录号PTA-10209、PTA-10210和PTA-10211相关的微生物是在布达佩斯条约(BudapestTreaty)下于2009年9月25日保藏于美国 维吉尼亚州20110-2209马纳沙斯(Manassas)大学大道(UniversityBoulevard) 10801号的 美国典型培养物保藏中屯、（AmericanTypeCultureCollection)的专利保藏库（Patent Depository)。
[0069]在一些实施方式中，本发明设及生产