平板霉素和平板素的高产工程菌株及其发酵和分离纯化工艺的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于工程菌株领域，具体涉及平板霉素和平板素的生产菌株。
【背景技术】
[0002] 平板霉素（platensimycin，PLM)和平板素（platencin,PTN)是近年来新发现的 一类对革兰氏阳性菌敏感的强效抗生素。它们的发现被广泛认为是现代抗生素研究里程碑 式的成就之一。平板霉素和平板素结构相似，它们由一个笼状四环或H环不饱和丽与一个 3-氨基-2, 4-二居基苯甲酸侧链通过醜胺键各自连接而成（平板霉素见化学结构式（1)和 平板素见化学结构式（2))。平板霉素通过与细菌脂肪酸生物合成酶FabF/B共价结合，而平 板素通过与细菌脂肪酸生物合成酶F油F和F油H共价结合而阻断脂肪酸合成，属于广谱、 强效和低毒抗生素，尤其是对包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌在内多种耐药性革兰氏阳性 菌有特效。
[0003]
[0004]目前临床使用抗生素的作用机制包括阻碍细菌蛋白、细胞壁、叶酸、DNA或RNA合 成，W及破坏细胞膜，然而平板霉素和平板素通过阻塞脂肪酸合酶而阻断脂肪酸合成，代表 了一种新的抗生素作用机制。综上所述，平板霉素和平板素的发现被誉为是本世纪抗生素 发现"里程碑"式的成就之一。另外，平板霉素最近被报道能够有效降低动物体内甘油H醋 的浓度，因而它同时具有被开发成治疗糖尿病药物的潜力。
[0005]目前产平板霉素的野生菌株只有一种，被称为普拉特链霉菌 MA7327(St;reptomycesplatensisMA7327)，分离于非洲南非的±壤中。目前产平板素 的野生菌株包括普拉特链霉菌M7327,W及分离于欧洲西班牙±壤中的普拉特链霉菌 MA7339(Str巧tomycesplatensisMA7339)。但是，平板霉素和平板素在上述两株菌株中 的产量都很低，已报道的普拉特链霉菌M7327和普拉特链霉菌M7339产平板霉素和平板 素的量f氏于 10m邑/L(Sm曰nskiMJ,et曰 1.EngineeredStreptomycespi曰tensisstr曰ins thatoverproduceantibioticsplatensimycinandplatencin.AntimicrobAgents Qiemo化er. 2009Apr;53 (4):1299-304;WangJ,etal.Discoveryofplatencin,adual FabFandFabHinhibitorwithinvivoantibioticproperties.Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 2007Mayl;104(18) :7612-6.))，极大地阻碍了平板霉素和平板素的应用研究和开发利 用。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术产平板霉素和平板素的菌株少，且产量低的不足，本发明的目的是 提供可W产生平板霉素和平板素的高产菌株，并研究合适的发酵工艺和分离提纯工艺。本 发明获得了H株能高产平板霉素和平板素的工程菌株普拉特链霉菌SB12026、SB12027和 SB12028;然后，建立了平板霉素和平板素的发酵生产工艺；最后，我们进一步建立了不依 赖于高效液相色谱分离的平板霉素和平板素的分离提纯工艺。本发明的菌株产量明显高于 现有菌株。本发明的分离提纯工艺可W分别得到纯度在95%W上的平板霉素和平板素。
[0007] 为实现上述目的，本发明的技术方案是：
[0008] 本发明的技术方案之一；一种平板霉素和平板素的高产工程菌株，所述工程菌株 为普拉特链霉菌SB12026,其保藏编号为CCTCCM2014286。
[0009] 本发明的技术方案之二；一种平板霉素和平板素的高产工程菌株，所述工程菌株 为普拉特链霉菌SB12027,其保藏编号为CCTCCM2014287。
[0010] 本发明的技术方案之H;-种平板霉素和平板素的高产工程菌株，所述工程菌株 为普拉特链霉菌SB12028,其保藏编号为CCTCCM2014288。
[0011] 本发明的技术方案之四：
[0012] 用所述工程菌株生产平板霉素和平板素的发酵工艺，将所述工程菌株的抱子按 照体积比0. 01%。-0. 1%。的接种量分别接种至种子培养基中，在25C~32°C、200巧m~ 25化pm恒温摇床培养24h~60h;然后再按照体积比1 %~20 %的接种量转接于生产培养 基中，在25°C~32°C、200巧m~25化pm恒温摇床培养5~10天；
[0013] 所述种子培养基的质量百分比配方；酵母粉1 %~2%，麦芽提取物0.5%~ 1. 2 %，葡萄糖2 %~3 %，硫酸镇0. 025 %~0. 04 %，六水H氯化铁0. 025 %~0. 04 %，其余 为水，P册.5~7. 5。
[0014] 所述生产培养基的质量百分比配方；糊精，1 %~6%，乳糖1 %~6%，酵母粉 0. 1 %~0. 8%，碳酸巧0. 08%~0. 13%，3-(N-吗晰基）丙礙酸0. 3%~2%，消泡剂 0-1. 0%，其余为水，抑6. 5~7. 5。
[0015] 所述麦芽提取物是现有公知的产品，本申请实施例中的麦芽提取物均购于上海生 工。
[0016] 本发明的技术方案之五：
[0017] 一种平板霉素和平板素的分离和纯化工艺，包括W下步骤：
[0018] (1)吸附：将生产平板霉素和平板素的工程菌株的发酵培养后的发酵产物过滤， 将发酵液与菌丝体分离，然后向发酵液中投入占发酵液质量为3% -10%的大孔吸附树脂， 揽拌混合3-8小时，吸附完成后，静置发酵液，过滤，将发酵液和大孔吸附树脂分开，水洗大 孔吸附树脂后瞭干；
[0019](2)分离纯化；将所述大孔吸附树脂用己醇浸提，得提取液；将所述提取液旋转蒸 干，填充于硅胶柱中，用体积比为6-8:3的丙丽：正己焼溶液洗脱，收集洗脱液，蒸干，得到 含有平板霉素和平板素的粗品；再将所述含有平板霉素和平板素的粗品用丙丽溶解，加入 聚醜胺粉末，拌匀，加入干净的聚醜胺柱上部，分别用1-2倍柱体积、抑为7的 3-(N-吗晰基）丙礙酸或磯酸盐缓冲液，1-2倍柱体积、抑为7的3-(N-吗晰 基）丙礙酸缓冲液或磯酸盐：己醇=8-9:1的溶液，1-2倍柱体积、抑为7的 3-(N-吗晰基）丙礙酸或磯酸盐缓冲液：己醇溶液=4-5:5的溶液，1-2倍柱体积、抑为7 的3-(N-吗晰基）丙礙酸或磯酸盐缓冲液：己醇=2:7-8的溶液，和1-2倍柱体 积的己醇溶液冲洗聚醜胺柱，收集柱后流份；通过薄层色谱和高效液相色谱检测柱后流份， 分别合并含有平板霉素或平板素的组分，干燥，分别得到平板霉素和平板素产品。
[0020] 所述平板霉素和平板素产品的纯度在95. 0%W上。
[0021] 步骤（1)所述发酵产物优选为本发明所述发酵工艺发酵后的产物。
[0022] 下面对发明中所涉及的菌株保藏信息进行统一说明：
[0023] 1、菌种名称为；普拉特链霉菌CB00739
[0024]拉了文学名为；Str巧tomycesplatensisCB00739,
[00巧]保藏编号为；CCTCCNO;M2014280，
[002引保藏日期为；2014年6月25日，
[0027] 保藏单位为；中国典型培养物保藏中必，
[002引保藏单位地址为：中国武汉，武汉大学。
[0029] 2、菌种名称为；普拉特链霉菌CB00765
[0030]拉了文学名为；Str巧tomycesplatensisCB00765,
[0031]保藏编号为；CCTCCNO;M2014281，
[003引保藏日期为；2014年6月25日，
[0033] 保藏单位为；中国典型培养物保藏中必，
[0034] 保藏单位地址为：中国武汉，武汉大学。
[0035] 3、菌种名称为；普拉特链霉菌CB00775
[0036]拉了文学名为；Str巧tomycesplatensisCB00775,
[0037]保藏编号为；CCTCCNO;M2014282，
[003引保藏日期为；2014年6月25日，
[0039] 保藏单位为；中国典型培养物保藏中必，
[0040] 保藏单位地址为：中国武汉，武汉大学。
[0041] 4、菌种名称为；普拉特链霉菌SB12026
[0042]拉了文学名为；Str巧tomycesplatensisSB12026,
[0043]保藏编号为；CCTCCNO;M2014286，
[0044] 保藏日期为；2014年6月25日，
[0045] 保藏单位为；中国典型培养物保藏中必，
[0046] 保藏单位地址为：中国武汉，武汉大学。
[0047] 5、菌种名称为；普拉特链霉菌SB12027
[0048]拉了文学名为；Str巧tomycesplatensisSB12027,
[0049]保藏编号为；CCTCCNO;M2014287，
[0050] 保藏日期为；2014年6月25日，
[0051] 保藏单位为；中国典型培养物保藏中必，
[0052] 保藏单位地址为：中国武汉，武汉大学。
[0053] 6、菌种名称为；普拉特链霉菌SB12028
[0054]拉了文学名为；StreptomycesplatensisSB12028,
[00巧]保藏编号为；CCTCCNO;M2014288，
[005引保藏日期为；2014年6月25日，
[0057] 保藏单位为；中国典型培养物保藏中必，
[005引保藏单位地址为：中国武汉，武汉大学。
[0059] 与现有技术相比，本发明的优势在于：
[0060] 1、本发明获得了H株能高产平板霉素和平板素的工程菌株普拉特链霉菌 SB12026、SB12027 和SB12028。
[0061] 2、本发明建立了用普拉特链霉菌SB12026、SB12027和SB12028生产平板霉素和平 板素的发酵生产工艺，产量高。
[0062] 3、本发明建立了平板霉素和平板素的分离提纯工艺，该方法不依耐于高效液相色 谱，该工艺可W分别得到纯度在95. 0%W上的平板霉素和平板素。
【附图说明】
[0063] 图1是普拉特链霉菌SB12026、SB12027、SB12028基因工程菌株的构建示意图；
[0064] 图2是普拉特链霉菌CB00739、CB00765和CB00775,W及普拉特链霉菌SB12026、 SB12027和SB12028的基因型数据对比图；泳道1为DNA分子量标准品；泳道2为普拉特 链霉菌CB00739;泳道3-4为普拉特链霉菌SB12026;泳道5普拉特链霉菌CB00765;泳道 6-7为普拉特链霉菌SB12027;泳道8为普拉特链霉菌CB00775;泳道9-10为普拉特链霉菌SB12028。
[0065] 图3是普拉特链霉菌SB12026发酵产物的高效液相色谱图，其中?是平板霉素；? 是平板素；
[0066] 图4是普拉特链霉菌SB12027发酵产物的高效液相色谱图，其中?是平板霉素； ?是平板素；
[0067] 图5是普拉特链霉菌SB12028发酵产物的高效液相色谱图，其中?是平板霉素； ?是平板素；
[0068] 图6是平板霉素标准样高效液相色谱图，其中?是平板霉素；
[0069]图7是平板素标准样高效液相色谱图；其中?是平板素；
[0070] 图8是发酵产物分离纯化后的产品高效液相色谱图，其中?是平板霉素；
[0071] 图9是发酵产物分离纯化后的产品高效液相色谱图，其中?是平板素。
【具体实施方式】
[0072] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明。