一种发酵生产去甲万古霉素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于发酵工程领域，具体设及一种发酵生产去甲万古霉素的方法。
【背景技术】
[0002] 盐酸去甲万古霉素是我国唯一一个自主研制并成功应用于临床的糖肤类抗生素， 由链霉菌发酵产生，用于治疗革兰氏阳性菌感染。去甲万古霉素具有和万古霉素类似的化 学结构、药理性质、抗菌活性和抗菌谱，其作用机制为抑制细菌细胞壁的合成，是临床上治 疗由甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌引起的严重感染的首选药物。
[000引去甲万古霉素分子由两个基本结构组成，即糖基部分a-o-vancosamine-β-ο-glucosyl和肤基部分的中屯、屯肤核，在临床上使用的是去甲万古霉素盐酸盐，分子式为 〔65出3札雌24-肥1，分子量为1471.71。盐酸去甲万古霉素为白色或类白色无定形粉末，极 易溶于水，可溶于含水甲醇，不溶于高级醇类、丙酬或乙酸，低浓度尿素可增加其水溶解度。 [0004]去甲万古霉素为微生物发酵的次级代谢产物，存在于发酵液中，去甲万古霉素不 仅对其他生物有杀死或抑制作用，对产生菌自身也有杀死或抑制作用，即抗生素对产生菌 自身存在着毒害作用。随着去甲万古霉素在发酵液中浓度不断增高，其产生菌受到高浓度 产物的反馈调节作用，使产生菌生物细胞及酶的潜力不能充分发挥，造成去甲万古霉素的 产率难W提高，从而成为制约提高去甲万古霉素发酵水平的瓶颈。选育能耐受高浓度去甲 万古霉素的产生菌固然可W使生产指标得W提高，但并不能从根本上解决问题。
【发明内容】
[000引本发明的目的是解决现有技术中微生物发酵制备去甲万古霉素存在的高浓度产 物对产生菌的反馈抑制及发酵水平低的问题，提供一种通过优化发酵培养基配方、发酵条 件，并在发酵过程中添加超顺磁性微球，W吸附发酵液中去甲万古霉素，降低对产生菌的反 馈抑制，促进去甲万古霉素的生物合成，来提高去甲万古霉素产量的方法。
[0006] 本发明的关键构思为:采用河北拟无枝酸菌菌株为出发菌株，在微生物发酵生产 去甲万古霉素的过程中，添加超顺磁性微球，优化超顺磁性微球的加入时间、加入量、预处 理方式等条件，吸附发酵液中去甲万古霉素，降低对产生菌的反馈抑制，提高去甲万古霉素 产量。
[0007] 本发明所提供的一种发酵生产去甲万古霉素的方法，包括W下步骤： a、制备河北拟无枝酸菌菌种的种子液 将河北拟无枝酸菌菌种的斜面培养物或抱子液接种于种子培养基，26-30°C、在摇瓶或 发酵罐中培养48-72 h获得种子液。
[000引其中所述的种子培养基按W下方法制得:玉米淀粉2.0-4.0克、葡萄糖10.0-40.0 克、热棒黄豆饼粉2.0-10.0克、酵母粉5.0-10.0克、玉米浆2.0-8.0克、氯化钢0.5-2.0克、屯 水硫酸儀0.5-2.0克、碳酸巧3.0-6.0克，加水定容至lOOOmL，p册.5-7.0，121°C灭菌30min。 [0009]本发明所述的菌种为华北制药1996年从正定菜园采集，经鉴定为河北拟无枝酸菌 菌株(Amycolatopsis hebeiensis) NCPC 1023菌株，该菌株已于2003年保藏于中国典型培 养物保藏中屯、，保藏号为:CCTCC NO: 203099)。
[0010] b、制备河北拟无枝酸菌菌种的发酵液 将上述种子液W体积百分比6-10%的接种量接种于发酵培养基，在摇瓶或发酵罐中发 酵，发酵48-72小时之间添加超顺磁性微球，继续发酵，总发酵时间168-192 h，发酵溫度27-29 °C，得到发酵液。
[0011] 其中所述发酵培养基按W下方法制得:葡萄糖20.0-30.0克、玉米粉20.0-40.0克、 热棒黄豆饼粉0-20.0克、棉巧蛋白粉0-10.0克、酵母粉0-10.0克、玉米浆5.0-10.0克、憐酸 二氨钟3.0-5.0克、氯化钢1.0-2.0克、屯水硫酸儀1.0-1.5克，加水定容至lOOOmL，抑6.5-7.0，12rC 灭菌 30min。
[0012] 优选的，其中所述超顺磁性微球的粒径为5-30μπι，粒径分布为单分散，表面的功能 基团为簇酸基团;所述超顺磁性微球为经过盐酸处理后的酸式结构。
[0013] 优选的，其中步骤b中所述超顺磁性微球添加量为每升发酵液添加5-15g。
[0014] 优选的，超顺磁性微球添加量为每升发酵液添加8-12g。
[001引优选的，励顿磁性微球的粒径化0-20皿。
[0016] 优选的，所述步骤b中发酵压力为0.05 ± 0.0 IMpa、通气比为1:0.8-1.2，揽拌速度 为300-400巧m。
[0017] 优选的，其中所述步骤帥超顺磁性微球的添加时间为发酵54-64小时之间加入。
[0018] 超顺磁性微球预处理方式为每克微球加入3-5ml的2moL/L的HC1，静态浸泡2-4小 时后过滤，除去盐酸，然后用去离子水洗涂至pH值4.0-5.0。
[0019] 发酵完成后，超顺磁性微球经外加磁场回收后用乙醇酸水缓冲液洗脱吸附的去甲 万古霉素，酸性水溶液为憐酸-憐酸盐缓冲液，pH值为4.0，乙醇在溶液中的体积百分比为 15〇/〇。
[0020] 由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术进步是： 超顺磁性微球是近年来发展起来的一种新型磁性颗粒，运种磁性颗粒W磁性的Fe3〇4 为核，W聚合物为外壳层。微球的表面引入簇基功能基团，本发明发现其对去甲万古霉素有 强吸附作用。在产生菌合成去甲万古霉素期间，在发酵液中加入超顺磁性微球，吸附发酵液 中的去甲万古霉素，降低发酵产物对产生菌的反馈抑制，从而显著提高了去甲万古霉素的 产量。
[0021] 本发明的有益效果： 上述优选条件，所获去甲万古霉素的产量从11658 μg/ml提高到2259化g/ml，为去甲万 古霉素的工业化生产提供了一种新的方法。本发明通过优化发酵条件，保证了不同发酵批 次间代谢产物及发酵水平的一致性;通过在发酵过程中加入超顺磁性微球，吸附发酵液中 去甲万古霉素，降低了发酵产物对产生菌的反馈抑制，显著促进去甲万古霉素生成，在其他 培养条件相同的条件下，与不添加超顺磁性微球相比，去甲万古霉素产量提高了35%W上， 提高了产能和设备利用率，降低了废水和废渣的排放。
【附图说明】
[0022] 图1为菌株发酵培养48小时的菌丝形态。
[0023] 图2为菌株发酵培养72小时的菌丝形态。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。 下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明均为工业级原料;所用的超顺磁性微球由苏州 纳微生物科技有限公司提供。其它试剂均为市售产品。
[0025] 实施例1、500mL摇瓶发酵制备去甲万古霉素 河北拟无枝酸菌菌株种子液的制备 将河北拟无枝酸菌菌株的斜面培养物或抱子液接种于种子培养基，26°C、220 rpm、培 养72 h获得种子液； 其中所述的种子培养基按W下方法制得:玉米淀粉0.2克、葡萄糖4.0克、热棒黄豆饼粉 0.2克、酵母粉1.0克、玉米浆0.8克、氯化钢0.05克、屯水硫酸儀0.05克、碳酸巧0.3克，加自 来水定容至lOOmL，抑6.5，12rc灭菌30min。
[0026] 本发明所述的去甲万古霉素产生菌的菌种保藏号为CCTCC203099。
[0027] 发酵培养基组成： 葡萄糖20.0克、玉米粉40.0克、热棒黄豆饼粉20.0克、玉米浆10.0克、憐酸二氨钟3.0 克、氯化钢1.0克、屯水硫酸儀1.0克，加自来水定容至lOOOmL，pH6.5，121°C灭菌30min， 500mL摇瓶发酵培养。
[0028] 发酵条件:500 ml装量的Ξ角瓶6瓶，每瓶装50ml培养基，种子培养72小时后接种， 接种量为10%，培养溫度为28 °C、摇床转速220 rpm，在培养至48小时后，（菌株发酵培养48 小时的菌丝形态见图1)，每瓶加入粒径为扣m的超顺纳米微球介质0.75g，发酵培养168 h (菌株发酵培养72小时的菌丝形态见图2)。
[0029] 发酵结束后，将6瓶发酵液合并后，磁性分离回收发酵液中的超顺磁性微球。回收 后在超顺磁性微球中加入23ml的乙醇-酸性缓冲水溶液洗脱去甲万古霉素，分别测定洗脱 液与发酵液中的去甲万古霉素单位。计算去甲万古霉素发酵单位。
[0030] 结果见表1，在优化的发酵条件下，采用传统的黄豆饼粉作为有机氮源，在发酵过 程中加入超顺磁性微球，去甲万古霉素的发酵单位为1573祉g/ml。
[0031] 实施例2、化自动发酵罐发酵制备去甲万古霉素 河北拟无枝酸菌菌株种子液的制备 将河北拟无枝酸菌菌株的斜面培养物或抱子液接种于种子培养基，28°C、220 rpm、培 养64 h获得种子液； 其中所述的种子培养基按W下方法制得:玉米淀粉3.0克、葡萄糖20.0克、热棒黄豆饼 粉10.0克、酵母粉5.0克、玉米浆5.0克、氯化钢1.0克、屯水硫酸儀1.0克、碳酸巧4.0克，加自 来水定容至lOOOmUp册.8，121°C灭菌30min。
[0032] 本发明所述的去甲万古霉素产生菌的菌种保藏号为CCTCC203099。
[0033] 发酵培养基组成： 葡萄糖90.0克、玉米粉90.0克、热棒黄豆饼粉45.0克、棉巧蛋白粉15.0克、玉米浆15.0 克、憐酸二氨钟15.0克、氯化钢6.0克、屯水硫酸儀4.5克，加自来水定容至3000mL，pH6.8， 12rc灭菌30min，化自动发酵罐发酵培养。
[0034] 发酵条件:罐内的压力为0.05±0.01 Mpa、通气比l:0.8vvm，装料量为化，种子培 养64小时后接种，接种量为8%，培养溫度为29 °C，转速为400 r/min。在发酵培养开始56小 时后，加入粒径为30μπι的超顺纳米微球介质15g，发酵培养192小时。