一种发酵生产卷曲霉素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于发酵工程领域，具体设及一种发酵生产卷曲霉素的方法。
【背景技术】
[0002] 结核病死灰复燃，正严重威胁人类健康。近年来，耐多药结核(MDR-TB)的出现，W 及结核分枝杆菌与人类免疫缺陷病毒的联合感染导致结核病再度在全球成流行趋势。卷曲 霉素是治疗耐多药结核分枝杆菌和持留菌感染的一类重要药物。该药对耐药型结核杆菌感 染引起的肺结核疗效显著，毒副作用较其他二线药物小，是目前较理想的抗结核菌药物。
[0003] 卷曲霉素，是由卷曲链霉菌发酵产生的环状多肤类抗生素，由四个结构相似的活 性化合物IA、IB、IIA、IIB组成，其中IA和IB的含量占 90%W上，是发挥疗效的主要成分。IA的 分子式为C25也4化4〇8，分子量为668，IB的分子式为C25也4化4〇7，分子量为652。
[0004] 在卷曲霉素发酵过程中加入前体物质是提高发酵单位的重要手段，通过补加前体 物质，可W达到控制卷曲链霉菌的生物合成方向及增加卷曲霉素产量的目的。卷曲霉素是 环状多肤类抗生素，遵循NRPS(非核糖体肤合成酶)生物合成途径，其前体物质为特定的氨 基酸。
[000引在卷曲霉素的生物合成途径中，主要包括非蛋白氨基酸的合成、肤环骨架的生物 合成、成环后结构修饰。卷曲霉素的肤环骨架是由多个经过修饰的非蛋白氨基酸和天然氨 基酸经非核糖体多肤合成酶催化合成的5肤环。成环后氨基酸残基4位上的β氨基甲酯化，氨 基酸残基3位上的β赖氨酸酷基化成为重要结构修饰步骤，在氨基酸活化酶和肤缩合酶的作 用下，形成副组分中间体卷曲霉素 ΠΑ、ΠΒ向有效组分ΙΑ、ΙΒ的转化。从外界补加合成卷曲 霉素的氨基酸前体物质，能明显地提高卷曲霉素的发酵水平。但是，外源性前体物质在发酵 液中的残留浓度过高，会使生产菌株中毒，不利于卷曲霉素的生物合成;而前体物质不足也 会大大影响卷曲霉素的生产。因此，研究适当的前体添加策略对卷曲霉素的高产稳产具有 重要的意义。
[0006] 卷曲霉素为微生物发酵的次级代谢产物，存在于发酵液中，卷曲霉素不仅对其他 生物有杀死或抑制作用，对产生菌自身也有杀死或抑制作用，即抗生素对产生菌自身存在 着毒害作用。随着卷曲霉素在发酵液中浓度不断增高，其产生菌受到高浓度产物的反馈调 节作用，使产生菌生物细胞及酶的潜力不能充分发挥，造成卷曲霉素的产率难W提高，从而 成为制约提高卷曲霉素发酵水平的瓶颈。选育能耐受高浓度卷曲霉素的产生菌固然可W使 生产指标得W提高，但并不能从根本上解决问题。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是解决现有技术中微生物发酵制备卷曲霉素存在的发酵水平低的 问题，提供一种通过优化发酵培养基配方、发酵条件，在发酵过程中添加前体物质，促进卷 曲霉素的生物合成，从而提高卷曲霉素产量的方法。
[0008] 本发明所提供的一种发酵生产卷曲霉素的方法，包括W下步骤： a、制备卷曲链霉菌菌株的种子液 将卷曲链霉菌菌株的斜面培养物或抱子液接种于种子培养基，26-30°C、培养48-72 h 获得种子液。
[0009] 其中所述的种子培养基按W下方法制得:薦糖20.0-40.0克、酵母粉5.0-10.0克、 硫酸锭2.0-3.0克、玉米浆2.0-8.0克、氯化钢0.5-2.0克、碳酸巧3.0-6.0克，加水定容至 lOOOmUp 册.5-7.0，121°(3灭菌3〇111111。
[0010] 本发明所述卷曲霉素产生菌可选用菌种编号NRRL2773的菌种。
[0011] b、制备卷曲链霉菌菌株的发酵液 将上述种子液W体积百分比7-10%的接种量接种于发酵培养基，在发酵罐中发酵，发酵 24-56小时之间加入前体物质赖氨酸;总发酵时间120-144时间，培养溫度27-29 °C，得到 发酵液。
[0012] 其中所述发酵培养基按W下方法制得:玉米淀粉20.0-30.0克、棉巧蛋白粉0-20.0 克、黄豆饼粉0-20.0克、酵母粉0-5.0克、硫酸锭2.0-4.0克、玉米浆4.0-8.0克、憐酸二氨钟 2.0-4.0克、氯化钢1.0-2.0克、碳酸巧4.0-6.0克，加水定容至10001^，9册.5-7.0，121°(3灭 菌30min。
[0013] 本发明的进一步改进在于:所述步骤b中前体物质添加量为每升发酵液加入0.5- 2g〇
[0014] 本发明的进一步改进在于:所述步骤b中发酵罐压为0.05 ± 0.0 IMpa、通气比为1: 0.8-1.2vvm、揽拌速度为 300-400巧m。
[0015] 本发明的进一步改进在于:所述步骤b中发酵48-72小时之间加入经过灭菌后的超 顺磁性微球。
[0016] 本发明的进一步改进在于:所述超顺磁性微球粒径为5-30um，粒径分布为单分散， 表面的功能基团为簇酸基团，超顺磁性微球为经过经氨氧化钢溶液处理后的钢型结构。
[0017] 本发明的进一步改进在于:超顺磁性微球添加量为每升发酵液加入10-20g。
[0018] 所述超顺磁性微球在使用前用2-5倍(v/w)的2moL/L的化OH水溶液，静态浸泡2-4 小时后过滤，然后用去离子水洗涂至pH值至为7-8,置于密闭容器内，120°C，压力为97kPa 下，灭菌30min。发酵完成后，超顺磁性微球经外加磁场回收后用酸性水溶液洗脱吸附的卷 曲霉素。
[0019] 由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术进步是： 采用卷曲链霉菌菌株为出发菌株，在微生物发酵生产两性霉素 B的过程中，优化初始pH 值、发酵溫度及时间、接种量、培养基等条件，在卷曲霉素产物合成期，添加适量的前体物 质，在促进有效合成卷曲霉素的同时又避免了菌株中毒。还通过添加超顺磁性微球，降低产 物对产生菌的反馈抑制，从而显著提高了卷曲霉素产量。
[0020] 本发明的有益效果： 上述优选条件，所获得卷曲霉素的产量从8166 ug/ml提高到14149ug/ml，为卷曲霉素 的工业化生产提供了一种方法。本发明中通过优化配方和发酵条件，保证了批次间发酵单 位的稳定性;加入前体物质后可显著促进卷曲霉素的生物合成，与不添加前体物质相比，发 酵单位提高20%W上;添加超顺磁性微球后可吸附发酵液中的卷曲霉素，降低发酵产物对产 生菌的反馈抑制，与不添加超顺磁性微球相比，卷曲霉素产量提高24%;综合优化后，发酵单 位提高73%，提高了产能，降低了能耗及废弃物的排放。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。 下述实施例中所用的实验材料剂如无特殊说明均为工业级原料;试剂购自北京化工厂，超 顺磁性微球由苏州纳微生物科技有限公司提供。
[0022] 实施例1、化自动发酵罐发酵制备卷曲霉素 卷曲链霉菌菌株的种子液 将卷曲链霉菌菌株的斜面培养物或抱子液接种于种子培养基，26°C、220 rpm、培养72 h获得种子液； 其中所述的种子培养基按W下方法制得:薦糖20.0克、酵母粉10.0克、硫酸锭2.0克、玉 米浆2.0克、氯化钢0.5克、碳酸巧4.0克，加自来水定容至lOOOmUp册.5，121°C灭菌30min。 本发明所述卷曲霉素产生菌为编号NRRL2773的菌株。
[0023] 发酵培养基组成： 玉米淀粉60.0克、黄豆饼粉60.0克、硫酸锭12.0克、玉米浆12.0克、憐酸二氨钟12.0克、 氯化钢6.0克、碳酸巧12.0克，加自来水定容至3000血，P册.5，12 rC灭菌30min，化自动发酵 罐发酵培养。
[0024] 发酵条件:罐压0.05±0.01 Mpa、通气比为l:1.2vvm，装料量为化，种子培养7化后 接种，接种量为10%，培养溫度29°c，转速300 r/min，发酵培养开始24小时后加入赖氨酸，每 升发酵液加入〇.5g，总发酵时间120 h。
[0025] 结果见表1，在发酵过程中加入前体物质赖氨酸，发酵结束后，测定卷曲霉素的发 酵单位为9881ug/ml。
[0026] 实施例2、化自动发酵罐发酵制备卷曲霉素 卷曲链霉菌菌株的种子液 将卷曲链霉菌菌株的斜面培养物或抱子液接种于种子培养基，28°C、220 rpm、培养64 h获得种子液； 其中所述的种子培养基按W下方法制得:薦糖40.0克、酵母粉5.0克、硫酸锭3.0克、玉 米浆8.0克、氯化钢1.0克、碳酸巧3.0克，加自来水定容至1000mL，pH7.0，121°C灭菌30min。
[0027] 本发明所述卷曲霉素产生菌为菌种编号NRRL2773的菌种。
[0028] 发酵培养基组成： 玉米淀粉30.0克、棉巧蛋白粉20.0克、酵母粉5.0克、硫酸锭2.0克、玉米浆8.0克、憐酸 二氨钟2.0克、氯化钢1.0克、碳酸巧6.0克，加自来水定容至1000mL，pH7.0，121°C灭菌 30min，化自动发酵罐发酵培养。
[0029] 发酵条件:罐压0.05±0.01 Mpa、通气比为l:0.8vvm，装料量为1L，种子培养6地后 接种，接种量为8%，培养溫度29°C，转速为400 r/min，在发酵培养开始56小时加入赖氨酸， 每升发酵液加入1.5g，总发酵时间144 h。
[0030] 发酵结束后，经检测卷曲霉素的发酵单位为1135加 g