一种链霉菌发酵生产米尔贝霉素的方法及其发酵培养基的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及米尔贝霉素生产技术领域，特别涉及一种链霉菌发酵生产米尔贝霉素的方法及其发酵培养基。
【背景技术】
[0002]米尔贝霉素(Milbemycins)是由链霉菌产生的大环内酯类抗生素，包括一系列结构上非常类似的十六元环类组分。米尔贝霉素具有强烈的杀虫、杀螨、驱虫及抗肿瘤等生物学活性，大多数对农业害虫具有广谱防治活性，用于防治如蚜、螨、黄褐天幕毛虫、肠道寄生虫以及其他危害作物及家畜的寄生虫。米尔贝霉素具有作用强烈，用药量少，对人安全无毒，不污染环境，只杀害虫，不杀害虫天敌等特点。可作为防止该类药物产生抗性的复配及轮换用药，是目前最有前途的广谱高效新型无交叉抗性的生物杀虫剂。
[0003]米尔贝霉素自1967年首次被日本Sankyo公司发现，以后该公司又相继发现milbemycin A3,milbemycin A4,milbemycin 等组分。美国 American Cyanamid 公司发现了另一组分LL-28249-α (Nemadectin,尼莫克汀)。目前国际上已有多个米尔贝霉素类药品实现了商业化，被广泛地用作兽医药物或作物保护农药，有专家预测，它可以替代目前使用于作物保护的有机磷氨基甲酸酯拟除虫菊酯类及有机氯类化合物，显示出广阔的应用市场。
[0004]米尔贝厢(miIbemycinoxime)是链霉菌发酵产生的米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A 4基础上的半合成的肟衍生物，是一种新型的大环内酯类驱虫药，对体内外寄生虫均具有驱杀作用，对控制和预防大部分常见寄生虫疾病都有很好的效果。通常用来预防恶丝虫病，控制线虫、钩虫引发的犬、猫疾病及犬的鞭虫病。米尔贝肟是公认的具有广谱、高效、安全的驱虫药，特别是对一些伊维菌素敏感的犬相对更为安全。目前在国内市售的米尔贝肟相关产品有用于防犬心丝虫病的片剂“犬心安(milbemycin A )”和用于抗犬、猫耳螨的滴剂“耳螨灭(milbeMite )”等。这些都是进口药物，由瑞士诺华制药厂或日本三共株式会社生产，国内尚未开发出此类产品。
[0005]虽然米尔贝霉素系列产品具有广泛的用途和市场，但由于只有日本拥有菌种资源,全球一直只有日本Sankyo公司生产milbemycin A1^PA4原药。我国东北农业大学向文胜等也分离到了产米尔贝霉素的菌株，冰城链霉菌i^treptomyces bingchenggensis),经过菌株诱变育种改良和发酵工艺优化，米尔贝霉素的产量可达1380 μ g/mL。进一步利用基因工程技术进行菌株改造，米尔贝霉素的产量得到了大幅提高，达2312 μ g/mL(专利申请号:201310409240.2)。通过菌株改良是提高米尔贝霉素发酵效价和生产能力的有效途径。但是这样的改变途径技术难度大，成本高，耗时长，成功率低。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种改良的一种链霉菌发酵生产米尔贝霉素的方法，显著提高了米尔贝霉素的产量，简单易行，适合工业化生产。
[0007]本发明的还提供了一种链霉菌发酵生产米尔贝霉素用发酵培养基，通过培养基的改良来提高米尔贝霉素的发酵水平，显著提高了米尔贝霉素的产量，降低了生产成本。
[0008]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
一种链霉菌发酵生产米尔贝霉素的方法，所述方法包括如下步骤:
(I)斜面活化培养:取保存的菌种，接种到斜面培养基，接菌后置于28°c的培养箱中，相对湿度40-60%，培养8-9d，得到活化菌种；
(2 )种子扩大培养:从斜面培养基取种，用无菌接种环在无菌条件下从斜面培养基上刮下孢子制成孢子悬液，使其浓度为17-1O8个孢子/mL，然后取孢子悬液接种到种子培养基中，培养温度28°C，摇床转速220r/min，培养时间46_48h，得到种子液；
(3)发酵培养:将所得种子液接种至发酵培养基中，培养温度28°C，摇床转速220r/min下进行发酵培养，培养时间150-180h ；
所述发酵培养基由以下质量百分比计的原料混合制成:蔗糖12-13%，棉籽饼粉0.8-1.2%，花生饼粉0.8-1.2%，脱脂奶粉0.8-1.2%，番茄酱2-2.5%，磷酸氢二钾0.1-0.15%，大豆生物炭粉0.1-0.2%，硫酸亚铁0.01-0.015%，沸石粉0.38-0.42%，钥酸钠0.004-0.006%，硫酸铜 0.004-0.006%，碳酸钙 0.28-0.32%，水余量，pH 7.2-7.6。
[0009]本发明利用代谢工程原理和技术，对影响米尔贝霉素生物合成途径进行深入分析，以通过增加激活米尔贝霉素生物合成相关的酶(如金属离子钥酸钠、硫酸铜等添加)和尽量增加米尔贝霉素前体物(棉籽饼粉、花生饼粉等成分中可能含有米尔贝霉素生物合成所需的前体物质)等方法，找到了最佳的培养基组分的组合，显著提高了米尔贝霉素的产量。大豆生物炭粉具有较大的比表面积，更够给微生物的繁殖提供较佳的生存环境，利于链霉菌的发酵，同时，大豆生物炭粉能够提供部分发酵所需的微量元素和营养物质，从而提高了米尔贝霉素的产量。尤其是加入番茄酱、棉籽饼粉、花生饼粉、脱脂奶粉、大豆生物炭粉、沸石粉、钥酸钠、硫酸铜等成分及其含量的控制，有效提高了米尔贝霉素的效价。
[0010]作为优选，所述斜面培养基由以下质量百分比计的原料混合制成:蔗糖0.3%，脱脂奶粉0.1%，酵母抽提物0.15%，麦芽提取物0.4%，琼脂2.5%，水余量，pH 7.2±0.1。
[0011]作为优选，所述种子培养基由以下质量百分比计的原料混合制成:蔗糖1.5%，蛋白胨0.35%，酵母抽提物0.5%，脱脂奶粉0.2%，磷酸氢二钾0.05%，消沫剂GPE 0.04%，水余量，pH 7.0-7.4。
[0012]作为优选，步骤(3)中种子液接种量为发酵培养基体积的5-15%。
[0013]作为优选，所述大豆生物炭粉的制备方法为:将大豆在400-600°C低温下裂解5-10小时，冷却，粉碎至400-800目。本发明通过对大豆进行低温裂解，这样获得高比表面积的生物炭，同时，在这样低温下裂解，大豆生物炭粉中能够存在更多有利于链霉菌发酵吸收的微量元素。
[0014]一种链霉菌发酵生产米尔贝霉素用发酵培养基，所述发酵培养基由以下质量百分比计的原料混合制成:蔗糖12-13%，棉籽饼粉0.8-1.2%，花生饼粉0.8-1.2%，脱脂奶粉0.8-1.2%，番茄酱2-2.5%，磷酸氢二钾0.1-0.15%，大豆生物炭粉0.1-0.2%，硫酸亚铁0.01-0.015%,沸石粉 0.38-0.42%,钥酸钠 0.004-0.006%,硫酸铜 0.004-0.006%,碳酸钙0.28-0.32%，水余量。
[0015]作为优选，所述大豆生物炭粉的制备方法为:将大豆在400-600°C低温下裂解5-10小时，冷却，粉碎至400-800目。
[0016]作为优选，所述发酵培养基的pH控制为7.2-7.6。
[0017]本发明的有益效果是:通过培养基和发酵工艺的改良来提高米尔贝霉素的发酵水平，显著提高了米尔贝霉素的产量，降低了生产成本，简单易行，适合工业化生产。
【具体实施方式】
[0018]下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
[0019]本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0020]实施例1:
链霉菌发酵生产米尔贝霉素的方法包括如下步骤:
(I)斜面活化培养:取保存的菌种(冰城链霉菌CGMCC N0.1734)，接种到斜面培养基，接菌后置于28°C的培养箱中，相对湿度40%，培养9d，得到活化菌种。
[0021]斜面培养基由以下质量百分比计的原料混合制成:蔗糖0.3%，脱脂奶粉0.1%，酵母抽提物(市售)0.15%，麦芽提取物(市售)0.4%，琼脂2.5%，水余量，pH 7.2±0.1，121。。下灭菌20 min,制成斜面。
[0022]( 2 )种子扩大培养:从斜面培养基取种，用无菌接种环在无菌条件下从斜面培养基上刮下孢子制成孢子悬液，使其浓度为17个孢子/mL，然后取2mL孢子悬液接种到种子培养摇瓶中，种子培养摇瓶中种子培养基装液量为10mL/ 1000 mL，培养温度28°C，摇床转速220r/min,培养时间48h，得到种子液。
[0023]种子培养基由以下质量百分比计的原料混合制成:蔗糖1.5%，蛋白胨0.35%，酵母抽提物0.5%，脱脂奶粉0.2%，磷酸氢二钾0.05%,消沫剂GPE (市售)0.04%,水余量，pH7.0,121°C下灭菌 20 min。
[0024](3)发酵培养:将所得种子液接种至发酵培养基中，种子液接种量为发酵培养基体积的5%，培养温度28°C，摇床转速220r/min下进行发酵培养，培养时间180h。
[0025]发酵培养基由以下质量百分比计的原料混合制成:蔗糖12%，棉籽饼粉0.8%，花生饼粉1.2%，脱脂奶粉0.8%，番茄酱2.5%，磷酸氢二钾0.1%，大豆生物炭粉0.1%，硫酸亚铁0.01%，沸石粉0.42%，钥酸钠0.004%，硫酸铜0.006%，碳酸钙0.28%，水余量，pH 7.2，