一种纳塔霉素与o,n-羧甲基壳寡糖的接枝共聚物及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种药用和食品防腐抗菌剂纳塔霉素与O，N?羧甲基壳寡糖接枝共聚物及其制备方法。通过纳塔霉素与O，N?羧甲基壳寡糖接枝共聚，实现了抑菌剂纳塔霉素的高分子化。具有以下三方面的意义：一是提高了纳塔霉素的稳定性；二是提高了水中的溶解度；三是拓宽了抑菌范围。
【专利说明】
一种纳塔霉素与ο,N-羧甲基壳寡糖的接枝共聚物及其制备 方法
技术领域
[0001] 本发明属医药和食品添加剂领域，特别是涉及高效能医药和食品防腐抗菌剂及其 制备方法。
【背景技术】
[0002] 纳塔霉素是一种由链霉菌发酵产生的天然抗真菌化合物，属于多烯大环内酯类抗 菌剂，既可以广泛有效的抑制各种霉菌、酵母菌的生长，又能抑制真菌毒素的产生，可广泛 用于食品防腐保鲜以及抗真菌治疗。由于欧美等经济发达国家对生物防腐剂需求量的持续 增长以及国内食品产业的稳定快速发展，近年来国内外对于纳塔霉素的需求量一直在持续 增长，预计到2015年，国内的潜在需求量将有望超过660t。
[0003] 纳塔霉素依靠其内酯环结构与真菌细胞膜上的留醇化合物作用，形成抗生素-甾 醇化合物，从而破坏真菌的细胞质膜的结构。大环内脂的亲水部分(多醇部分)在膜上形成 水孔，损伤细胞膜通透性，进而引起菌内氨基酸，电解质等物质渗出，菌体死亡。当某些微生 物细胞膜上不存在留醇化合物时，纳塔霉素就对其无作用，因此纳塔霉素只对真菌产生抑 制，对细菌和病毒不产生抗菌活性。另外，纳塔霉素存在水溶性低、在高温、高酸碱度条件下 化学稳定性差等特点。
[0004] 通过纳塔霉素与0，N-羧甲基壳寡糖接枝共聚，实现了抑菌剂纳塔霉素的高分子 化。具有以下三方面的意义:一是提高了稳定性;二是提高了水中的溶解度;三是拓宽了抑 菌范围。
【发明内容】
[0005] 本发明设计制备了一种纳塔霉素作为侧链、壳寡糖作为主链的接枝聚合物。本发 明通过纳塔霉素的单糖氨基与壳寡糖酰氯基团进行酰胺化反应，将纳塔霉素接枝到〇，N_羧 甲基壳寡糖上，制备出纳塔霉素与〇，N_羧甲基壳寡糖的接枝共聚物。这种聚合物的水溶性 好于纳塔霉素，并且同时具有纳塔霉素和壳寡糖的抑菌特点。
【具体实施方式】
[0006] 实施例1
[0007] 第一步，将24.5g寡壳糖分散于70ml去离子水中，室温下搅拌溶解;称取14.5g-氯 乙酸加入30ml去离子水溶解后，室温搅拌分批加入25.2g碳酸氢钠中和，然后将中和液一次 性加入上述反应液中，搅拌，逐渐升温至70°C，于该温度下搅拌反应3小时。冷却至室温，5% 盐酸中和至PH=6-6.5,然后加入100ml无水乙醇，有深褐色粘稠状固体析出。过滤，无水乙 醇洗涤3次，干燥、称重约32.2g，保存备用。
[0008] 第二步，将步骤一中生成的〇，N-羧甲基壳寡糖16.1g分散于lOOmlNMP中，搅拌下将 10.〇g二氯亚砜逐滴加入上述反应液中，然后加热至75°C，搅拌反应5小时.继续升温至90 °C，分馏蒸去剩余的二氯亚砜，冷却至室温，加入50ml异丙醇沉淀产物，抽滤，无水乙醚洗 涤3次，干燥、称重约24.6g。
[0009] 第三步，取步骤二中的粉末产物8.8g分散于50ml去离子水中，5%氢氧化钠水溶液 调pH值至8.5-9.0之间，搅拌下，一次性加入0.68g(0.00 lmo 1)纳塔霉素，氮气保护，50 °C下 搅拌，固体逐渐溶解，反应5小时，冷却至室温。5 %盐酸中和至PH = 6.5-7.0，然后加入50ml 无水乙醇，有褐色固体粉末析出。过滤，乙醚洗涤3次，真空干燥，称重，得产物约2.2g，接枝 率为1.5%。真空避光保存。
[0010] 实施例2
[0011] 第一步，将24.5g寡壳糖分散于70ml去离子水中，室温下搅拌溶解;称取14.5g-氯 乙酸加入30ml去离子水溶解后，室温搅拌分批加入25.2g碳酸氢钠中和，然后将中和液一次 性加入上述反应液中，搅拌，逐渐升温至70°C，于该温度下搅拌反应3小时。冷却至室温，5% 盐酸中和至PH=6-6.5,然后加入100ml无水乙醇，有深褐色粘稠状固体析出。过滤，无水乙 醇洗涤3次，干燥、称重约32.2g，保存备用。
[0012]第二步，将步骤一中生成的〇，N-羧甲基壳寡糖16.1g分散于lOOmlNMP中，搅拌下将 10.〇g二氯亚砜逐滴加入上述反应液中，然后加热至75°C，搅拌反应5小时.继续升温至90 °C，分馏蒸去剩余的二氯亚砜，冷却至室温，加入50ml异丙醇沉淀产物，抽滤，无水乙醚洗涤 3次，干燥、称重约24.6g。
[0013]第三步，取步骤二中的粉末产物8.8g分散于50ml去离子水中，5%氢氧化钠水溶液 调pH值至8.5-9.0之间，搅拌下，一次性加入2.05g(0.003mol)纳塔霉素，氮气保护，50°C下 搅拌，固体逐渐溶解，反应5小时，冷却至室温。5 %盐酸中和至PH = 6.5-7.0，然后加入50ml 无水乙醇，有褐色固体粉末析出。过滤，乙醚洗涤3次，真空干燥，称重，得产物约6.5g，接枝 率为2.8%。真空避光保存。
[0014] 实施例3
[0015]第一步，将24.5g壳寡糖分散于70ml去离子水中，室温下搅拌溶解;称取14.5g-氯 乙酸加入30ml去离子水溶解后，室温搅拌分批加入25.2g碳酸氢钠中和，然后将中和液一次 性加入上述反应液中，搅拌，逐渐升温至70°C，于该温度下搅拌反应3小时。冷却至室温，5% 盐酸中和至PH=6-6.5,然后加入100ml无水乙醇，有深褐色粘稠状固体析出。过滤，无水乙 醇洗涤3次，干燥、称重约32.2g，保存备用。
[0016]第二步，将步骤一中生成的0，N-羧甲基壳寡糖16. lg分散于lOOmlNMP中，搅拌下将 10.〇g二氯亚砜逐滴加入上述反应液中，然后加热至75°C，搅拌反应5小时.继续升温至90 °C，分馏蒸去剩余的二氯亚砜，冷却至室温，加入50ml异丙醇沉淀产物，抽滤，无水乙醚洗涤 3次，干燥、称重约24.6g。
[0017]第三步，取步骤二中的粉末产物8.8g分散于50ml去离子水中，5%氢氧化钠水溶液 调pH值至8.5-9.0之间，搅拌下，一次性加入3.4g(0.005mol)纳塔霉素，氮气保护，50°C下搅 拌，固体逐渐溶解，反应5小时，冷却至室温。5 %盐酸中和至PH=6.5-7.0，然后加入50ml无 水乙醇，有褐色固体粉末析出。过滤，乙醚洗涤3次，真空干燥，称重，得产物约10.7g，接枝率 为4.9 %。真空避光保存。
[0018] 实施例4
[0019]第一步，将24.5g壳寡糖分散于70ml去离子水中，室温下搅拌溶解;称取14.5g-氯 乙酸加入30ml去离子水溶解后，室温搅拌分批加入25.2g碳酸氢钠中和，然后将中和液一次 性加入上述反应液中，搅拌，逐渐升温至70°C，于该温度下搅拌反应3小时。冷却至室温，5% 盐酸中和至PH=6-6.5,然后加入100ml无水乙醇，有深褐色粘稠状固体析出。过滤，无水乙 醇洗涤3次，干燥、称重约32.2g，保存备用。
[0020] 第二步，将步骤一中生成的〇，N-羧甲基壳寡糖16.1g分散于lOOmlNMP中，搅拌下将 10.〇g二氯亚砜逐滴加入上述反应液中，然后加热至75°C，搅拌反应5小时.继续升温至90 °C，分馏蒸去剩余的二氯亚砜，冷却至室温，加入50ml异丙醇沉淀产物，抽滤，无水乙醚洗涤 3次，干燥、称重约24.6g。
[0021] 第三步，取步骤二中的粉末产物8.8g分散于50ml去离子水中，5%氢氧化钠水溶液 调pH值至8.5-9.0之间，搅拌下，一次性加入4.75g(0.007mol)纳塔霉素，氮气保护，50°C下 搅拌，固体逐渐溶解，反应5小时，冷却至室温。5 %盐酸中和至PH = 6.5-7.0，然后加入50ml 无水乙醇，有褐色固体粉末析出。过滤，乙醚洗涤3次，真空干燥，称重，得产物约14.9g，接枝 率为6.7 %。真空避光保存。
[0022] 实施例5
[0023]准确称取l.Og实施例1、2、3和4的第一步中制备的0，N-羧甲基壳寡糖固体粉末溶 解于50ml去离子水中。然后于室温下用O.lmol/L的NaOH水溶液滴定pH值至7.0,计算中和 1.0g0，N-羧甲基壳寡糖所需的NaOH摩尔数，从而计算出1.0g0，N-羧甲基壳寡糖中羧基的总 摩尔数，计为A;同时分别准确称取1.0g实施例1、2、3和4的第三步中制备的纳塔霉素与0，N-羧甲基壳寡糖的接枝共聚物固体粉末溶解于50ml去离子水中。然后于室温下分别用 0. lmol/L的NaOH水溶液滴定pH值至7.0，分别计算中和1.0g实施例1、2、3和4中纳塔霉素与 0，N-羧甲基壳寡糖的接枝共聚物所需的NaOH摩尔数，从而计算出1.0g纳塔霉素与0，N-羧甲 基壳寡糖接枝共聚物中没有参与反应的羧基和酰氯的总摩尔数，计为B。其中0，N-羧甲基壳 寡糖的平均分子量为2770(平均聚合度为6)，纳塔霉素的分子量为665.7,设每摩尔0，N-羧 甲基壳寡糖分子中有X摩尔的纳塔霉素通过羧基或酰氯接枝，则纳塔霉素与〇，N-羧甲基壳 寡糖的接枝共聚物的平均分子量为：
[0024] 2270+(665.7-17)X
[0025] 那么 X:
[0026] 2270A-( 2270+648.7X)B=X
[0027] X = 2270X (A_B)/( 1+648 ·7Β)
[0028] 可以计算纳塔霉素的接枝率：
[0029] X/20 [0030] 结果见表1
[0031]表1.实施例1~4的纳塔霉素接枝率
[0032]
[0033] 实施例5
[0034] 取实施例1，2,3和4中制备的不同纳塔霉素接枝率的0，N-羧甲基壳寡糖溶解于去 离子水中，于25°C测定其不同浓度水溶液的粘度。结果见表2。
[0035]表2 ·不同接枝率产物的溶液粘度(mPa · S，25°C)
[0036]
[0037] 实施例6
[0038] 分别用接枝率为2.8%、4.9%和6.7 %的产物对几种典型霉菌、酵母、细菌等做抑 菌实验。试验方法如下：将培养基分成A、B两组，A碟中不添加抑菌剂做对照，B中加入50mg/ kg的抑菌剂，然后在A、B碟中分别接入菌株，放入培养箱培养，3d后观察结果，见表3。上述结 果表明，产物除了对霉菌、酵母有抑杀作用外，对细菌亦有抑菌活性。
[0039]表3.不同接枝率产物的抑菌谱(25°C)
[0040]
[0041 ] 实施例7
[0042] 分别用接枝率为4.9%和6.7%的产物对几种典型霉菌、酵母、细菌等做抑菌实验， 测定其有效抑菌浓度。试验方法如下:将培养基分成多份，分别加入不同量的的抑菌剂，然 后分别接入菌株，放入培养箱培养，3d后观察结果，结果见表4、5。
[0043] 表4.接枝率为4.9%产物的有效抑菌浓度(25°C)
[0044]
[0045] 表5.接枝率为6.7 %产物的有效抑菌浓度(25°C)
[0046]
[0047] 实施例8
[0048] 将浓度为0.1 %的、接枝率为4.9%的产物水溶液置于密封罐中，分别于90°C、120 °C、150°C温度下老化48h后。按实施例7同样方法测定其抑菌活性。结果见表6、7、8。浓度为 〇. 1 %的、接枝率为4.9 %的产物于90°C温度下老化48h后，其抑菌能力没有降低；120°C温度 下老化48h后，其抑菌能力仍然没有降低；150°C温度下老化48h后其抑菌能力有所降低，但 使用浓度大于30mg/kg的情况下，对六种菌株仍然具有抑菌能力。
[0049]表6.接枝率为4.9%产物90°C老化48h的有效抑菌浓度(25°C)
[0050]
[0051 ] 表7.接枝率为4.9%产物120°C老化48h的有效抑菌浓度(25°C)
[0052]
[0053] 表8.接枝率为4.9%产物150°C老化48h的有效抑菌浓度(25°C)
[0054]
【主权项】
1. 一种纳塔霉素与〇，N-羧甲基壳寡糖的接枝共聚物，其特征在于结构可用如下通式表 示：式中m+n = 2~20。2. 权利要求1所述的一种纳塔霉素与O，N-羧甲基壳寡糖接枝共聚物的制备方法，其特 征在于按如下步骤实施： 第一步，将24.5g寡壳糖分散于70ml去离子水中，室温下搅拌溶解;称取14.5g-氯乙酸 加入30ml去离子水溶解后，室温搅拌分批加入25.2g碳酸氢钠中和，然后将中和液一次性加 入上述反应液中，搅拌，逐渐升温至70°C，于该温度下搅拌反应3小时。冷却至室温，用5%盐 酸中和至PH = 6-6.5，然后加入100mL无水乙醇，有深褐色粘稠状固体析出。过滤，无水乙醇 洗涤3次，干燥、称重约32.2g，保存备用。 第二步，将步骤一中生成的〇，N-羧甲基壳寡糖16. Ig分散于100mL匪P中，搅拌下将 10.Og二氯亚砜逐滴加入上述反应液中，然后加热至75°C，搅拌反应5小时.继续升温至90 °C，分馏蒸去剩余的二氯亚砜，冷却至室温，加入50ml异丙醇沉淀产物，抽滤，无水乙醚洗涤 3次，干燥、称重约24.6g。 第三步，取步骤二中的粉末产物8.8g分散于50ml去离子水中，5%氢氧化钠水溶液调pH 值至8.5-9.0之间，搅拌下，一次性加入0.68~4.75g(0.001~0.007mol)纳塔霉素，氮气保 护，50 °C下搅拌，固体逐渐溶解，反应5小时，冷却至室温。5 %盐酸中和至PH=6.5-7.0，然后 加入50ml无水乙醇，有褐色固体粉末析出。过滤，乙醚洗涤3次，真空干燥，称重，得产物约 2.2~14.9g，真空避光保存。
【文档编号】A61P31/10GK106008746SQ201610307777
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月4日
【发明人】麻金海, 孔淑玲
【申请人】青岛大学