一类羧甲基赖氨酸消除剂及其应用
【专利摘要】本发明公开了一类羧甲基赖氨酸消除剂及应用，所述消除剂为含有邻苯二酚或邻苯三酚结构单元的多酚氧化形成的醌类物质。所述消除剂在降低食品体系羧甲基赖氨酸含量方面的应用。本发明所述醌类物质对pH呈中性或碱性的食品体系中AGEs的消除能力更强，且其在食品体系生成CML后添加或在未生成CML时添加均能有效降低体系CML水平。
【专利说明】
-类錢甲基赖氨酸消除剂及其应用
技术领域
[0001] 本发明设及食品加工领域，具体设及一类簇甲基赖氨酸(CML)消除制剂，可W通过 捕获CML降低食品体系中已经生成的CML的含量，作为食品添加剂而广泛利用。
【背景技术】
[0002] 晚期糖化终末产物(AGES)是由食品或生物体在美拉德反应晚期所产生的一类高 度氧化的化合物。现有研究表明，AGES可能与糖尿病、慢性屯、力衰竭、动脉粥样硬化等疾病 的产生与发展相关。食源性AGES经由消化道吸收进入人体，将提升人体AGES水平。长期摄入 超量的食源性AGES，特别是游离态AGES (糖化氨基酸），将对人体造成潜在健康危害。
[0003] 现有减少AGES含量的手段主要为抑制AGES的生成：1)抗氧化剂，能清除体系自由 基，抑制由自由基介导的Amadori产物向AGES转化的过程，如:Ve、芦下、阿魏酸、Vc、搬皮素、 肌肤等;2)二幾基化合物捕获剂，能捕获AGES形成的中间产物乙二醒进而抑制AGES的形成， 如:氨基脈(AG)、化唉胺(Vb6)等;3)氨基竞争剂，其分子结构中含有氨基可W与赖氨酸上的 氨基竞争发生美拉德反应，进而抑制AGES的生成，如:Vbi及其衍生物(硫胺素单憐酸醋、硫胺 素焦憐酸盐)等。
[0004] W典型AGES簇甲基赖氨酸(CMU为例，现有抑制剂降低体系CML含量的可能路径如 图1所示，均为对形成CML的部分路径的抑制，因此需在体系形成CML前添加抑制剂才能达到 降低CML水平的效果。实际生产中，在抑制剂添加前食品体系往往已经含有一定水平的 AGES，且现有抑制剂无法完全抑制体系AGES的产生(抑制率约为10 %-50% )，然而，对于食 品体系中已存在的AGES，现有手段将无法消除。
[0005] 现在还没有专口针对食品中已有AGES消除的研究，也没有将AGES消除剂应用到食 品加工中的报道。
【发明内容】
[0006] 为解决上述问题，本发明的目的在于提供一类CML消除剂，具体设及含邻苯二酪或 邻苯Ξ酪结构的多酪氧化形成的酿类物质对模拟食品体系中CML的消除作用。消除剂可通 过在一定条件下捕获体系已有CML进而达到CML消除的目的，其捕获原理如图2所示。
[0007] 本发明的目的通过W下技术方案实现：
[0008] -类簇甲基赖氨酸消除剂，所述消除剂为含有邻苯二酪或邻苯Ξ酪结构单元的多 酪氧化形成的酿类物质。
[0009] 所述多酪包括4-甲基邻苯二酪、表儿茶素、表儿茶素没食子酸醋、咖啡酸、搬皮素、 表没食子儿茶素没食子酸醋、表赔儿茶素、木禪草素、芦下。
[0010] 所述消除剂在降低食品体系簇甲基赖氨酸含量方面的应用。
[0011] 在食品体系中添加所述消除剂，控制体系的抑>7。优选地，所述体系的抑为8。
[0012] 所述体系的反应溫度为25-100°C。
[0013] 所述消除剂的添加量为体系赖氨酸含量的2-3%。
[0014] 所述消除剂在食品体系未生成或已经生成CML后添加均可。
[0015] 其中所述食品体系包括乳制品、粮食及其制品、调味品、肉及其制品、値头制品。
[0016] 本发明在模拟食品体系（葡萄糖-赖氨酸体系）中，利用液相色谱串联质谱法化C- MS/MS)对含有邻苯二酪或邻苯Ξ酪结构单元的多酪所形成的酿类物质与CML的加和物进行 了鉴定。根据所形成的酿类物质的稳定性可分为:稳定酿类物质和易聚合酿类物质两类。
[0017] 所述稳定酿类物质与CML加和产物鉴定的具体步骤为：
[001引（1)用0.2M的憐酸盐缓冲液(pH 7.0)配制CML为1 OmM、酿类物质为ImM的溶液；
[0019] (2)将上述混合液体在室溫下揽拌Imin，经过0.22μπι微滤膜处理，使用LC-ESI-MS/ MS对加和物进行结构鉴定。
[0020] 所述LC机型为HP 1100,检测条件为：
[0021] 色谱柱:ZIC-HILIC色谱柱2.1 X 150mm，3.5皿
[0022] 柱溫：25°C
[0023] 流动相：A :乙酸锭水溶液（6.5mM) /乙腊（10 : 90，pH 5.5) ; B :乙酸锭水溶液 (6.5mM)/乙腊(40:60袖5.5);梯度洗脱
[0024] 流速:0.1mL/min
[0025] 进样量
[0026] 所述ESI-MS/MS机型为HP 1100,检测条件为：
[0027] 离子源:ESr
[002引干燥气体溫度:200°C [00巧]雾化气压：5化si
[0030] 二级碎裂电压：1.00V
[0031] 扫描范围：m/z 50-750
[0032] 所述稳定酿类物质捕获CML能力考查的具体步骤如下：
[0033] (1)用0.2M憐酸盐缓冲液(pH 4.5)配制酿类溶液，使其浓度为0.08mM;
[0034] (2)用0.2M的憐酸盐缓冲液配制CML为1-lOmM的溶液；
[OO%] (3)上述（1)和(2)溶液在stopped-f low混合室等体积混合后，抑为5.0、7.0或8.0;
[0036] (4)使用Stopped-flow，通过监测25°C时反应体系在紫外-可见光区的吸光度变化 (200-750nm)，测定4MBQ与CML的反应动力学。
[0037] 所述易聚合酿类物质与CML加和产物鉴定的具体步骤为：
[003引（1)用0.2M的憐酸盐缓冲液（pH 8.0)配制赖氨酸（Lys)为0.1M、葡萄糖（Glu)为 0.1M的溶液来模拟食品体系；
[0039] (2)向（1)所述模拟食品体系中添加2~3%的含邻苯二酪或邻苯Ξ酪结构的多酪 氧化形成的酿；
[0040] (3)将样本于80°C或100°C水浴加热化；
[0041 ] (4)取ImL加热后样本，加蒸馈水定容至5ιΛ;
[0042] (5)取1血稀释液经0.22皿微滤膜处理，使用UPLC-ESI-MS/MS对加和物进行结构鉴 定。
[0043] 所述UPLC采用Agilent SB1290机型，检测条件为：
[0044] 色谱柱:Agilent SB-打8色谱柱2. IX50mm，1.祉m
[0045] 柱溫：25 °C
[0046] 流动相:A)甲酸:水=1:1000(v:v)，B)乙腊
[0047] 梯度洗脱程序:0min(85%A)-4min(15%A)-8min(15%A)-10min(85%A);
[004 引流速:0.2mL/min
[0049] 进样量:5化；
[0050] 质谱采用机型为maxis Impact,检测条件为：
[0051] 离子源:ESr/ESr;
[0化2] 毛细管电压:3.5kV
[0化3] 充电电压:2kV [0054] 干燥气体溫度：18(TC
[0化5] 喷雾器压力：0.3bar
[0化6] 质荷比扫描范围:m/z50-1000
[0057] 本发明是通过邻苯二酪氧化形成邻苯二酿，然后邻苯二酿可W直接与CML反应从 而达到体系内已有CML消除的目的。本发明采用LC-ESI-MS/MS鉴定了酿类与CML的加和产 物。结果证实，含有邻苯二酪或邻苯Ξ酪结构的多酪氧化形成的酿类物质对模拟食品体系 中的CML具有捕获作用。
[0058] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0059] (1)含有邻苯二酪或邻苯Ξ酪结构的多酪是一类天然无毒副作用的物质，其中，表 儿茶素、表儿茶素没食子酸醋、表没食子儿茶素没食子酸醋和表赔儿茶素是中华人民共和 国国家标准GB2760-2014中允许使用的添加剂茶多酪的主要成分;咖啡酸作为葡萄巧提取 物主要成分之一，被FDA认定为一般公认的安全类添加剂(GRAS);芦下和搬皮素作为相橘提 取物主要成分，4-甲基邻苯二酪作为海狸香提取物的主要成分，同样被FDA认定为一般公认 的安全类添加剂(GRAS);上述物质氧化形成的酿类物质对体系已经生成的AGES有良好的消 除作用，弥补了 AGES抑制剂对体系已存在AGES无作用的缺陷。
[0060] (2)本发明所述酿类物质对pH呈中性或碱性的食品体系中AGES的消除能力更强。
[0061] (3)本发明所述酿类物质在食品体系生成CML后添加（见实施例1)或在未生成CML 时添加(见实施例2-4)均能有效降低体系CML水平。
【附图说明】
[0062] 图1为抑制剂抑制CML形成的可能路径图。
[0063] 图2为酿类物质与CML反应的路径图。
[0064] 图3为4-甲基邻苯二酿(4MBQ)与CML加和物的a)-级质谱图、b)二级质谱图及可能 结构与断裂方式。
[0065] 图4为E翊屋类与CML加和物(80°C加热化)的a) -级质谱图、b)二级质谱图。
[0066] 图5为图4所述加和物的可能分子结构式及断裂方式。
[0067] 图6为EC酿类与CML加和物（ΙΟΟΓ加热化）的a)-级质谱图、b)二级质谱图及可能 结构与断裂方式。
[006引图7为EGCG酿类与CML加和物（10(TC加热化)的a)-级质谱图、b)二级质谱图。
[0069]图8为图7所述加和物的可能分子结构式及断裂方式。
【具体实施方式】
[0070] 下面结合具体实施例做详细说明。
[0071] 实施例1
[0072] 对4-甲基邻苯二酿(4MBQ)捕获CML能力鉴定及加和产物结构鉴定，具体包括如下 步骤：
[0073] (1)使用0.2M憐酸盐缓冲液(pH 4.5)配制4MBQ溶液，使其浓度为0.08mM;
[0074] (2)用0.2M的憐酸盐缓冲液配制CML为1-lOmM的溶液，使与上述（1)溶液等体积混 合后，抑为5.0、7.0或8.0;
[00巧](3)使用Stopped-flow，通过监测25°C时反应体系在紫外-可见光区（200-750nm) 的吸光度变化，测定4MBQ与CML的反应动力学；
[0076] (4)用0.2M的憐酸盐缓冲液(pH 7.0)配制CML为1 OmM、4MBQ为ImM的溶液；
[0077] (5)将(4)所述混合液体在室溫下揽拌Imin，经过0.22WI1微滤膜处理，制得待测液；
[0078] 最后使用LC-ESI-MS/MS采用下述检测条件对制得的待测样品进行检测。
[00巧]所述LC机型为HP 1100,检测条件为：
[0080]色谱柱:ZIC-HILIC色谱柱2.1 X 150mm，3.5皿 [00川柱溫：25°c
[0082] 流动相：A :乙酸锭水溶液（6.5mM) /乙腊（10 : 90，pH 5.5) ; B :乙酸锭水溶液 (6.5mM)/乙腊(40:60袖5.5);梯度洗脱
[0083] 流速:0.1mL/min
[0084] 进样量
[0085] 所述ESI-MS/MS机型为HP 1100,检测条件为：
[0086] 离子源:ESr
[0087] 干燥气体溫度:200°C
[0088] 雾化气压：5化si
[0089] 二级碎裂电压:1.00V
[0090] 扫描范围：m/z 50-750。
[0091] 使用上述Stopped-flow得到，4MBQ对CML捕获作用的表观动力学常数化。bs)及二级 动力学常数化2)如表1所示，表明在抑>7时，4MBQ对体系中CML的捕获能力强。当CML为5mM, 4MBQ为ImM时，pH 8.0,25°(：下4]\?9于5分钟内可捕获体系内~36%的〔11^，口职.0,25°(：下 4MBQ于5分钟内可捕获体系内~14%的CML。
[0092] 表l:25°C，pH 5、7、8下，4MBQ与CML反应的表观动力学常数化。bs)、二级动力学常数 化2)
[OOM]使用上述LC-ESI-MS/MS，采用上述检测条件对上述待测液进行检测，得到捕获产 物的一级质谱（图3a)及二级质谱图（图3b)，由此可推出反应产物的结构图及可能的断裂方 式，如图3b所示。
[0096] 实施例2
[0097] 对表儿茶素化C)酿类捕获CML加和产物的结构鉴定，具体包括如下步骤：
[0098] (1)用0.2M的憐酸盐缓冲液(pH 8.0)分别配制赖氨酸化ys)为0.1M、葡萄糖(Glu) 为0.1M的溶液来模拟食品体系；
[0099] (2)取ImL(l)所述的模拟食品体系，添加2mM的E翊屋；
[0100] (3)将样本于80°C水浴加热化；
[0101] (4)取ImL加热后样本，加蒸馈水定容至5ιΛ;
[0102] (5)取1血稀释液经0.22皿微滤膜处理，使用UPLC-ESI-MS/MS对加和物进行结构鉴 定。
[0103] 所述UPLC采用Agilent SB1290机型，检测条件为：
[0104]色谱柱:Agilent SB-打8色谱柱2. IX50mm，1.祉m [0105]柱溫：25°C
[0106] 流动相:A)甲酸:水=1:1000(v:v)，B)乙腊
[0107] 梯度洗脱程序:0min(85%A)-4min(15%A)-8min(15%A)-10min(85%A);
[010 引 流速:0.2mL/min
[0109] 进样量:5化；
[0110] 质谱采用机型为maxis Impact,检测条件为：
[0111] 离子源:ESr/ESr;
[0112] 毛细管电压:3.5kV
[0113] 充电电压:2kV
[0114] 干燥气体溫度：180°C
[0115] 喷雾器压力：0.3bar
[0116] 质荷比扫描范围:m/z 50-1000
[0117] 使用上述UPLC-ESI-MS/MS，采用上述检测条件对上述样本进行检测，得到EC酿类 与CML加和物的一级质谱（图4a)及二级质谱图（图4b)，可推出反应产物的结构图及可能的 断裂方式，如图5所示。说明E翊屋类与CML反应形成新的物质，从而消除CML。
[011引实施例3
[0119] 对表儿茶素化C)酿类捕获CML加和产物的结构鉴定，具体包括如下步骤：
[0120] (1)用0.2M的憐酸盐缓冲液(pH 8.0)分别配制赖氨酸化ys)为0.1M、葡萄糖(Glu) 为0.1M的溶液来模拟食品体系；
[0121] (2)取ImL(l)所述的模拟食品体系，添加2mM的E翊屋；
[0122] (3)将样本于100°C水浴加热化；
[0123] (4)取ImL加热后样本，加蒸馈水定容至5ιΛ;
[0124] (5)取1血稀释液经0.22皿微滤膜处理，使用1]?1(：斗51-15/^5对加和物进行结构鉴 定。
[0125] 所述UPLC采用Agilent SB1290机型，检测条件为：
[0126] 色谱柱:Agilent SB-打8色谱柱2. IX50mm，1.祉m
[0127] 柱溫：25°C
[012引流动相:A)甲酸:水=1:1000(乂:乂），8)乙腊
[0129] 梯度洗脱程序:0min(85%A)-4min(15%A)-8min(15%A)-10min(85%A);
[0130] 流速:0.2mL/min
[0131] 进样量:5化；
[0132] 质谱采用机型为maxis Impact,检测条件为：
[0133] 离子源:Esr/Esr;
[0134] 毛细管电压:3.5kV
[0135] 充电电压:2kV
[0136] 干燥气体溫度：180°C
[0137] 喷雾器压力:0.3bar
[0138] 质荷比扫描范围:m/z 50-1000
[0139] 使用上述UPLC-ESI-MS/MS，采用上述检测条件对上述样本进行检测，得到EC酿类 与CML加和物的一级质谱（图6a)及二级质谱图（图化），由此可推出反应产物的结构图及可 能的断裂方式，如图化所示。
[0140] 实施例4
[0141] 对表没食子儿茶素没食子酸醋化GCG)酿类捕获CML加和产物的结构鉴定，具体包 括如下步骤：
[0142] (1)用0.2M的憐酸盐缓冲液（pH 8.0)配制赖氨酸化ys)为0.1M、葡萄糖（Glu)为 0.1M的溶液来模拟食品体系；
[0143] (2)取lmL( 1)所述的模拟食品体系，添加3mM的EGCG酿；
[0144] (3)将样本于80°C水浴加热化；
[0145] (4)取ImL加热后样本，加蒸馈水定容至5ιΛ;
[0146] (5)取1血稀释液经0.22皿微滤膜处理，使用UPLC-ESI-MS/MS对加和物进行结构鉴 定。
[0147] 所述UPLC采用Agilent SB1290机型，检测条件为：
[014引 色谱柱:Agilent SB-打8色谱柱2. IX50mm，1.祉m
[0149] 柱溫：25°C
[0150] 流动相:A)甲酸:水=1:1000(v:v)，B)乙腊
[0151] 梯度洗脱程序：0min(85%A)-4min(15%A)-8min(15%A)-10min(85%A);
[0152] 流速:〇.2mL/min
[0153] 进样量：5化；
[0154] 质谱采用机型为maxis Impact,检测条件为：
[0155] 离子源:Esr/Esr;
[0156] 毛细管电压:3.5kV
[0157] 充电电压:2kV
[0158] 干燥气体溫度：18(TC
[0159] 喷雾器压力:0.3bar
[0160] 质荷比扫描范围:m/z 50-1000。
[0161] 使用上述UPLC-ESI-MS/MS,采用上述检测条件对上述样本进行检测，得到EGCG酿 类与CML加和物的一级质谱（图7a)及二级质谱图（图7b)，由此可推出反应产物的结构图及 可能的断裂方式，如图8所示。
【主权项】
1. 一类羧甲基赖氨酸消除剂，其特征在于，所述消除剂为含有邻苯二酚或邻苯三酚结 构单元的多酚氧化形成的醌类物质。2. 根据权利要求1所述的消除剂，其特征在于，所述多酚包括4-甲基邻苯二酚、表儿茶 素、表儿茶素没食子酸酯、咖啡酸、槲皮素、表没食子儿茶素没食子酸酯、表焙儿茶素、木樨 草素、芦丁。3. 权利要求1或2所述消除剂在降低食品体系羧甲基赖氨酸含量方面的应用。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在食品体系中添加所述消除剂，控制体系 的pH多7。5. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述体系的pH为8。6. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述体系的反应温度为25-KKTC。7. 根据权利要求3或4或5或6所述的应用，其特征在于，所述消除剂的添加量为体系赖 氨酸含量的2-3 %。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述消除剂在食品体系未生成或已经生成 CML后添加。9. 根据权利要求3或4或5或6所述的应用，其特征在于，所述食品体系包括乳制品、粮食 及其制品、调味品、肉及其制品、罐头制品。
【文档编号】A23L5/20GK105918772SQ201610375742
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月30日
【发明人】李琳, 李玉婷, 李冰, 梁毅, 张霞, 梁志理, 苏健裕, 徐振波
【申请人】华南理工大学, 广东中轻枫泰生化科技有限公司