一种羧甲基赖氨酸的检测方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种羧甲基赖氨酸(CML)的检测方法，其特征是结合HILIC亲水作用色谱柱在较高有机相比例下对强极性CML的分离，采用高效液相色谱-串联质谱法测定食品中CML含量。粉碎的食品经硼氢化钠还原、盐酸水解后，过MCX阳离子交换小柱萃取净化，样品溶液在HILIC色谱柱中以甲醇-水(均含2mM乙酸铵和0.1％甲酸)为流动相进行梯度洗脱，CML与样品基质分离。选用电喷雾离子源，正离子扫描，多反应监测模式，进行串联质谱分析。以D4-CML为内标物定量分析，分析时间为12min。CML在保留时间3.47min处具有吸收峰。此种新的检测方法灵敏度高、准确度高、精密度好，无需对样品进行衍生化，简化了样品前处理、缩短了检测时间、节省了检测成本。
【专利说明】一种羧甲基赖氨酸的检测方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及食品中羧甲基赖氨酸的检测【技术领域】，确切地说是一种结合HILIC亲水作用液相色谱柱对羧甲基赖氨酸的分离、利用高效液相色谱-串联质谱技术检测食品中的羧甲基赖氨酸的方法。
【背景技术】
[0002]多年来，利用美拉德反应赋予食物以诱人的色泽和风味的烹调方法一直倍受推崇。然而，近几年越来越多的研究表明一些美拉德反应产物对人体有害，其中已有研究证明食源性晚期糖基化终末产物(AGEs)与人类糖尿病、尿毒症、动脉粥样硬化和衰老等疾病的发生关系密切。羧甲基赖氨酸(CML)是食品中含量较高、发现较早的一种AGEs，通常被用作食品中AGEs检出的标志性物质。国内外已有越来越多的学者致力于食品中CML检测方法的研究。
[0003]目前对于食品中的CML还没有一种公认的标准检测方法，已报道的检测方法主要有:酶联免疫法(ELISA)、高效液相色谱荧光检测法(HPLC-FID)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)和液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS / MS)。因CML极性极强，现有的HPLC-MS /MS法多数使用C18柱结合离子对试剂进行分离，对色谱柱和质谱离子源造成损害，缩短仪器的使用寿命。鉴于现有的食品中CML检测方法存在特异性抗体选择困难、样品处理复杂、准确度不高等问题，研究开发一种操作简单、准确、快速的检测新方法对于改善现有烹调方式、控制食源性CML的摄入量、促进人类健康饮食具有重要意义。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题之一在于针对现有CML的检测方法所存在的不足而提供一种新的CML的检测方法。
[0005]本发明所要解决的技术问题之二在于该检测方法在食品中的应用。
H2+
HOOC、COOH
[0006]作为本发明第一方面的一种CML (结构式
【权利要求】
1.一种羧甲基赖氨酸(CML)的检测方法，其特征在于包括如下步骤: 称取一定质量的待测样品，任选的包括样品粉碎的步骤； 样品在硼酸钠缓冲溶液中经硼氢化钠还原；然后用体积比为1-3:1三氯甲烷去除脂肪并沉淀蛋白质；沉淀物经盐酸水解后，添加一定量的氘代羧甲基赖氨酸(D4-CML)，过MCX阳离子交换小柱萃取净化；萃取液经氮吹浓缩后重新溶解在一定体积的体积比为3-5:1甲醇-水溶液中，得到待测液； 待测液在HILIC色谱柱中以含l-3mM乙酸铵和0.05-015%甲酸的甲醇(A)-水(B)为流动相进行梯度洗脱，D4-CML和CML通过洗脱与样品基质分离；梯度洗脱参数为O?3min，80%?50% A ;3 ?6min，50% A ；6.lmin,80% A ;6.I ?12min，80% A ； 选用电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描，多反应监测模式(MRM)，进行对所分离的洗脱样品进行串联质谱分析，测定质谱图中CML特征峰与相对应的D4-CML的特征峰的高度之t匕，通过高度之比和所加入的D4-CML的量计算待测样品中CML的浓度。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于待测样品为奶粉、油条或薯条。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述的流动相为含2mM乙酸铵和0.1 %甲酸溶液的甲醇-水混合溶液，D4-CML和CML的吸收峰位于3.2-3.6min。
4.权利要求1-3任意一项所述的检测方法的应用，其特征在于，是用以检测食品中的羧甲基赖氨酸含量。
【文档编号】G01N30/88GK103616466SQ201310607487
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月27日 优先权日:2013年11月27日
【发明者】黄轶群, 赖克强, 孙晓华, 牛丽红, 王靖 申请人:上海海洋大学