水稻组蛋白赖氨酸修饰识别蛋白及其编码基因与应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物基因工程【技术领域】，具体为一种水稻组蛋白赖氨酸修饰识别蛋白及其编码基因与应用。该识别蛋白是下述氨基酸残基序列之一：1）序列表中的SEQ ID No：1；2）将序列表中的SEQ ID No:1的氨基酸残基序列经过一至五十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且对植物的生长发育具有调控作用的蛋白质。本发明还包括含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系和工程菌以及扩增该基因中任一片段的引物对。该水稻组蛋白赖氨酸修饰识别蛋白的编码基因的反义转基因株系生长矮小。本发明为植物品种改良提供了一个优质基因，具有较高的实际应用价值，应用前景广阔。
【专利说明】水稻组蛋白赖氨酸修饰识别蛋白及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物基因工程【技术领域】，具体涉及一种与水稻表观遗传学调控相关的组蛋白赖氨酸修饰识别蛋白及其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002]组蛋白赖氨酸修饰是一种重要的表观遗传学修饰，这种修饰强烈的影响着染色质的结构。不同的甲基化修饰密码与不同的转录状态相关(激活/抑制)。一般认为，组蛋白H3 N末端第9、27位赖氨酸(H3K9和H3K27)、组蛋白H4 N末端第20位赖氨酸(H4K20)与转录抑制相关，组蛋白H3 N末端第4和36位赖氨酸(H3K4和H3K36)与转录激活相关。这些组蛋白甲基化修饰通过影响基因表达的可变性，最终影响植物发育的各个方面。
[0003]在植物中已经鉴定到了许多负责甲基化修饰建立的酶，这其中H3K4和H3K36甲基化修饰在植物生长发育过程中起着至关重要的作用。SDG2是主效的H3K4甲基转移酶，於突变体表现出植株矮小、纯合不育、雌雄配子体发育异常等多效性的表型(Berr, A, McCallum, E.J, Menard, R, Meyer, D, Fuchs, J, Dong, A.and Shen,ff-H.Arabidopsis SET DOMAIN GROUP2 is required for H3K4 trimethylat1n andis crucial for both sporophyte and gametophyte development.Plant Cell, 22,3232-3248.)。而 SDG8 是主效的 H3K36 甲基转移酶(Zhao Z, Yu Y, Meyer D, ffu C, andShen ff-H.Prevent1n of early flowering by express1n of FLOWERING LOCUS Crequires methylat1n of histone H3 K36.Nat Cell B1l, 2005, 7, 1156-1160.XSDG8特异性地催化H3K36的双甲基化和三甲基化，sdg8突变体表现出早花植株明显变小，育性下降等表型。Microarray的分析进一步显示SDG8可能在转录调节、信号转导、体内代谢等多种生理途径中发挥功能(Xu L, Zhao Z, Dong A, Soubigou-Taconnat L, RenouJP, Steinmetz A, and Shen ff-H.D1- and tr1- but not monomethylat1n on histoneH3 lysine 36 marks active transcript1n of genes involved in flowering timeregulat1n and other processes in Arabidopsis thaliana.Mol Cell B1l, 2008,28，1348-1360.)。
[0004]尽管已经鉴定得到了许多建立甲基化修饰的蛋白，但是，这些甲基化修饰发挥功能的分子机制还是阐述得不是十分清楚。推测这种被修饰过的组蛋白残基会作为一种信号分子整合不同的作用因子，最终发挥生物学功能。最近的研究发现一系列被称为reader的蛋白可以识别不同的赖氨酸修饰残基。最近我们实验室报道了拟南芥中的Morf RelatedGene (MRG)蛋白作为H3K4和H3K6的识别蛋白，可以通过和C0蛋白结合调控开花基因/T的表达，从而控制拟南芥开花时间(Bu, Z, Yu, Y, Li, Z, Liu, Y, Jiang, ff., Huang, Y.and Dong, A.ff.Regulat1n of Arabidopsis flowering by the histone mark readersMRG1/2 via interact1n with C0NSTANS to modulate FT express1n.PLoS Genet, 10,el004617.)。
[0005]与双子叶植物拟南芥不同，水稻是单子叶植物的模式生物。双子叶和单子叶植物，虽然可能基因间具有比较高的保守性，但它们的生长发育的调控机制可能存在很大差异。例如，水稻是典型的短日照植物，而拟南芥则是典型的长日照植物。水稻中组蛋白H3K36甲基化修饰的识别蛋白研究目前是一片空白。而研究水稻的价值，不仅在于它巨大的经济价值，还在于它是研究同为单子叶禾本科植物玉米、小麦、高粱等其他作物的理想模型。可以为我国的水稻分子育种提供理论基础和种质资源。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一个来源于水稻的组蛋白赖氨酸修饰识别蛋白及其编码基因与应用
本发明所提供的组蛋白赖氨酸修饰识别蛋白，名称为MRG702，来源于水稻sativa ssp.japonica),是下述氨基酸残基序列之一:
1)序列表中的SEQID No:l;
2)将序列表中的SEQID No: 1的氨基酸残基序列经过一至五十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且对植物的生长发育具有调控作用的蛋白质。
[0007]序列表中的SEQ ID No: 1由305个氨基酸残基组成。
[0008]编码本发明组蛋白赖氨酸修饰识别蛋白的基因(#17似)，是下述核苷酸序列之
1)序列表中的SEQID No:2的核苷酸序列；
2)编码序列表中的SEQID No: 1蛋白质序列的DNA ；
3)与序列表中的SEQID No:2限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；
4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQID No:2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
[0009]上述高严谨条件为:用0.1XSSPE (或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液，在65 °C下杂交并洗月吴。
[0010]序列表中的SEQ ID No:2由918个碱基组成，其编码框为自5’端第1-918位碱基，编码具有序列表中的SEQ ID No: 1的氣基酸残基序列的蛋白质。
[0011]本发明还包括含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系和工程菌以及扩增该基因中任一片段的引物对。
[0012]本发明还提供上述的水稻组蛋白赖氨酸修饰识别蛋白基因在调控植物生长发育中的应用。
[0013]在实际应用中，将上述水稻组蛋白赖氨酸修饰识别蛋白基因的反义表达载体转化水稻，得到生长矮小的水稻，使植物的生长发育得到调控。
[0014]上述重组表达载体均可按照常规方法构建。
[0015]本发明的水稻组蛋白赖氨酸修饰识别蛋白基因的反义转基因植株株系生长矮小。本发明为植物品种的改良提供了一个优质基因，同时也对深入理解组蛋白赖氨酸修饰识别蛋白的生物学功能和生物学过程，进一步破译组蛋白密码和理解组蛋白密码在高等植物生长发育、遗传变异中的作用具有非常重要的意义。本发明的蛋白质及其编码基因具有较高的实际应用价值，应用前景广阔。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为水稻组蛋白赖氨酸修饰识别蛋白MRG702的蛋白活性测定结果。
[0017]图2为野生型水稻(WT)和T2代转反义#财?7似基因水稻)的表型图。
[0018]图3为野生型水稻(WT)和转反义遍价似基因水稻(MRG702R1-l)中MRG702基因表达的实时荧光定量PCR检测结果。
【具体实施方式】
[0019]下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。所用引物和测序工作由上海桑尼生物科技有限公司完成。
[0020]实施例1.水稻组蛋白赖氨酸修饰识别蛋白基因#挪7似的获得
对GenBank中公布的拟南芥的MRG1的基因序列(GenBank号:NC_003075.7)通过同源序列比较，从水稻基因组中获得同源序列，并根据该同源序列的5’和3’末端序列设计一对引物，引物序列分别为:5’ — ATGTCCCAAGCTGGATC - 3，( SEQ ID No:3)，和 5，—CTATTTGGTCTTTATCC — 3’ (SEQ ID No:4)。
[0021]提取水稻黄化苗总RNA(Promega, SV total RNA isolat1n system),以水稻的总RNA 为模板，用 AMV 反转录酶(TaKaRa)合成 cDNA(依据 Plant RT 一 PCR Kit 2.0l(TaKaRa)的用户手册进行)。以cDNA为模板，PCR扩增水稻组蛋白赖氨酸修饰识别蛋白基因#挪7似的全长cDNA序列。50ul PCR反应体系包含:模板2ul，高保真酶K0D plus (Τ0Υ0Β0) lul，10 X缓冲液5ul，2.5uM dNTP 8ul，20uM的5’和3’引物各lul，水32ul。反应条件为:94°C预变性2分钟；94°C变性30秒，55°C退火30秒，68°C延伸1分钟，共30个循环。反应结束后，将PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化约918bp的扩增片段，将其克隆到载体pUC19 (TaKaRa)中，得到含有回收片段的重组质粒，经测序表明水稻组蛋白赖氨酸修饰识别蛋白基因遍K/似全长cDNA具有序列表中的SEQ ID No:2的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID No:2由918个碱基组成，其编码框为自5’端第1-915位碱基，编码具有序列表中的SEQ ID No:l的氨基酸残基序列的蛋白质，编码蛋白命名为MRG702。
[0022]实施例2.水稻组蛋白赖氨酸修饰识别蛋白基因#挪7似的蛋白活性测定
以实施例1得到的pUC19- MRG702为模板，PCR扩增#挪7似自5’端第1 — 282位的核苷酸序列(包含组蛋白赖氨酸修饰识别蛋白的活性中心--chromo doma i η结构域),5 ’
和 3’ 引物分别为:5’一 GGATCCATGTCCCAAGCTGGATCGGA — 3’ ( SEQ ID No:5)，和 5’一CTCGAGTCCAGATTTTACGCTTTTGT — 3’( SEQ ID No:6)。在 50 μ 1 PCR 扩增体系中包含模版pUC19- MRG702 200ng，5，和 3’ 引物各 20 pmol, lOXbuffer 5μ 1, dNTP 各 20 μ M，高保真K0D plus (Τ0Υ0Β0) lul。按以下条件进行扩增:94°C预变性2分钟；94°C变性30秒、55°C退火30秒、68°C延伸1分钟，共30个循环。PCR产物经I和通ol酶切位点克隆到大肠杆菌表达载体pGEX-4Tl(GE life sciences)，测序验证其正确后得到大肠杆菌表达质粒PGEX-4T1-MRG702N。
[0023]将GST对照以及GST融合的MRG702N重组蛋白在大肠杆菌中的表达纯化依据Glutath1ne Sepharose 4 Fast Flow (GE life sciences)的用户手册进行。将连有 GST或者GST-MRG702N蛋白的Glutath1ne-Sepharose beads经洗漆后直接用于结合实验。取含有20-25Pg蛋白的beads于lmL的PBS溶液中，同时加入lOOPg BSA以及一定量(蛋白与肽段的摩尔数之比为1:3)的甲基化修饰的组蛋白H3 N末端肽段(由北京中科亚光生物科技有限公司合成)，于4°C孵育2h。用PBS洗涤四次后，尽可能地去尽上清。加入30μ?的洗脱液，置于4°C中剧烈摇晃45min后，取5μ?上清用毛细管点样于PVDF膜上，同时取相应的
0.lKg肽段点膜作为Input对照。PVDF膜用特定的组蛋白修饰的抗体进行western blot检测。所用的组蛋白抗体ant1-monomethyl_H3K4 (07-436)，ant1-dimethy 1-H3K4 (07-030),ant1-trimethyl-H3K4 (07-473),和 ant1-dimethyl_H3K27 (07-452)购于 Millipore 公司(http://www.millipore.com) ；ant1-dimethyl-H3K9 (abl220), monomethyl-H3K36(ab9048), ant1-dimethyl_H3K36 (ab9049),和 anti_trimethyl-H3K36 (ab9050)购于Abeam 公司(http://www.abeam, com)。
[0024]实施例3.检测遍似对水稻生长发育的调控作用一、#17似反义表达载体的构建
利用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术，以MRG702基因为靶基因，构建RNA干扰载体。以实施例1得到的PUC19- MRG702为模板，分别以两对不同的引物PCR扩增愿观自5’端第670到896位的核苷酸序列，作为发夹结构的互补DNA双链。所用的引物对 1 为:5’ -aaggatccAAGTATCTCTCTCTAAAGAT-3’ ( SEQ ID No:7)和 5’ 一aaaagcttCTCCTTGGCAGCGGCGGATT — 3，( SEQ ID No:8)，所得 PCR 产物为 FMRG702i(forward)。引物对 2 为 5，-aagaattcAAGTATCTCTCTCTAAAGAT-3，( SEQ ID No:9)和 5，一aaactagtCTCCTTGGCAGCGGCGGATT — 3，( SEQ ID No: 10)，所得 PCR 产物为 rMRG702i(reversed)。为了便于后续的载体构建，在fMRG702i的5’和3’端分别添加了 BamW I和Hindlll的限制性酶切位点，在rMRG702i的5’和3’端分别引入了 I和5^1的限制性酶切位点。
[0025]为了便于RNAi载体的构建，在连接正反两条DNA分子的内含子(由法国植物分子生物学研究所赠送)两端通过PCR方法分别引入了 Λ?/^ΙΙΙ和I的限制性酶切位点，所用引物为:5，一 aaaagcttccaatttggtaaggaaataatt — 3，( SEQ ID No: 11)和 5，一aagaattctttcgaacccagcttccc—3’ ( SEQ ID No:12)。
[0026]将fMRG702i经汉猜Η I和I双酶切，内含子经历和&oR I双酶切，rMRG702 i经AcoR I和5^1，连接入经I和油aI双酶切的pHB载体(由中科院上海植物生理研究所林鸿宣课题组赠送)中，即得RNA干扰载体pHB - fMRG702i 一 PDK intron 一rMRG702i。
[0027]二、#财?7似反义表达载体转化水稻植株
参照Hiei等(Plant Mol B1l, 1997,35:205 — 218)的方法转化水稻。将质粒pHB —fMRG7021- PDK intron 一 rMRG702i通过电激法转入根瘤农杆菌EHA105中，经筛选获得阳性克隆。将携带质粒pHB - fMRG702i 一 PDK intron 一 rMRG702i的农杆菌EH105接种到5ml含100mg/L卡那霉素的YEB液体培养基中28°C摇菌培养至对数生长期晚期，再1:100扩大培养到0D_为0.5左右。收集农杆菌菌体并重悬于转染培养基中。按照常规方法浸染水稻日本晴的愈伤组织，经共培养感染、抗性培养基筛选及分化培养基上分化得到潮霉素抗性的阳性苗。待小苗长至10cm左右时，将小苗移至室外网室种植，收种即得T1代种子。
[0028]为了进一步确定该转基因性状的稳定遗传，将后来得到得T2代种子在室外网室种植，结果如图2所示，转RNA干扰载体的水稻表现出明显的生长矮小。
[0029]三、荧光定量PCR检测转反义MRG702基因水稻中MRG702的表达
在相同条件下对转反义基因水稻和野生型水稻进行培育。按实施例1中相同方法提取水稻总RNA并且反转录合成cDNA。然后用荧光定量PCR检测转反义#挪7似基因水稻和野生型水稻々MRG702的表达情况。检测遍67似所用引物为:5’ 一 GGCCCGCTCCTCTACGA —3，(SEQ ID No:13)，5’ — CGCCACTCATCCTCCTTGTT — 3’ (SEQ ID No:14)。结果如图 3 所示，相对于野生型水稻，遍似的表达在转反义#挪7似基因水稻中呈现明显的下降，进一步证明转反义MRG702基因水稻的表型缺陷是由于MRG702的表达下降而引起的。
【权利要求】
1.水稻组蛋白赖氨酸修饰识别蛋白，其特征在于来源于水稻，名称为MRG702，是具有下述氣基酸残基序列之一的蛋白质:
(1)SEQ ID No:1; (2)将SEQID No:1的氨基酸残基序列经过一至五十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且对植物的生长发育具有调控作用的蛋白质。
2.编码权利要求1所述的组蛋白赖氨酸修饰识别蛋白的基因。
3.根据根据权利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因是下述核苷酸序列之一: Cl) SEQ ID No:2的核苷酸序列； (2)编码SEQID No:1蛋白质序列的DNA ； (3)与SEQID No:2限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列； (4)在高严谨条件下可与SEQID No:2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
4.含有权利要求2或3所述的水稻组蛋白赖氨酸修饰识别蛋白基因的表达载体。
5.含有权利要求2或3所述的水稻组蛋白赖氨酸修饰识别蛋白基因的转基因细胞系。
6.含有权利要求2或3所述的水稻组蛋白赖氨酸修饰识别蛋白基因的工程菌。
7.扩增权利要求2或3所述的水稻组蛋白赖氨酸修饰识别蛋白基因中任一片段的引物对。
8.权利要求2或3所述的水稻组蛋白赖氨酸修饰识别蛋白基因在植物生长发育中的应用。
9.根据权利要求7所述的应用，所述的植物包括单子叶植物和双子叶植物。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于:将所述水稻组蛋白赖氨酸修饰识别蛋白基因的反义表达载体转化水稻，得到生长矮小的水稻。
【文档编号】C12N5/10GK104402982SQ201410722156
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月3日 优先权日:2014年12月3日
【发明者】俞瑜, 董爱武, 石金磊, 刘兵 申请人:复旦大学