一种高赖氨酸蛋白基因GhLRP及其应用的制作方法

一种高赖氨酸蛋白基因GhLRP及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种新的高赖氨酸蛋白基因GhLRP，该基因是从棉花基因组中克隆得到，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。本发明利用转基因技术将所述基因转化到禾本科植物中，实现了提高禾本科作物种子中赖氨酸和蛋白质含量的目的。
【专利说明】一种高赖氨酸蛋白基因GhLRP及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种高赖氨酸蛋白基因及其应用。
【背景技术】
[0002]赖氨酸作为人和单胃动物所必需的氨基酸，在主要禾谷类作物如玉米、水稻、小麦的种子中含量很低，成为主要的限制性氨基酸，严重影响了其营养品质。
[0003]随着生物技术的发展，采用传统育种与分子育种相结合的方法，打破了物种生殖隔离的障碍，实现了物种之间基因的自由交流。而利用植物基因工程改良作物营养及加工品质，其应用潜力不仅仅在于提高初级农产品本身的价值，还涉及到加工成本的降低、加工工艺的简化、产品市场竞争力的提高等多个环节。通过转基因的方法提高作物中的赖氨酸含量，主要有以下几个途径:
[0004]1、改变赖氨酸的合成代谢途径
[0005]植物体中涉及到的赖氨酸代谢相关途径已经被研究的较为透彻，主要包括天冬氨酸代谢途径中涉及到的赖氨酸合成步骤以及赖氨酸分解相关代谢途径。
[0006]天冬氨酸代谢途径是一个复杂的生化过程，该过程涉及到的第一个关键酶天冬氨酸激酶(aspartate kinase, AK)和赖氨酸合成相关的第一个关键酶二氢批唳二羧酸合成酶(dihydrodipicolinate synthase, DHDPS)分别受赖氨酸和苏氨酸等代谢终产物的反馈抑制调节(Azevedoet al.，1997，2006)。植物中有两种类型的AK，即单功能酶AK和双功能酶AK-HSDH (aspartate kinase-homoserine dehydrogenase) (Wang et al.，2007)o 单功能酶AK受赖氨酸的反馈抑制调节，玉米中共有Askl和Ask2两个编码单功能AK的基因，当这些基因被突变后，AK对赖氨酸变得`不敏感，从而使游离的赖氨酸含量增加(Diedricketal., 1990; Dotson et al., 1990a, b;Muehlbaueret al.，1994a)。双功能酶AK受苏氨酸的反馈抑制调节，目前，在玉米cDNA中克隆出了三个编码双功能酶AK的基因，其中有两个基因被分别定位在2号染色体的长臂和4号染色体的短臂上(Muehlbaueret al., 1994b)。依据这些性质与特点，科研工作者们通过筛选突变体的技术开展了一些研究，希望筛选到含有对赖氨酸和苏氨酸不敏感的AK的突变体。在一些大麦突变体中，AK对赖氨酸的反馈抑制调节变得不敏感，结果使大麦种子中苏氨酸的含量提高了几倍，但是赖氨酸含量却没有被大量的提高(Bright et al., 1982;Rogneset al., 1983;Arruda et al.，1984)。同样的，在一些玉米突变体中，苏氨酸的含量也提高了几倍，但是赖氨酸含量却没有增加(Hibberd andGreen, 1982)。对这一现象，Bright等人解释说尽管AK受到抑制,但是DHDPS的活性仍然受到赖氨酸的反馈抑制调节，从而阻碍了赖氨酸含量的增加(Bright et al.，1982)。为了解决这个问题，一些赖氨酸不敏感的DHDPS突变体也被筛选出来(Frankard et al.，1992)，在一些突变体中，赖氨酸对DHDPS的反馈抑制作用减弱，使得植物叶片中的赖氨酸含量增加，但是种子中的赖氨酸含量却没有发生明显的变化(Negrutiuet al.，1984;Azevedoetal.，2002)。
[0007]目前，一些有经济价值的高赖氨酸玉米品种已经作为动物的饲料被应用，如LY038，该转基因株系是通过在玉米胚中特异性表达来自谷氨酸棒状杆菌的对赖氨酸不敏感的DHDPS来实现的，转基因玉米种子中游离赖氨酸的含量为0.96mg/g (干重)，而野生型只有 0.05mg/g (Lucas et al.，2007)。
[0008]2、降低醇溶蛋白含量，增加赖氨酸含量
[0009]醇溶蛋白是谷类作物中含量最为丰富的一类蛋白，缺少赖氨酸和色氨酸，因此通过降低主要醇溶蛋白的含量也可以提高种子中赖氨酸的含量。在o2突变体中，醇溶蛋白的含量减少，但是受02调控的其它一些蛋白的表达也受到了影响，以至于玉米籽粒呈现出opaque表型。目前，主要是通过RNAi和转基因技术减少或抑制必需氨基酸缺乏的醇溶蛋白的表达。Segal等人构建了使编码22kDaa -zein基因沉默的RNAi载体，结果发现转基因玉米中赖氨酸含量提到，而且玉米籽粒表型正常(Segal et al.，2003)。Huang等人构建了使编码19kDaa -zein基因沉默的RNAi载体，结果种子赖氨酸、色氨酸和甲硫氨酸含量均增加(Huang et al., 2004)。此后,该课题组又构建了 RNAi的嵌合载体使19kDaa -zein和22kDaa -zein的合成积累量显著地减少，结果玉米种子中赖氨酸和色氨酸含量均增加(Huang et al., 2006)。
[0010]3、引入编码富含赖氨酸蛋白的基因
[0011]目前，主要有三种编码富含赖氨酸蛋白的基因被应用:(1)密码子经过改造的高赖氨酸蛋白基因；(2)人工合成的高赖氨酸基因(3)植物中或非植物中天然存在的高赖氨酸蛋白基因(Ufazet al.，2008)。
[0012](I)密码子经过改造的高赖氨酸蛋白基因
[0013]该方法主要是将一些主要的储藏蛋白基因进行定点诱变或是向其插入编码富含赖氨酸的核苷酸序列。因此，选择合适的诱变或插入位点是实验成功与否的关键，主要是选择序列不保守的位置进行改造，避免使经改造的蛋白的结构、稳定性以及功能发生改变(Sun and Liu, 2004)。玉米中的醇溶蛋白是主要的储藏蛋白，而且赖氨酸缺乏，因此主要是通过改造一些醇溶蛋白基因来提高种子赖氨酸含量。最早的相关报道是将编码19kDaa-zein的基因进行改造，然后将其mRNA注射到非洲爪蟾的卵母细胞中，结果发现经过改造的19kDaa -zein在卵母细胞中的合成、加工、稳定性以及形成蛋白体等的性质没有改变(Wallace et al.，1988)。Torrent等人用富含赖氨酸的序列替代Y-zeins的富含脯氨酸的序列，然后将其在玉米中超表达，结果发现这些经过改造的Y-zeins在玉米胚乳相应的位置上大量的积累(Torrent et al.，1997)。
[0014](2)人工合成的高赖氨酸基因
[0015]该方法主要是基于蛋白的结构、折叠、功能、拓扑等性质设计新的蛋白。基于玉米醇溶蛋白的结构特点，Kim等人设计并合成了一个新的储藏蛋白ASP1，该蛋白含有78.9%的必需氨基酸，在转基因烟草的叶片中以及其它植物中能够大量的合成与积累，使得氨基酸的含量提高(Kim et al., 1992 ；Zhang et al., 2003)。基于 α 螺旋的 coiled-coil 结构，Keeler等人设计了一个新的蛋白CP3-5，该蛋白含有31%的赖氨酸和20%的甲硫氨酸,用种子特异性启动子启动该基因在烟草中表达后发现该蛋白在烟草种子中大量稳定地积累，在一些转基因株系中甚至能达到种子总蛋白的2%，使得赖氨酸含量大幅提高(Keeler etal., 1997)。
[0016](3)天然存在的高赖氨酸蛋白基因[0017]选择天然存在的同源或异源的高赖氨酸基因在植物体内表达是目前被广泛应用的一种方法，一些高赖氨酸植物蛋白已经被研究并应用到改善植物蛋白品质方面。对于整个研究而言，高赖氨酸蛋白基因的选择是一个关键问题。豆科类的蛋白赖氨酸含量较高，如将大豆球蛋白和菜豆蛋白基因在烟草种子中异源表达后，这些蛋白在烟草种子中大量稳定地积累，使得赖氨酸含量增加(Utsumiet al., 1993; Takaiwaet al.，1995)。此外,还有一些豆类蛋白如WBLRP和VSPs在烟草或水稻中异源表达后，使赖氨酸含量提高(Gaoetal., 2001; Guenouneet al，2003)。动物中的一些高赖氨酸基因也可以作为蛋白品质改善的候选基因，如鸡的卵清蛋白和牛的酪蛋白基因，但是这些蛋白在植物中积累量比较低(Schroeder et al., 1991;Philip et al.，ZOOOt5Bicar等人将牛奶蛋白与玉米种子特异性强启动子27kDa Y -zein连结构建载体转入玉米中，获得了种子赖氨酸含量提高了 29-47%的转基因玉米(Bicaret al.，2008)。玉米的延伸因子eEFlA (elongation factorlA)是个多功能蛋白，在玉米胚乳细胞中与围绕蛋白体的肌动蛋白共定位，富含赖氨酸，可能与玉米胚乳中的赖氨酸含量高度相关(Habben，et al., 1995; Sun, et al.，1997)。eEFlA可以作为一个候选的高赖氨酸基因以改善蛋白品质，但是现在还没有相关的报道。1997年刘俊起等克隆了一个花粉特异蛋白基因的cDNA(SB401) (Liu et al.，1997)，其编码的氨基酸序列中赖氨酸含量高达16.7%，将此cDNA与玉米19kDa醇溶蛋白启动子连接后转化玉米，SB401表达产物能在玉米籽粒中稳定积累并使籽粒中赖氨酸和蛋白质含量明显提高，该方法获得发明专利(ZL01118297.0)。后通过常规育种方法获得了稳定的高蛋白质和高赖氨酸转基因玉米自交系(Yu et al.，2004)。郎志宏等在马铃薯中克隆了一个SB401同源基因SBLR。SBLR基因编码211个氨基酸，其中赖氨酸重量比为18.93%。将该基因转入玉米，得到了 6个蛋白质和赖氨酸含量提高均在30%以上的株系。该基因在作物品质改良中的应用也拥有专利(ZLO1118296.2)。

【发明内容】

[0018]本发明的目的是提供一种新的高赖氨酸蛋白基因GhLRP及其应用。
[0019]为了实现本发明的目 的，本发明首先提供一种来自棉花的高赖氨酸蛋白基因GhLRP,以及在严格条件下，可与该基因的核苷酸序列发生杂交的核苷酸序列。所述高赖氨酸蛋白基因GhLRP的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，其⑶S序列如SEQ ID N0.3所示。
[0020]本发明还提供了一种由所述高赖氨酸蛋白基因GhLRP编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，赖氨酸含量为18.97%。
[0021 ] 本发明还提供了含有所述基因的表达载体。
[0022]进一步地，所述载体还含有一种启动子。
[0023]作为优选,所述启动子为种子特异启动子F128。
[0024]所述载体的构建方法如下:
[0025]利用双T-DNA载体，将GhLRP基因与谷子种子特异启动子F128和来自胭脂碱合成酶(nos)基因的3’转录终止区域连接，构建植物表达载体，以潮酶素磷酸转移酶基因(hpt)作为选择标记基因。用农杆菌介导法转化08 X 178杂交玉米幼胚，经潮酶素筛选获得抗性再生植株。经过基因组DNA PCR检测得到88个含GhLRP基因的TO代转基因玉米株系，将转基因玉米自交获得Tl代种子。通过PCR、RT-PCR和Western检测Tl代玉米植株，将阳性的株系种子进行赖氨酸和蛋白质含量的测定，从中选择赖氨酸和蛋白质含量均较高的3个株系继续进行后代的跟踪检测。
[0026]本发明还提供了含有所述基因的工程菌。
[0027]本发明还提供了用于扩增高赖氨酸蛋白基因GhLRP的引物对，包括正向引物F:5' -CCMCTTTTACTCATTACTGTCTCA-3'和反向引物R:5, -TTTATGTTTCTCATGCTCTTTAGGC-3'。
[0028]本发明还提供了一种提高禾本科植物种子中蛋白质和赖氨酸含量的方法，将含有高赖氨酸蛋白基因的植物表达载体，用农杆菌介导法转化禾本科植物，从而获得赖氨酸和蛋白质含量均较高的禾本科植物。
[0029]本发明以转化08X 178杂交玉米幼胚为例,从而获得赖氨酸和蛋白质含量均较高的玉米株系。
[0030]本发明还提供了高赖氨酸蛋白基因GhLRP在提高禾本科种子赖氨酸含量中的应用。
[0031]本发明的有益效果在于:
[0032]本发明所获得的结果为玉米品质改良提供了潜在的基因资源。同时，该方法为玉米营养品质改良提供了一种新的途径。所获得的转基因高赖氨酸玉米在实际生产中具有重要的应用价值。
【专利附图】

【附图说明】
[0033]图1为本发明GhLRP基因的⑶S序列及其编码蛋白的氨基酸序列及组成。
[0034]图2为本发明实施例2中pSB130_GhLRP双元表达载体的示意图。
[0035]图3为本发明实施例3中玉米抗性愈伤的筛选和再生过程；
[0036]其中:A为玉米愈伤在含有15mg/L潮霉素的筛选培养基上培养；B为抗性愈伤的分化培养；C为分化出的幼苗在生根培养基上培养；D为再生苗在小盆中生长；E为玉米苗在温室土壤中培养；F为TO代转基因玉米。
[0037]图4为本发明Tl代转化玉米的分子检测；
[0038]图中(A)为部分转化株系的PCR检测电泳图；其中:Lane I, Lane2, Lane3, Lane4, Lane5 分别为转基因株系 F12, F33, F78, F88, F91 的检测结果；M，DNA Marker ;WT，08X 178野生型杂交玉米作为对照；
[0039]图中(B)为部分转化株系的RT-PCR检测电泳图；其中:Lane I, Lane2, Lane3, Lane4, Lane5 分别为转基因株系 F12, F33, F78, F88, F91 的检测结果；
[0040]图中(C)为部分转化株系的Western检测图；其中:Lanel, Lane2, Lane3, Lane4, Lane5 分别为转基因株系 F12, F33, F78, F88, F91 的检测结果，每个泳道蛋白上样量为20 μ g。
[0041]图5为本发明T2代转GhLRP玉米种子zein与non_zein的积累模式的分析；
[0042]图中:㈧为zein含量；(B)为non-zein含量；(C)为野生型及转基因株系F12, F78, F88种子醇溶蛋白的15%SDS_PAGE电泳图，每个泳道的蛋白上样量相当于400 μ g成熟玉米种子粉末包含的醇溶蛋白含量。
[0043]图6为本发明T3代转GhLRP玉米种子外观、容重分析及萌发率分析；
[0044]图中:(A)为T3代转基因玉米株系F12，F78和F88种子和野生型玉米种子在白炽光(上部和中部)和透射光(底部)下的表型观察图；(B)为玉米种子的容重分析；(C)为玉米种子的萌发率分析。
【具体实施方式】
[0045]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0046]实施例1编码高赖氨酸蛋白基因GhLRP的克隆
[0047]根据海岛棉基因组中的高赖氨酸蛋白基因Fbl2A (GenBank:U34401.1)设计克隆高赖氨酸蛋白基因 GhLRP 的引物GhLRP-5:5' -GCGTCGACCCAACTTTTACTCATTACTGTCTCA-3;和 GhLRP-3:5 ' -GGAATTCTTTATGTTTCTCATGCTCTTTAGGC-3 '。5 ’ 端引物引入 Sal I 酶切位点，3’端引物引入EcoRI酶切位点。以陆地棉基因组DNA为模板，进行PCR扩增。扩增条件如下:95°C，变性5min ;57°C，退火0.5min ;72°C，延伸0.5min ;扩增循环数35 ;最后72。。，延伸IOmin ;4°C保存。将PCR产物在0.8%琼脂糖凝胶中电泳，用试剂盒回收目的条带。取适量回收产物，与PMD19T vector连接转化大肠杆菌感受态。小提该质粒PMD18T_GhLRP，经SalI和EcoRI酶切鉴定后测序。GhLRP基因的核苷酸序列`如SEQ ID N0.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列及氨基酸组成如图1所示。
[0048]实施例2用于玉米中表达的表达载体构建和农杆菌转化
[0049]目的基因GhLRP的表达盒由来自谷子的种子特异启动子F128(ZL200710099169.7)和胭脂碱合成基因nos的3’转录终止区域组成，选择标记基因为潮酶素磷酸转移酶基因(hpt)，其编码氨基糖苷4 一磷酸转移酶APH(4)-1。载体示意图如图2所
示，载体包括两个T-DNA区-T-DNAl和T-DNA2区；RB1，LBl, RB2, LB2分别指两个T-DNA
区的右边界和左边界；T-DNA1区包括由F128启动子驱动的GhLRP表达框；T_DNA2区包括由CaMV35S启动子驱动的hpt表达框。
[0050]用SalI和EcoRI将GhLRP从质粒PMD18T_GhLRP上切下，连接到双-T载体pSB130-SBgLR(该质粒由香港中文大学辛世文教授提供的pSB130载体衍生而来，该质粒上有两个T-DNA，一个包含选择标记基因hpt，另一个T-DNA上有多克隆位点，可以克隆目的基因)，形成重组质粒pSB130-GhLRP。采用冻融法将质粒pSB130_GhLRP直接转入农杆菌菌株LBA4404中，获得含有重组质粒pSB130-GhLRP的农杆菌LBA4404 (pSB130_GhLRP)。农杆菌转化技术为公知技术。
[0051]实施例3用含pSB130_GhLRP的农杆菌转化玉米幼胚
[0052]农杆菌转化玉米幼胚的方法是一个比较成熟的转化方法，具体步骤如下:
[0053]1、玉米的控制授粉
[0054]( I)玉米抽雄后，在授粉的前一天，用大口袋套住雄穗，下面用别针别住，收集花粉；
[0055](2)雌穗花丝未抽出前，用小口袋将其套住，并用大头针别好；
[0056](3)在授粉的前一天，当花丝伸出约2cm长时，用剪刀剪去花丝的顶部，促进其伸长;
[0057](4)第二天，当花丝伸长后，进行授粉；
[0058](5)授粉后系上小牌，写上授粉的品种和日期，10-12天后收获。
[0059]2、幼胚的剥离[0060](I)取授粉后10-12天，幼胚大小为1.5-2.0mm的08 X 178杂交玉米雌穗；
[0061](I)将新收获的玉米雌穗去掉苞叶、花丝，花丝一定要去干净，可用酒精灯将未除净的花丝烧去；用小刀去掉雌穗的头尾部分；
[0062](2)将雌穗浸在70%乙醇(加几滴Tween20)中灭菌IOsec ；
[0063](3)将雌穗取出，置于无菌的环境中备用；
[0064](4)将一只枪式镊子从顶部插入雌穗，用左手持住镊子，右手用装有#22刀片的手术刀切去籽粒的上半部分；
[0065](5)换上#10刀片，将刀尖插入籽粒下部的果皮与胚乳之间，将胚乳挑出；
[0066](6)用刀尖将粘在胚乳顶部或顶部果皮内的幼胚转移到基本培养基上，操作要小心，不要损伤幼胚。
[0067]3、农杆菌的制备
[0068](I)从保存的菌板上挑一环菌接到YEB (含125mg/L Sm和100mg/L Kan)平板培养基上，28°C培养两天(或20°C培养三天)；
[0069](2)收集菌体，用侵染培养基调菌液至0D600=0.3-0.4，28°C，180rpm避光摇菌1-2小时备用。
[0070]4、幼胚的农杆菌侵染
[0071](I)在2ml灭菌的离心管中加入1.5ml的浸染培养基，用小刀片把幼胚从平板上挑至离心管中，用移液器轻轻吹打`，在30min内共洗两次；
[0072](2)吸出浸染培养基，加入1.5ml准备好的菌液，避光缓慢颠倒20次后静置，此过程为IOmin ；
[0073](3)将幼胚连同菌液倒在铺有无菌滤纸的培养皿中，超净台中吹干，但不要使幼胚失水；
[0074](4)将吹干的幼胚转移至共培养培养基中，盾片朝上，20°C避光共培养三天。
[0075]5、恢复培养
[0076]将共培养三天的幼胚转移到恢复培养基中。如果共培养的幼胚长菌，可将长菌的幼胚小心地挑到2ml灭菌的离心管中，用无菌水洗直至洗净，然后用含有100mg/L头孢霉素的无菌水洗30min，最后将幼胚连同无菌水倒在铺有无菌滤纸的培养皿中吹干，再将幼胚转移到恢复培养基中，28°C黑暗培养7天。
[0077]6、筛选培养
[0078]将恢复培养的幼胚转移到筛选培养基中暗培养，每两周继代一次。一般情况下，筛选时潮霉素的浓度分别为5mg/L、10mg/L、15mg/L和20mg/L,筛选次数和最终潮霉素的浓度视情况而定。
[0079]7、筛选后的诱导
[0080]将筛选后的愈伤转移到高糖培养基中，暗培养两周。
[0081]8、分化培养
[0082]将恢复培养两周的抗性愈伤转移到分化培养基中，见光培养，光照周期为光照/黑暗:16h/8h，每两周继代一次。
[0083]9、生根培养
[0084]待分化出的幼苗长至2_3cm时，将幼苗从抗性愈伤上切下，移入罐头瓶的生根培养基中，诱导生根，当幼苗及根系粗壮后即可炼苗移栽。
[0085]10、再生苗的炼苗移栽
[0086]将小苗移到温室中放置2-3天后，将封口膜打开，加入一层无菌水，再放置2-3天。然后将小苗移栽入小盆中(草炭土和蛭石按1:1比例)，移栽时将根部的琼脂清洗干净，以防被微生物滋生，同时注意避免损伤根系。将栽入小盆的小苗放在塑料拱棚中培养，待小苗比较壮实后移入温室土壤中继续培养。
[0087]玉米抗性愈伤的筛选和再生过程见图3。潮霉素筛选后的抗性愈伤经诱导后被转移至分化培养基中见光培养(图3B)，分化出的幼苗从愈伤组织上切下转移到生根培养基中诱导生根(图3C)，待小苗的根系比较发达时移到温室，炼苗后种到小花盆里(图3D)，种子成熟后及时收获(图3F)。
[0088]转化各步骤中使用的培养基成分如下:
【权利要求】
1.一种高赖氨酸蛋白基因GhLRP，其特征在于，所述高赖氨酸蛋白基因GhLRP的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一种由权利要求1所述的高赖氨酸蛋白基因GhLRP编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.含有权利要求1所述基因的表达载体。
4.如权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体还含有一种启动子。
5.如权利要求4所述的载体，其特征在于，所述启动子为种子特异启动子F128。
6.含有权利要求1所述基因的工程菌。
7.用于扩增高赖氨酸蛋白基因GhLRP的引物对，其特征在于，包括正向引物F:5' -CCMCTTTTACTCATTACTGTCTCA-3'和反向引物R:5, -TTTATGTTTCTCATGCTCTTTAGGC-3'。
8.一种提高禾本科植物种子中蛋白质和赖氨酸含量的方法，包括将权利要求3所述表达载体转化禾本科植物。
9.高赖氨酸蛋白基因GhLRP在提高 禾本科种子赖氨酸含量中的应用。
【文档编号】C12N15/29GK103484473SQ201310398102
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月4日 优先权日:2013年9月4日
【发明者】于静娟, 赵倩, 朱登云, 岳静, 李丛 申请人:中国农业大学