一个小GTP结合蛋白基因TaRab18及其表达载体和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，公开了一个小GTP结合蛋白基因化Rabl8及其表达载 体和应用。
【背景技术】
[0002] 小麦（Triti州maestivumL.)条诱病是由小麦条诱菌（Pucciniastriiformis f.sp.tritici)引起的一种危害严重的小麦病害，在世界上60多个国家和地区普遍发生。 小麦条诱病主要在小麦叶片上发生，在叶銷和茎上W及穗部芒上和颖壳也可发生。小麦条 诱病具有爆发性强、流行频率高、传播速度快、预防难度大、发生范围广、危害严重等特点。 在一般流行年份，小麦条诱病可使小麦减产20% -30%，而大流行年份，其产量损失达到 50% -60%，甚至绝收。我国不仅是世界上最大的小麦条诱病流行区，也是一个相对独立的 流行区系，并且有自己独特的优势小种。1950、1964、1990、2002、2003和2009年小麦条诱病 在我国大范围流行，而在大多数年份局部发病成灾。在过去10年，平均每年约有400万公 顷小麦种植地区受到小麦条诱病的影响。
[0003] 多年来选育和推广小麦抗病品种一直是植病学家和育种工作者致力解决和防治 小麦条诱病的主要手段，虽然颇见成效，但由于小麦条诱菌具有高度的遗传变异性，加上小 种专化性抗病品种的单一化大面积种植，必然导致新的优势小种在条诱菌种群中产生和发 展，最终导致原有品种抗性的丧失。品种抗诱性的屡屡"丧失"，是引起条诱病多次大流行的 主要原因，品种抗诱性丧失问题已成为小麦生产上一个世界性难题。因此，加强小麦条诱病 抗病新基因的挖掘利用W及抗病遗传基础的理论研究，选育抗条诱病品种，从而有效防治 小麦条诱病大面积流行刻不容缓。
[0004] 小麦品种92R137,含有抗条诱病基因化26,自1994年进入国内育种利用W来， 化26在四川、云南、陕西等条诱病常发区进行了多年种植，对条诱病表现出了稳定的高度抗 性，尤其是对小麦条诱菌优势小种条中29、30、32表现高抗-免疫。因此，开展条诱病互作 机理研究及重要抗条诱病相关基因的克隆，对于条诱病抗病育种具有重要意义。本发明利 用小麦基因忍片技术从转录组水平上了解小麦与条诱菌互作的基因表达特征，从中筛选了 一个在92R137中上调表达10倍W上的基因化Rabl8,将该基因转入感条诱病小麦品种扬 麦158中使基因超量表达，可显著提高小麦的条诱病抗性。本发明提供的化R油18基因超 量表达载体为开展抗条诱病小麦基因工程育种提供基础。
【发明内容】
阳0化]本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一种小GTP结合蛋白基因 化R油18的表达载体和应用。
[0006] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：
[0007] 小GTP结合蛋白基因TaR油18来自普通小麦灯riticumasetivumL. )92R137,其 核巧酸序列为SEQIDNO. 1。
[0008] 该小GTP结合蛋白基因的蛋白质为化Rabl8,其氨基酸序列为SEQIDNO. 2。
[0009] 含小GTP结合蛋白基因化R油18的重组表达载体。
[0010] 所述的重组表达载体优选W地1220为出发载体，将化R油18基因插入地1220的 BamHl和化nl酶切位点间所得。
[0011] 所述的含小GTP结合蛋白基因化Rabl8的表达载体在构建抗条诱病小麦品种中的 应用。
[0012] 有益效果
[0013] 本发明从小麦中克隆得到了一个小GTP结合蛋白基因化Rabl8及其所编码的蛋白 质化Rabl8,该基因在含有抗条诱病小麦92R137中受条诱菌诱导表达，而在感病小麦扬麦 158中不受条诱菌诱导表达。将化Rabl8插入超表达载体地1220,并导入感病小麦品种扬 麦158中，可W提高扬麦158对条诱病的抗性。化R油18用于基因工程育种，将其导入易感 条诱病小麦品种中，能够提高小麦的条诱病抗性。
【附图说明】
[0014] 图1、化.1763. 2. S1的RACE及基因组扩增结果
[001引A :5'和3' RACE扩增结果；B:基因全长引物扩增结果。
[0016] 图2、化R油18及植物中Rabl8/RABC1蛋白保守结构域分析
[0017]下划线标出的是化R油18几个保守亚结构域，G1，G3, G4和G5,为GTP/GDP结合域。
[0018] 图3、利用Q-PCR分析化R油18在抗条诱病92R137和感条诱病扬麦158中的表达
[0019] 横坐标表示条诱菌诱导0、6、12、24、48、72小时的小麦叶片样品。
[0020] 图4、化R油18超量表达载体的构建
[0021]A:植物表达载体地1220 ;B:重组超表达载体地1220:化R油18
[0022] 图5、PBI220:化R油18部分转基因植株TO代PCR分子鉴定 阳02引 3-14 :转基因植株（4, 7,9,10,13为阳性植株，其余为阴性植株），1 :水对照，2 :质 粒对照，3 :扬麦158对照，M:DL2000DNA标准分子量
[0024] 图6、化R油18转化扬麦158的Ti代阳性植株的条诱病抗性鉴定 阳02引1 :抗病对照92R137, 2 :感病对照扬麦158, 3-6 :抗性株系
【具体实施方式】 阳0%] 实施例1受条诱菌诱导表达的具GTP/GDP结合作用的基因化R油18的克隆
[0027] 为了克隆化26抗病途径中的抗病相关基因，采用基因忍片杂交法筛选抗条诱 病小麦92R137与感条诱病小麦扬麦158中的差异表达基因。从中多次筛选获得一上 调表达10倍的EST探针化.1763. 2.Sl_at。W此探针序列为基础，通过RACE得到了预 期长度的扩增产物（图1A)，拼接后序列长度为1015bp。根据拼接序列设计全长引物 P1(CCAGCCATGGACTCTTCTTC，沈QIDNO. 3)，P2 (AGCTGAAAGCTGCCAAGGTA,SEQIDNO. 4)。W 抗病小麦92R137cDNA为模板，通过RT-PCR得到预期长度82化p的扩增产物（图IB)，并将 其回收、克隆、测序，扩增产物与拼接序列一致。经0RFfinder分析，cDNA序列编码区88~ 748-bp，长660-bp，序列如SEQIDNO. 1所示。编码217个氨基酸，氨基酸序列如SEQID NO. 2 所不。经SMART软件化ttp://sma;rt.embl-heide化erg.de/)分析，hRablS编码蛋 白序具有4个（GTP/GDP结合所需的结合域（即Gl，憐酸结合回环GDSGVG：G3,协调GTP的 丫和P磯酸基序DTAGQ;G4,强化鸟囑岭结合基序GNKVD;G5,帮助鸟囑岭结合和解离基序 ECSAR)、2个分子开关（SwitchI/G2;SwitchII)和1个C端膜定位信号-异戊締基化基 序（往）（图2)，其中结构域（im)为植物特有。该蛋白序列与短柄草、玉米和拟南芥中的 ^8(：1/1?油18〇0臟序列一致性达89%、86%和85%，因此将该基因命名为1'曰1?油18。
[0028] 实施例2化R油18基因受条诱菌诱导的表达特征分析
[0029] 为了研究化Rabl8在抗感条诱病材料中的表达模式，利用抗病材料92R137和 感病材料扬麦158经条诱菌诱导0、6、12、