用于生产蛋白的转基因芦荟植物及其相关的方法
【专利说明】
[0001] 本申请为分案申请，其原申请的申请日为2006年9月26日，申请号为 200680043903. 1 (国际申请号PCT/US2006/037756)，名称为"用于生产蛋白的转基因芦荟 植物及其相关的方法"。
[0002] 相关专利申请的交叉引用
[0003] 本专利申请要求2005年9月26日提交的名称为"TRANSGENIC ALOE PLANTS FOR PR0CUTI0N OF PROTEINS AND RELATED METHODS" 并且指定序列号为 60/720, 540 的美国临 时申请的优先权和权益，该申请全文通过引用的方式纳入本文。
技术领域
[0004] 本发明涉及转基因单子叶植物，并且更具体地涉及转基因芦荟植物，以及用于产 生转基因芦荟植物的方法和组合物，和从所述转基因芦荟植物提取蛋白的方法。
【背景技术】
[0005] 具有生物活性的蛋白有持续增长的市场，许多的所述生物活性蛋白被应用于治疗 目的。目前已有超过160种市售的基于蛋白的药物。未来的两年，另外还有大约50种有希 望被批准。现在对治疗性蛋白生产的需求已经超过了工业的产能。为了克服这个问题，预 计所述工业的产能需要提高4-5倍。然而，这些治疗性蛋白的生产设备昂贵，并且其建造需 要较长的时间。因此，需要更加低成本的生产方法，并且需要所述方法能够缩短达到大规模 生产所需要的时间。
[0006] 可以使用一些基于动物的蛋白生产方法。但是，这些方法经常会引入疾病造成的 健康风险。这样的风险可能来自于疾病的交叉感染，所述疾病可以同时感染所述动物和例 如人类患者的最终使用者。因此，存在一个对生产方法的需求，所述方法需要消除所述生产 生物和所述终端使用者之间的交叉感染的可能性。
[0007] 另外，许多现有的生产方法需要大量的处理，以从所述动物或产生治疗性蛋白的 其他宿主生物中提取所述治疗性蛋白，并且使所述化合物处于患者可以利用的状态。经过 纯化以后，可以将所述蛋白与佐剂或其他载体材料结合以稳定所述蛋白并且使患者可以利 用。然而，涉及对治疗性蛋白处理的提取、纯化、在其他溶剂中的再悬浮的过程是复杂和繁 琐的，并且可能不利于在对治疗有普遍需求的发展中国家中使用。因此，需要一个简化生产 方法，所述方法可以消除或减少治疗性蛋白的提取后处理。
【发明内容】
[0008] 根据本发明的组合物和方法可以解决上述的许多的需求和缺陷，并且将会提供另 外的改进和优点，本领域技术人员通过阅读本发明公开的内容将会理解这些改进和优点。
[0009] 在一方面，本发明可以提供一种稳定地整合目标基因的转基因芦荟植物。在另一 方面，可以提供新的载体和构建体，以将目标DNA序列整合进芦荟植物的基因组中。所述目 标序列可以编码一种生物活性的蛋白。所述生物活性的蛋白可以是干扰素、免疫球蛋白、淋 巴因子、生长因子、激素、血液因子、组织相容性抗原、酶、化妆品用蛋白和其他哺乳动物蛋 白，或其他目标蛋白。在某些方面，所述目标蛋白是人类蛋白。根据本发明的芦荟植物可以 将目标基因转录并翻译成目标蛋白。在一方面，至少一些所述的目标蛋白可以易位到所述 芦荟叶的中央部分。在其他方面，所述的目标蛋白可以包含一个信号序列以便于其易位到 所述芦荟叶的中央部分。在其他方面，可以提供从芦荟植物上分离单细胞的新方法。仍然 在其他的方面，本发明可以提供新的方法，所述方法用于将载体整合到芦荟植物中，并且再 生这样的转基因芦荟植物。
[0010] 根据本发明的产生哺乳动物蛋白的转基因芦荟植物可以提供用于生产目标蛋白 的、更加经济的可行的选择，所述的目标蛋白例如各种生物活性的蛋白和化妆品用蛋白。在 一方面，所述的目标蛋白可以定位于和/或集中在所述芦荟叶的凝胶中。所述的目标蛋白 的这种定位可以简化从所述植物中移出所述蛋白。在这方面，所述的目标蛋白可以与位于 所述芦荟叶中央部分的非变性凝胶被共提取。因此，本发明可以提供一种转基因植物，与例 如烟草和玉米的大部分的转基因植物相比，通常可以更容易地从所述转基因植物获得目标 蛋白。而且，本发明可以提供有效的蛋白分离方法。仍然在其他的方面，所述的目标蛋白可 能不是特别地位于所述芦荟植物中。然而，所述芦荟植物的解剖学和生理学仍然可以提供 生产目标蛋白的某些其他的优点，本领域的技术人员通过阅读本公开内容将可以理解这些 优点。
[0011] 与在细菌和酵母中的产生目标蛋白的常规方法相比，芦荟植物有各种优点。芦荟 植物10的所述优点可以包括以某些方式加工蛋白的能力，所述方式不适合于简单的单细 胞细菌和酵母，并且是产生具有所需形式的蛋白必须的。例如，这种加工可以包括化学修饰 (例如通过糖基化）和某些蛋白的折叠。而且，与基于动物细胞的其他蛋白生产方法相比， 芦荟植物生产可以提供显著的成本优势、规模优势和减少可能对人有害的污染的危险。
[0012] 来自根据本发明的转基因芦荟植物的芦荟叶的中心部分的蛋白修饰凝胶从所述 芦荟植物取出就可以被直接应用。这可以避免相对复杂的和昂贵的从天然植物材料中提取 目标蛋白的过程。在某些方面，从所述叶中提取的凝胶不需要蛋白的提取或处理就可以被 直接应用。所述凝胶可以以髓心的形式，所述髓心是从转基因芦荟植物的断裂叶的脱落部 分机械地提取的。
[0013] 本发明可以为具有生物活性和/或具有化妆品用途的人和其他哺乳动物蛋白的 生产提供经济、可行的选择。
[0014] 通过阅读本公开内容，本领域技术人员将会理解本发明的其他改进和优点。
【附图说明】
[0015] 图1显示芦荟叶的横断面解剖的一个实例；
[0016] 图2显示产生胼胝体组织的示例性方法；
[0017]图3用图表概述了产生转基因芦荟植物的各个步骤；
[0018] 图4用图表显示包含序列信息的质粒载体的组件；
[0019] 图5列出来自玉米的泛素启动子的序列信息，并且突出显示了所述泛素启动子区 域；
[0020] 图6A和6B显示根据本发明的方面的质粒载体系统的构建；
[0021] 图7A至7C显示根据本发明的方面的另一个质粒载体系统的构建；
[0022] 图8显示根据本发明的方面的另外一个质粒载体系统的构建；和
[0023] 图9显示根据本发明的方面的整合系统的构建。
[0024] 所有的附图的显示仅仅是为了易于解释本发明的基本教导；在阅读如下的说明之 后，所述附图关于各种实施方案的数量、位置、序列、关系和组分的扩展将能够被本领域的 技术人员解释或者将在所述技术人员的理解范围内。而且，在阅读如下的说明之后，用于 实践本发明的各种方案、工具和组合物将在本领域的技术人员的理解范围内。
【具体实施方式】
[0025] 本说明书中使用的，"一"或"一种"可能指一种或多种。如在权利要求中使用的， 当与词语"包含"一块使用的时候，词语"一"或"一种"可能指一种或多于一种。如本文使 用的"另一种"可能指至少第二种或更多。
[0026] 本文使用的，一种"转化的芦荟细胞"指一种用稳定整合的、非天然的、重组DNA转 化（例如农杆菌介导的转化或者通过使用包被有重组DNA的微粒或其他方法轰击）的植物 细胞。本发明的一种转化的芦荟细胞可以是一种原始转化的以一种微生物或者作为一种子 代植物细胞形式存在的植物细胞，所述子代植物细胞再生成分化的组织，例如再生成具有 稳定整合的、非天然的重组DNA的转基因芦荟植物10,或者衍生自子代转基因芦荟植物10 的种子或花粉。
[0027] 本文使用的"转基因芦荟植物"指一种基因组被稳定整合的重组DNA改变的芦荟 植物。一个转基因的芦荟植物10包括从一个原始转化的芦荟细胞再生的芦荟植物，以及来 自转化的芦荟植物10的后代或杂交的子代转基因芦荟植物。
[0028] 本文使用的"重组DNA"指经过基因工程改造并且在细胞外构建的DNA，包括含有 天然存在的DNA、cDNA、合成的DNA和/或其他DNA。
[0029] 本文使用的"启动子"指起始转录的调控DNA。"植物启动子"是能够起始芦荟细 胞中的转录的启动子，不管它是否来自于芦荟细胞，例如，众所周知农杆菌启动子在芦荟细 胞中起作用。因此，植物启动子包括从植物、植物病毒和细菌（例如农杆菌和短根瘤菌）获 得的启动子DNA。受发育控制的启动子的实例包括优先在在特定组织中起始转录的启动子， 所述组织例如叶、根或种子。这些启动子指的是"组织优选的"。仅仅在特定组织中起始转 录的启动子指的是"组织特异性的"。一种"细胞类型"特异性的启动子主要地驱动在一种 或多种器官中的特定细胞类型内的表达，例如在根或叶中的维管细胞。"可诱导的"或"可 抑制的"启动子是一种受环境控制的启动子。可能影响诱导型启动子转录的环境条件的实 例包括缺氧条件、或者特定的化学试剂、或者光的存在。组织特异性的、组织优选的、细胞类 型特异性的和诱导型的启动子构成"非组成型"启动子的类。"组成型的"启动子是一种在 大部分条件下有活性的启动子。所述启动子可能包含增强子或其他元件，所述其他元件影 响转录的起始、转录的起始位点、转录的水平、转录的末端位点或者所产生的核糖核酸的任 何的后处理。
[0030] 本文使用的术语"遗传构建体"被限定为一段包含人工排列的至少两个DNA片段 的DNA序列，所述DNA序列是为了产生一种转基因的芦荟植物。在一个具体的实施方案中， 一个片段是一个调控序列，并且另一个片段编码一种基因产物。
[0031] 本文使用的"有效连接（operably linked) "的意思是在一个DNA构建体中联合两 段或多段DNA片段，以至于一段的功能（如编码蛋白的DNA)被另一段调控（例如启动子、 终止序列等）。
[0032] 本文使用的术语"转录"被限定为从一个DNA模板生成一个RNA分子。
[0033] 本文使用的术语"翻译"被限定为从一个RNA模板生成一个多肽。
[0034] 本文使用的"表达的"指产生的，例如，当一个蛋白的对应的DNA被转录成mRNA时， 所述mRNA被翻译成一个蛋白，所述蛋白在植物细胞中表达。
[0035] 本发明可以提供表达各种目标蛋白的新转基因芦荟植物10、可以提供产生转基 因芦荟植物10的方法和组合物、可以提供从所述转基因芦荟植物10中提取蛋白的方法， 并且可以提供来自所述转基因芦荟植物10的组分与目标蛋白的新组合物。根据本发明 产生的目标蛋白可以包含一个分泌信号，以帮助所述蛋白在所述髓心18中或者在芦荟叶 12的髓心中蓄积。在一方面，这种蓄积可以至少部分地出现在转基因芦荟植物10的叶的 musalegenous 细胞中。
[0036] 所述髓心18或芦荟叶12的浆包含所述叶的组分，当从所述芦荟叶12提取所述组 分的时候，所述叶的组分通常至少部分地指的是"凝胶"。本文使用的"凝胶"将指所提取的 髓心18和其他相关物质，在从所述芦荟叶12中提取髓心18的时候所述相关物质伴随于所 述髓心18,而不管后续处理的程度。根据本发明的一个或多个方面，来自所述芦荟叶12的 凝胶可以有修饰组分。在一个具体方面，所述凝胶的组分可以被修饰为包含至少一种外源 性的蛋白组分，并被称为"蛋白修饰凝胶"。提取含有相关的目的蛋白的蛋白修饰凝胶可以 提供容易获得的蛋白和/或有效的蛋白分离的方法。根据本发明产生和/或提取的蛋白修 饰凝胶不需要进行蛋白提取就可以直接被应用。
[0037] 出于示例性目的，本发明的方面通常显示在图1至8中。本发明可以提供转基因 植物、组合物，以及通常可以被应用于百合家族的芦荟属的方法。典型地，对本发明的描述 参考了在物种中的应用，所述物种选自于芦荟（Aloe vera)(库拉索芦荟）、开普芦荟（Aloe ferox)、木立芦荟（Aloe arborescence)。所述芦荟属通常包括一组大的无莖、丛生、多质单 子叶植物。这些植物通常指用于本公开内容目的的芦荟植物10。
[0038] 芦荟植物产生的各种化合物已经被应用于药用目的。当存在于一种蛋白修饰凝胶 中的时候，这些化合物可以补充根据本发明的转基因的芦荟植物10的生物活性蛋白的药 学性质。图1显示转基因的芦荟植物10的芦荟叶12的横断面。所述转基因的芦荟植物10 的叶包含一种容易提取的凝胶状蛋白混合物、碳水化合物和所述凝胶中包含的水，所述凝 胶主要来自于髓心18。该凝胶状混合物主要位于芦